KR101740540B1 - 바실러스 서브틸리스 jp-5 균주 및 이의 용도 - Google Patents

바실러스 서브틸리스 jp-5 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈전분해능 및 효소활성이 우수하며, 바이오제닉 아민 생성이 적고 분해능을 가지면서 청국장 제조시 휘발성 암모니아와 아민 생성이 적은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) JP-5 (KACC92036P)균주 및 이를 포함하는 발효 식품을 제공하는데 있다. 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조방법, 상기 균주를 포함하는 발효 식품을 제공한다.

Description

바실러스 서브틸리스 JP-5 균주 및 이의 용도{Bacillus subtilis strain JP-5 and uses thereof}
본 발명은 바이오제닉 아민 분해능을 가지면서 혈전용해 및 효소 활성이 있는 바실러스 서브틸리스 JP-5 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해능을 가지면서 혈전용해 및 효소 활성이 우수하며, 청국장 제조시 휘발성 암모니아와 아민의 생산이 적은 바실러스 서브틸리스 JP-5 균주(KACC 92036P), 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조방법, 상기 균주를 포함하는 발효 식품에 관한 것이다.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 낫토, 청국장, 메주 등 전통적인 콩 발효 식품의 제조에 사용되는 발효균이다. 형상은 막대형이며 크기는 길이 방향으로 2 내지 3㎛ 정도이다. 산소를 좋아하는 호기성이며, 생장을 위한 최적의 pH는 6.0 내지 7.5이며, 37℃ 내지 40℃의 온도에서 잘 증식하는 내열성 균이다. 하지만 온도가 너무 높거나 자외선이 강하거나 수분이 부족하여 증식이 여의치 않을 경우에는 대사활동을 중지하고 휴면상태의 내생포자(Endospore)를 형성한다. 내생포자는 강한 내성을 갖고 있어 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)가 열, 과건조, 방사선, 화학물질, 독성물질 등에 노출된 나쁜 환경에서도 생존할 수 있게 해준다.
장류는 한국인의 식탁에 필수적인 부식으로서 식품으로 안전성 확보는 무엇보다도 중요한 과제이다. 장류에서 식품 안전을 좌우하는 주요 인자는 발효과정에서 생산되는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 같은 유해 미생물과 아플라톡신(aflatoxin) 및 바이오제닉 아민(biogenic amine)이 있다.
이 중에서 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 아미노산의 탈 탄산 작용, 아미노기 전이작용 등의 화학적 작용에 의해 주로 생성되는 질소화합물로서 단백질 함유 식품 내에서 미생물 또는 생화학적 활성에 의해 발생된다. 대표적인 바이오제닉 아민으로는 퓨트레신(putrescine), 히스타민 (histamine), 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine) 및 세로토닌(serotonin) 등이 있다.
바이오제닉 아민은 체내에서 신경전달 물질로 직·간접적으로 작용하고 혈압조절 및 혈류 등의 심혈관계질환에도 영향을 미치므로, 바이오제닉 아민 함유 식품의 섭취로 여러 가지 약리적인 현상이 나타날 수 있다.
그러나 인체의 분해 한도를 넘어서는 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등의 증상을 유발한다. 또한, 바이오제닉 아민에 의해 혈관 수축 및 심박 활동이 증가되어 혈압 상승을 유발하고, 동공과 눈꺼풀 조직을 확장시켜 눈물의 분비를 촉진하고, 타액의 과다분비, 호흡 증가 및 혈당 상승을 가져오며 편두통을 유발하기도 하는 것으로 보고되었다.
전통 장류의 발효 과정은 주로 바실러스(Bacillus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 유산균 및 효모들의 복합적인 대사 과정으로 이루어져 있다. 장류 제조는 프로테아제(proteases) 활성이 높은 바실러스와 아스퍼질러스 속으로 단백질 함량이 높은 콩을 가수분해하는 과정을 거치며, 적절한 증식 온도와 여러 미생물들의 상호 작용에 의한 발효가 이루어지기 때문에 바이오제닉 아민이 생산되기 적당한 조건이다.
2006년 국내 유통 발효 식품 중에 바이오제닉 아민 분포를 조사한 결과에 따르면, 한국인의 주 부식인 전통 된장에서 퓨트레신(putrescine)은 99.6∼1453.7 mg/kg(평균 462.6), 히스타민(histamine)은 260.1∼952 mg/kg(평균 569.4), 티라민(tyramine)은 284.7∼1430.7 mg/kg(평균 669.5), 카다베린(cadaverine)은 4.6~65.4 mg/kg(평균 23.5)으로 한국인들이 주로 섭취하는 34종의 식품 가운데 평균적으로 가장 높았다. 다음으로 멸치 젓갈, 시판 간장, 전통 간장, 현대식 된장 순이었다.
상기 결과는 바이오제닉 아민 함량이 가장 높은 식품 7종 중 4종이 장류라는 점과 한국인의 음식 섭취 특성상 젓갈보다 장류가 많다는 것을 고려하면 장류는 식품 섭취 시 바이오제닉 아민의 주공급원으로 건강에 위해를 줄 수 있는 수준임을 나타낸다.
따라서, 전통 장류의 지향점은 전통적인 장류의 맛과 풍미는 유지하되 발효 미생물 제어를 통한 식품 위생상의 안전성을 동시에 확보할 수 있어야 한다. 이를 위해 발효 동안 유해 균주들의 증식을 억제하며 바이오제닉 아민을 생산하지 않고 동시에 분해도 가능한 발효 균주의 선발은 필수적이다.
관련 선행기술로는 한국등록특허 10-1379230(장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 SCK B11 균주 및 이의 용도)과 한국공개특허 10-2015-0019435(바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 속 균주 및 이의 용도)가 있다.
본 발명의 목적은 혈전분해능 및 효소활성이 우수하며, 바이오제닉 아민 생성이 적고 분해능을 가지는 바실러스 서브틸리스 JP-5 균주 및 이를 포함하는 미생물 제제 및 청국장 제조시 휘발성 암모니아와 아민 생성이 적은 발효 식품을 제공하는데 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하며 기탁번호 KACC 92036P로 기탁된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주를 제공한다.
상기 균주는 혈전 분해능과 효소활성이 있는 것이 특징이다.
상기 효소는 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase)중 어느 하나 이상인 것이 특징이다.
상기 균주는 바이오제닉 아민중 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)중 어느 하나 이상을 생산하지 않는 것이 특징이다.
상기 균주는 바이오제닉 아민중 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine) 및 푸트레신(putrescine)중 어느 하나 이상 분해능이 있는 것이 특징이다.
상기 균주는 장류에서 발생하는 독소 유전자를 함유하고 있지 않는 것이 특징이다.
상기 독소 유전자는 Non-hemolytic enterotoxin의 유전자인 nheA, nheB, nheC, Hemolytic enterotoxin 유전자인 hblA, hblC, Cytotoxin K 유전자인 cytK 중 어느 하나 이상인 것이 특징이다.
또한 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주(KACC 92036P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
또한 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주(KACC 92036P)를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주(KACC 92036P)를 포함하는 발효 식품을 제공한다.
상기 발효 식품은 메주 또는 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 장류에서 선택된 어느 하나 이상인 것이 특징이다.
상기 발효 식품의 휘발성 암모니아 및 아민의 함량은 상기 균주를 포함하지 않는 발효 식품의 휘발성 암모니아 및 아민 함량 대비 더 낮게 나타나는 것이 특징이다.
본 발명에서는 전통 장류에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주가 바이오제닉 아민 분해능을 가지면서 혈전용해 및 효소 활성이 우수하며 청국장 제조시 휘발성 암모니아, 아민의 생산이 적은 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 발효식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 본 발명의 균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주의 아밀라아제(Amylase), 셀룰라아제(cellulase), 리파아제(lipase), 프로테아제(protease) 활성결과를 나타낸 도면이다.
(A) Amylase, (B)Cellulase, (C)Lipase, (D)Protease
도 2는 본 발명의 균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)JP-5 균주의 혈전용해술(thrombolysis)의 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 균주인 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) JP-5 균주의 B. cereus 독소 유전자의 유, 무를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하며 기탁번호 KACC 92036P로 기탁된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주를 제공한다.
상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주(KACC 92036P)는 전통 장류에서 분리하였으며, 바이오제닉 아민 분해능을 가지면서 혈전용해 및 효소 활성이 우수하며, 본 균주로 청국장 발효시 휘발성 암모니아와 아민 생성이 적다.
상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주(KACC 92036P)는 독소 유전자가 없고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으며, 바이오제닉 아민 분해능이 있는 균주이다. 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주를 국립농업과학원에 2015년 02월 11일자로 기탁하였다.(기탁번호:KACC 92036P)
본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주에서 생산하지 않는 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine) 또는 티라민(tyramine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주에서 분해능을 가지는 바이오제닉 아민은 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine) 또는 푸트레신(putrescine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 미생물의 아미노산 디카복실라제 작용에 의해 아미노산으로부터 형성되며, 인체의 분해 한도를 넘어서는 바이오제닉 아민을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등의 증상을 유발한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 균주에서 상기 효소는 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며, 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화 시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)JP-5 균주 를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조방법을 제공한다. 상기 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주를 배양하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주를 포함하는 발효 식품을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 발효 식품은 메주 또는 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 JP-5 균주를 이용한 발효 식품은 휘발성 암모니아 및 아민의 함량이 상기 균주를 포함하지 않는 발효 식품의 휘발성 암모니아 및 아민 함량 대비 낮게 나타난다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 본 발명의 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis )JP-5(KACC 92036P)균주의 분리 및 동정, 선발
전통발효방식으로 유명한 청국장 판매업체의 생 청국장을 수집한 후, 생 청국장에 0.85% 살린 버퍼(saline buffer)에 단계 희석한 다음, R2A agar과 Raka-Ray agar에 도말하여 분리한 다양한 균주들을 R2A agar 평판배지에서 28℃에서 1~2일간 배양하였다.
순수 분리된 균주들에 대하여 바이오제닉 아민 분해실험과 혈전분해능 실험 및 효소활성(amylase, cellulase, protease, lipase)실험과 독성유전자 유무 실험을 수행하여, 독소 유전자가 없고 바이오제닉 아민 분해능과 혈전 분해 활성 및 효소 활성이 있는 JP-5 균주를 선발하였다.
본 발명의 JP-5균주를 분류하기 위하여 다음과 같이 PCR을 이용하여 16S rRNA를 증폭하여 염기서열(서열번호1)을 결정하였다.
분리한 균주를 분류하기 위하여 다음과 같이 PCR을 이용하여 16S rRNA를 증폭하여 염기서열을 결정하였다. 16S rRNA 염기서열을 증폭하기 위하여 genomic DNA를 추출(DNA purification kit, Promega, USA)하여 Geno Tech Corp.(Genotech, Deajeon, Korea)사 에 의뢰하여 일반 세균용 프라이머(Universal PCR primer) 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';서열번호 2)와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT -3';서열번호 3)을 이용하여 염기서열을 분석하였다. 상기 실험을 통하여 얻은 16S rRNA sequence를 이용하여 Chunlab, Inc.에서 제공하는 Ezbiocloud(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)의 Blast Search 프로그램을 이용하여 분리균주와 등록균주의 상동성을 비교하였다. 또한 분리균주의 계통분류학적 위치를 알아보기 위하여 The National Center for Biotechnology Information(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 Advenced Blast Search프로그램을 통해 GeneBank에 등록된 유사균주의 염기서열을 이용해서 MegAlign 프로그램(DNA STAR Lagergene, version 8)과 Mega 6.0 프로그램의 근연접합법 (neighbor-joining method)을 사용하여 분석하였다.
JP-5 균주의 16S rRNA 시퀀스의 상동성을 비교한 결과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 유사성을 보였다. 본 발명의 균주를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5로 명명하고 국립농업과학원(농업유전자원센터;KACC)에 2015년 02월 11일자로 기탁하여 수탁번호 KACC 92036P를 부여받았다.
<실시예 2> 효소활성(enzyme activity) 분석
본 발명의 바실러스 서브틸리스 JP-5 균주의 효소활성을 검정하기 위하여 선발배지에서 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase)의 효소 활성과 혈전 분해능을 확인하였다.
- 아밀라아제 활성
R2A(Difco)에 아밀라아제(amylase) 생성 유도물질인 0.5% 가용성 전분(soluble starch)을 첨가한 평판배지를 제조하였다. 평판배지에 균주를 대치배양법으로 두 균주씩 접종한 다음 28℃에서 24시간 동안 배양 후, Gram's iodine 용액 (iodine crystal 1.0g, potassium iodine 0.2g, Distilled water 30ml)으로 배지를 염색 한 다음 starch 분해정도를 저지환(clear zone)을 통해 확인 하였다.
- 셀룰라아제 활성
0.4% CMC(carboxymethyl cellulose)를 첨가한 R2A배지를 제조하여 균을 대치배양법으로 접종시킨 후 28℃에서 24시간 배양 후, 0.1% congo red용액으로 염색하고 1M NaCl로 세척 후 저지환(clear zone)을 확인하였다.
- 프로테아제 활성
2% skim milk 와 3% agar를 멸균 후 섞어 배지를 제조 한 후, 균주를 대치 배양법으로 두 균주씩 접종하여 28℃에서 24시간동안 배양 후 저지환(clear zone)을 확인하였다.
- 리파아제 활성
R2A 아가(agar) 450 ml에 50 ml 혼합물[5 ml TBN(glycerol tributyrate), 1 ml 0.5 M CaCl2 ,2 ml 5 M NaCl, 2.5 g gum arabic(from acacia tree)]을 믹서를 이용하여 섞어 준 후 121℃에 15분간 고압증기멸균기를 이용하여 멸균 후 섞어 고체배지를 만들고 균을 대치배양법으로 접종하여 저지환(clear zone)을 확인하였다.
- 혈전 분해능
Fibrin plate method법을 변형하여 측정하였다. 0.5% 피브리노겐(fibrinogen; 0.067M sodium phosphate buffer포함)을 만든 후 37℃에서 30분간 완전히 녹인 후 트롬빈(thrombin)을 1%로 첨가하여 분주하였다. 굳은 배지에 균주를 접도 1은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주의 아밀라아제(Amylase)(도 1(A)), 셀룰라아제(cellulase)(도 1(B)), 리파아제(lipase)(도 1(C)), 프로테아제(protease)(도 1(D)) 활성결과를 나타낸 사진이다. 도 2는 피브린(fibrin) 플레이트 방법에 의해 본 발명의 균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)JP-5 균주의 혈전용해술(thrombolysis)의 결과를 보여준 사진으로 본 발명의 균주에서 가장 높은 혈전 분해능을 보였다.종하여 8시간 후 배지의 피브린(fibrin)의 용해성을 확인하였다.
상기의 실험 결과, 도 1과 표 1에서 보는 바와 같이 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5균주는 발효 관련효소인 아밀라아제, 셀룰라아제, 프로테아제, 리파아제의 활성이 높고, 대조 균주 KACC16479와 A에 비해 높은 혈전 분해능을 보였다.
JP-5의 효소 활성

Strain
Blast 		Enzyme activity
Amy. Cell. Pro. Lip. Fibrin.
JP-5 B. subtilis subsp. subtilis + + + + +
KACC16749 B. subtilis subsp. subtilis + + + + -
A B. subtilis subsp. subtilis + + + + (+)
Symbols : -; negative activity, (+); weak activity, +; positive activity, Amy.; amylase, Cell; cellulase, Pro.; protease, Lip.; lipase, Fibrin.; fibrinolysis KACC 16749, A: 비교 균주
<실시예 3> 바이오제닉 아민(biogenic amines) 생성능, 분해능 분석
본 발명의 바실러스 서브틸리스 JP-5의 바이오제닉 아민 생성능과 분해능을 분석 하였다.
- 바이오제닉 아민(biogenic amines) 생성능
0.5% 히스티딘(Histidine), 0.5% 티로신(tyrosine), 0.006% 크레솔 레드(cresol red)를 첨가한 pH 5.3 Nutrient agar medium [Nutrient Broth(Difco, USA), Bacto agar, destiled water]에 균주를 접종하여 28℃에서 24시간 후 합성배지색의 변화를 확인하였다.
- 바이오제닉 아민 ( biogenic amines) 분해능 분석
바이오제닉 아민 첨가 최소영양배지(0.1% tyramine, 0.05% cadaverine, 0.05% putrecine, 0.2% KH2PO4, 0.1% NaCl, 0.01% MgSO4, 1.2% agar, pH 7.0)에 균주를 접종하여 28℃에서 24시간 후 콜로니를 관찰하였다.
히스타민(histamine)과 티라민(tyramine)생성능과 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 푸트레신(putrecine) 분해능을 알아보기 위하여 합성배지에 균주를 접종하여 28℃에서 24시간 후 콜로니를 관찰한 결과 대조균주 바실러스 서브틸리스 KACC16749, 바실러스 서브틸리스 A 두 군 모두 히스타민(histamine)과 티라민(tyramine)을 생산하였지만 JP-5균주는 히스타민(histamine), 티라민(tyramine)을 생성하지 않았고, 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 푸트레신(putrecine)의 분해능을 보였다(표 2).
JP-5의 아민 생성능과 분해능

Strain
Blast 		Biogenic amine
Production Degradation
JP-5 B. subtilis subsp. subtilis - +
KACC16749 B. subtilis subsp. subtilis + -
A B. subtilis subsp. subtilis + +
Symbols : -; negative activity, (+); weak activity, +; positive activity.
<실시예 4> 바실러스 세레우스 ( B. cereus )독소 유전자 유무 확인
본 발명의 바실러스 서브틸리스 JP-5 균주의 안전성을 확보하기 위하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 의 설사독소 유전자 6개와 설사독소발현 전사조절 유전자 1개, 총 7개의 유전자의 유무를 PCR을 이용하여 확인하였다. 대조균주는 KACC에서 분양 받은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 표준균주(KACC 11204)를 이용하였다.
본 실험에 사용한 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)의 독소유전자는 하기 표 3에 언급되어 있듯이, Non-hemolytic enterotoxin의 유전자 3종(nheA; nheB; nheC), Hemolytic enterotoxin 유전자 2종(hblA; hblC), Cytotoxin K 유전자(cytK), 설사독소발현 전사조절 단백질인 phospholipase C regulatory protein 의 유전자(plcRpapR)이며, PCR의 조건은 94℃에서 2분간 초기변성 후, 94℃ 1분간 변성, 56℃,58℃,62℃(프라이머 별로 상이, 표 3 참고) 1분간 결합, 72℃ 1분간 증폭과정을 30회 반복 하고 마지막으로 72℃에서 5분간 증폭을 실시하였다.
바실러스 세레우스 독성유전자 sequence 및 결합온도.
Primer pair Sequence Target sequence
(GeneBank accession no.)		 Size
(bp)		 Annealing temp.
nheAF ATATGCGCAAAATGTAATTGCTCCA
(서열번호 4)		 Non-hemolytic enterotoxin,
nheA(AY835995) 		935
 56
nheAR TGCCTTCTTCAACATTTGTTTGAATTT
(서열번호 5)
nheBF GACCAGCAGGATTCCCAGATGTAAT
(서열번호 6)		 Non-hemolytic enterotoxin,
nheB(AY835995) 		972
 62
nheBR CCACGCCTTCATGTAATTTTTCTGT
(서열번호 7)
nheCF ACCAGTAGCGACTTTTGCAAGTGAA
(서열번호 8)		 Non-hemolytic enterotoxin,
nheC(AY835995)
930
 62
nheCR TTTTGAGCTGCATTCTCAATATGCC
(서열번호 9)
hblAF ACCAGTAGCGACTTTTGCAAGTGAA
(서열번호 10)		 Hemolytic enterotoxin,
hblA(AY822584)
909
 56
hblAF TTTTGAGCTGCATTCTCAATATGCC
(서열번호 11)
hblCF ATCAATACTCTCGCAACACCAACTG
(서열번호 12)		 Hemolytic enterotoxin,
hblC(AY822584)
957
 62
hblCR ATGTGCTCGTTGCTCTGCTGTTAAT
(서열번호 13)
cytKF CCGCTGTTTTTGCTAGTAGTGCTGT
(서열번호 14)		 Cytotoxin K,
cytK (DQ019311)

 901
 58
cytKR ACGTCTTTTACGTTGTTTCCAACCC
(서열번호 15)
plcRF CRGGYGCRGTATACCCAAGT
(서열번호 16)		 Phospholipase C regulatory protein, (plcRpapR (58) 888
 58
plcRR TGAAATACCCCATGYCATYG
(서열번호 17)
바실러스 서브틸리스 JP-5는 바실러스 세레우스와 계통학적으로 가까울 뿐만 아니라 균주를 접종하는 방법이 아닌 전통발효방법으로 제조한 청국장에서 분리된 균주이므로, 바실러스 세레우스 독소유전자의 유무를 확인함으로서 실험균주의 안전성을 확보하고자 하였다. 실험결과 도 3에서 보는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 JP-5 균주는 바실러스 세레우스의 설사독소 유전자 6개와 설사독소발현 전사조절 유전자 1개의 유전자를 가지고 있지 않았다.
<실시예 5> 휘발성 아민 및 암모니아 측정
바실러스 서브틸리스 JP-5를 이용하여 발효한 청국장의 휘발성 암모니아와 아민을 측정하기 위하여, 먼저 바실러스 서브틸리스 JP-5를 이용하여 발효한 청국장을 제조하였다. 바실러스 서브틸리스 KACC16749 와 바실러스 서브틸리스 A를 대조 균주로 이용하였다. 수세한 국내산 대두에 1.5배의 물을 넣고 121℃에서 20분 동안 증자시켰다. 품온 40℃를 유지시킨 10 g의 삶은 콩에 250 ㎕ 각각의 균주 배양액(1x109 CFU/ml)을 혼합하여 40℃에서 72시간 배양 하여 각 균주를 이용한 청국장을 제조하였다. 청국장을 실리콘 용기에 옮긴 후, 1분간 진탕, 5분 대기 후, 검지관식 기체 측정기(GASTEC, GV-100S, Japan)를 이용하여 실리콘 용기 내부 기체 50 ml 중 암모니아와 아민의 함량을 측정 하였다. 이때, 암모니아 검지관(Ammonia; NH3, No.3L,Japan)과 아민 검지관(Amines(Methylamine);RㅇNH2 No.180, Japan)을 이용하였다.
상기 측정 결과 표 4에 나타낸 바와 같이 50 ml의 기체 중 바실러스 서브틸리스 JP-5는 6.3 ppm 암모니아 와 12.6 ppm 아민이 확인되었으며 이는 대조균주인 바실러스 서브틸리스 KACC16749, 바실러스 서브틸리스 A보다 낮은 수치임이 확인되었다.

Strain
Blast 		ppm/50 ml
Ammonia Amines
JP-5 B. subtilis subsp. subtilis 6.3±1.5 12.6±6.4
KACC16749 B. subtilis subsp. subtilis 6.5±1.3 13±3
A B. subtilis subsp. subtilis >35 >120
Symbols :(+); weak activity, +; positive activity, >; excess
이상, 상기 결과를 토대로 본 발명은 혈전분해능 및 효소활성이 우수하며, 바이오제닉 아민 생성이 적고 분해능을 가지면서 청국장 제조시 휘발성 암모니아와 아민 생성이 적은 바실러스 서브틸리스 JP-5 균주 및 이를 포함하는 발효 식품을 제공할 수 있다.
한국농업미생물자원센터 KACC92036P 20150311
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Bacillus subtilis strain JP-5 and uses thereof <130> P2015-0039 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1484 <212> RNA <213> Bacillus subtilis JP-5 <400> 1 tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt 60 gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg 120 ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ttgaaccgca tggttcaaac 180 ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg 240 aggtaacggc tcaccaaggc aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact 300 gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg 360 acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct 420 gttgttaggg aagaacaagt accgttcgaa tagggcggta ccttgacggt acctaaccag 480 aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540 ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg 600 gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa 660 ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact 720 ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 780 ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg 840 ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 900 ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960 gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg 1020 gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080 cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg 1140 actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200 cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag 1260 ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct 1320 ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380 caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta accttttagg 1440 agccagccgc cgaaggtggg acagatgatt ggggtgaagt cgta 1484

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 포함하며 혈전 분해능과 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase) 중 어느 하나 이상의 효소활성이 있고,
    바이오제닉 아민 중 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine) 중 어느 하나 이상 생산하지 않으면서, 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine) 및 푸트레신(putrescine) 중 어느 하나 이상 분해능을 가지며,
    Non-hemolytic enterotoxin의 유전자인 nheA, nheB, nheC, Hemolytic enterotoxin 유전자인 hblA, hblC, Cytotoxin K 유전자인 cytK 중 어느 하나의 독소 유전자를 함유하고 있지 않는 것을 특징으로 하는 기탁번호 KACC 92036P로 기탁된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주(KACC92036P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제.
  9. 제 1항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주(KACC92036P)를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조방법.
  10. 제 1항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주(KACC92036P)를 포함하는 발효 식품.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 발효 식품은 메주 또는 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 장류에서 선택된 어느 하나 이상인 발효 식품.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 발효 식품의 휘발성 암모니아 및 아민의 함량은 상기 균주를 포함하지 않는 발효 식품의 휘발성 암모니아 및 아민 함량 대비 더 낮게 나타나는 발효 식품.

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