KR20140123847A - 전통장류에서 분리한 알파글루코시다아제 저해능을 갖는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 agi-63 균주 및 이의 용도 - Google Patents
전통장류에서 분리한 알파글루코시다아제 저해능을 갖는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 agi-63 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 알파글루코시다아제 저해능을 가지는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 청국장 발효용 조성물, 상기 균주를 증자된 대두에 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 청국장의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 청국장에 관한 것으로, 본 발명에 따른 균주의 이용은 소비자들의 건강에 유익할 뿐만 아니라 특유의 맛을 형성함으로써, 청국장에 대한 소비자의 선호도를 증진시킬 수 있으며, 더 나아가 당뇨환자 및 내당능장애인 등의 혈당 조절에 유용할 수 있다.
Description
본 발명은 전통장류에서 분리한 알파글루코시다아제 저해능을 갖는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알파글루코시다아제(α-glucosidase) 저해능을 가지는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63(Bacillus amyloliquefaciens AGI-63) 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 청국장 발효용 조성물, 상기 균주를 증자된 대두에 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 청국장의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 청국장에 관한 것이다.
청국장은 콩을 원료로 한 우리나라의 대표적인 발효식품으로 간장, 된장, 고추장 등과 함께 오늘날까지 상용되어 온 전통 장류인데 된장보다 콩 단백질과 지방질 함량이 높고 소화 흡수율 또한 높다. 또한 발효과정에서 강력한 소화효소인 아밀라제, 프로테아제 등이 생성되어 삶은 콩의 소화율이 50∼70% 정도인데 반하여 청국장은 90∼92%나 되어 소화 및 흡수가 잘 돼 소화제 역할도 한다.
청국장은 삶은 콩을 적정 온도에서 발효시켜 콩 단백질을 분해시킨 전통식품으로서 주로 가을에서 초봄까지 만들어 먹는 장류에 속한다. 청국장을 발효시키는 미생물은 주로 고초균으로, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 등이 있으며, 특히 청국장은 발효 식품 중 발효기간(2~3일)이 가장 짧은 전통 장류식품이다. 따라서 그 풍미의 독특성을 제외하고 발효식품 중에서 가장 쉽고, 간편한 가공뿐만 아니라 영양적, 경제적으로도 가장 효과적인 콩의 섭취 방법으로 인정된다.
한편, 당뇨병의 치료에 주로 사용되는 경구용 혈당강하제 약제의 분류는 작용 기전에 따라 설폰요소제(sulfonylureas and repaglinide), 바이구아나이드제(biguanides), 알파글루코시다아제 억제제(α-glucosidase inhibitors) 및 티아졸리딘다이온제(thiazolidinediones)로 크게 구분된다.
알파글루코시다아제 억제제는 음식물 중의 소당류와 이당류의 분해 속도를 감소시킴으로써 식후 혈당의 급속한 상승과 그에 따른 혈액 내의 인슐린 반응을 감소시킨다. 이 중, 최근에 사용되고 있는 알파글루코시다아제 억제제인 아카보스(acarbose)는 방사선균목(Actinomycetales)을 배양한 후 여과하여 얻어진 2차 대사 산물로 만들어진 약물로서 소장 점막의 융모에서 음식물을 소당류와 이당류로 분해시키는 글루코시다아제(말타아제, 이소말타아제, 수크라아제, 글루코아밀라아제 등)의 기능을 완화시키고 전분과 같은 탄수화물의 가수분해를 지연시켜 식후 혈당치의 상승을 막아준다. 또한, 아카보스는 포도당의 흡수를 느리게 하여 당뇨병 환자에게서 문제가 되고 있는 식후의 고혈당과 고인슐린 혈증을 개선하는 것으로도 보고되어 있다. 그러나, 기존의 알파글루코시다아제 억제제는 아밀라아제 억제능을 보유하고 있어 아밀라아제의 활성도 함께 억제함으로써 고분자인 전분질의 분해가 원활히 일어나지 않아, 복부팽만감, 불쾌감, 설사 등의 소화기 부작용이 수반되므로 소량씩 천천히 복용량을 증가시켜야 하는 단점이 있다. 또한, 비슷한 작용기작을 가지고 있는 제제로서 보글리보스(voglibose)가 약품으로 출시되었으나(Basen®) 경구투여시 많은 양이 체내로 흡수되기 때문에 간이나 근육조직에서의 글리코겐 대사 및 글리코프로테인의 생합성 저해의 위험성이 남아 있다.
알파글루코시다아제 저해제의 제조방법과 관련하여, 각종 식물로부터 추출하는 방법, 각종 미생물을 이용한 발효생산법, 효소 합성법 등이 알려져 있다. 이 중, 식물체에서 추출하는 방법이 가장 연구가 진척되어 있어, 현재까지 알려진 폴리하이드록실레이티드 알칼로이드의 대부분은 식물에서 추출된 것들이다. 그러나, 식물로부터의 추출방법은 저해제의 함량이 적고, 여러 가지 유사한 물질들이 많이 함유되어 있기 때문에 분리·정제 과정이 복잡한 문제점이 있으며, 효소를 이용한 합성 방법도 단계가 복잡하고 많은 양의 합성 관련 화학물질이 필요하기 때문에 경제성이 떨어지는 단점이 있다. 이에 비해, 미생물 발효를 이용한 저해제 생산법은 생산 공정이나 정제과정의 간소화가 가능하여 경제적인 측면에서 유리한 이점이 있다.
한편, 한국등록특허 제0864850호에는 '혈전용해효소 및 점질물 생산력이 우수한 바실러스 서브릴리스 HA, 이를 이용한 청국장 제조 방법 및 이에 의해 제조된 청국장'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1196338에는 '비타민 K2 생성능이 높은 바실러스 아미로리퀴파시엔스 균주'가 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이, 전통장류에서 분리한 알파글루코시다아제 저해능을 갖는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 전통장류로부터 균주를 분리하고, 분리한 균주들 중에서 특히 알파글루코시다아제 저해 활성이 높은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주를 선발·동정하였다. 상기 동정한 균주를 접종하여 발효시킨 청국장은 알파글루코시다아제 저해능이 우수할 뿐만 아니라, 청국장의 특유의 맛을 형성할 수 있는 아미노태 질소 함량 및 유리 아미노산 함량이 증진된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 알파글루코시다아제 저해능을 가지는, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 청국장 발효용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주를 증자된 대두에 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 청국장의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 청국장을 제공한다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주를 이용하여 제조한 발효 청국장의 경우, 알파글루코시다아제 저해 활성이 높을 뿐만 아니라 청국장 특유의 맛을 형성할 수 있는 아미노태 질소 함량 및 유리 아미노산 함량이 증진된 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 균주의 이용은 소비자들의 건강에 유익할 뿐만 아니라 특유의 맛을 형성함으로써, 청국장에 대한 소비자의 선호도를 증진시킬 수 있으며, 더 나아가 당뇨환자 및 내당능장애인 등의 혈당 조절에 유용할 수 있다.
도 1은 알파글루코시다아제 저해 활성을 가지는 균주 계통의 프로테아제 활성을 분석한 결과이다.
도 2는 전통장류로부터 분리한 단일 균주 계통의 말타아제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주의 계통수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주를 이용한 청국장의 제조과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주를 이용하여 제조한 청국장의 알파글루코시다아제 저해 활성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 전통장류로부터 분리한 단일 균주 계통의 말타아제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주의 계통수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주를 이용한 청국장의 제조과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주를 이용하여 제조한 청국장의 알파글루코시다아제 저해 활성 변화를 나타낸 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알파글루코시다아제(α-glucosidase) 저해능을 가지는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63(Bacillus amyloliquefaciens AGI-63) 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 알파글루코시다아제 저해 활성을 가지는 균주는 순창군 민속마을에서 생산되는 고추장, 간장, 된장 및 청국장 등을 시료로 이용하여 분리하였으며, 상기 분리된 균주들 중에서 알파글루코시다아제 저해 활성이 가장 높은 균주인 AGI-63 균주를 분리하였다.
상기 분리된 AGI-63 균주의 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열분석을 실시한 결과, 본 발명의 AGI-63 균주는 도 3에 나타낸 바와 같이 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 BCL9 균주(Genebank No. JQ734537)와 가장 높은 유사도를 나타냈고, 알파글루코시다아제 저해 활성이 높으며, 말타아제 저해 활성을 동시에 가지고 있어 상기 AGI-63 균주를 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주라 명명하였다.
본 발명의 균주 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63를 한국미생물보존센터에 2013년 3월 29일자로 기탁하였다 (기탁번호: KCCM11407P).
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 청국장 발효용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 증자된 대두에 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 청국장 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 청국장을 제공한다.
본 발명의 균주를 이용하여 청국장을 제조하는 방법은 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 청국장 제조 방법은 대두를 20~28시간 침지하는 단계; 상기 침지시킨 대두를 110~130℃에 20~40분간 증자시키는 단계; 증자된 대두에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주를 접종하는 단계; 및 상기 접종된 대두를 35~40℃에서 45~50시간 발효시키는 단계를 포함할 수 있고, 바람직하게는 대두를 24시간 침지하는 단계; 상기 침지시킨 대두를 121℃에 30분간 증자시키는 단계; 증자된 대두에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주를 접종하는 단계; 및 상기 접종된 대두를 37℃에서 48시간 발효시키는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 청국장 제조 방법은 상기 대두 또는 검정콩을 증자한 후에 콩 파쇄물 또는 탈지대두미세분말을 상기 대두 또는 검정콩에 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 혼합물에 대하여 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주를 접종할 수 있다.
본 발명에서 "청국장 발효용 조성물"이란 발효 청국장을 제조함에 있어서, 증자된 콩에 균, 바람직하게는 납두균, 더욱 바람직하게는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주를 접종시키기 위해 첨가되는 것을 말한다.
본 발명의 균주를 이용하여 제조한 발효청국장은 바람직하게는 증자된 콩에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 접종하고 발효시켜 제조한 것일 수 있다.
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 이용하여 제조한 발효청국장의 발효는 35~40℃에서 45~50시간 수행하는 것일 수 있고, 바람직하게는 37℃에서 48시간 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발효시간이 24시간 미만인 경우에는, 발효청국장의 생리활성물질의 양이 충분하지 못하므로 부적합하며, 상기 발효시간이 50시간을 초과할 경우 청국장 제조에 과다한 시간이 소요되어 경제성이 낮으며, 이취가 증가하여 관능에 좋지 않은 영향을 미치는 문제점이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
재료 및 시약
순창군 민속마을에서 생산되는 고추장, 간장, 된장, 청국장 등을 구입하여 시료로 사용하였다. 알파글루코시다아제는 사카로마이세스(Saccharomyces; 시그마사) 기원의 것을 구입하여 사용하였으며, 그 밖의 시약은 시판 특급시약을 사용하였다. 균주의 알파글루코시다아제 저해 활성 측정시 표준 균주로는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KCCM 40764 및 바실러스 서브틸리스 KCCM 11314를 사용하였으며, 양성 대조구로는 아카보스(2.5㎍/g)를 사용하였다.
균주 분리
각 장류 1g을 멸균 증류수 10㎖에 희석하여 균질화시킨 후 순차적으로 희석하고, 희석액을 NA(Nutrient Agar media, Difco) 평판배지에 도말하고, 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 배양 후 균 집락을 형성하는 균체를 분리하였다. 균주는 단일 집락분리(single colony isolation)를 통하여 단일 균주임을 확인한 후 30% 글리세롤 스탁(stock)하여 -20℃에 보관하면서 필요시 꺼내어 사용하였다.
알파글루코시다아제
(α-
glucosidase
) 저해 활성 측정
각각의 균주들은 TSB(Tryptic Soy Broth media, Difco) 배지 25㎖에 37℃, 150rpm으로 5일간 진탕 배양하였고, 100℃에서 배양액을 5분간 열처리한 후 10분간 9,200×g로 원심분리하여 얻어진 상등액을 알파글루코시다아제 저해 활성의 검토를 위한 시료로 사용하였다.
알파글루코시다아제 저해능은 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 즉, 시료 50㎕에 0.5U/㎖ 알파글루코시다아제 효소액 50㎕(0.1M PBS, pH 6.8)를 혼합하여 37℃에서 10분 동안 전배양(pre-incubation)하였다. 3mM ρ-NPG (ρ-니트로-페닐-α-글루코피라노사이드, 0.1M PBS, pH 6.8) 100㎕를 가한 후 37℃에서 10분간 반응시킨 후 0.1M Na2CO3 100㎕를 가하여 반응을 정지시켰다. 이때 생성된 ρ-니트로페놀의 양을 분광광도계를 사용하여 흡광도 405nm에서 측정하였다. 이때 대조구는 배양액 대신 0.1M PBS(pH6.8)을 사용하였으며, blank로는 균주 배양액 및 효소액 대신 0.1M PBS(pH6.8)을 사용하였다.
말타아제 저해능은 다음과 같은 방법으로 측정했다. 돼지 소장으로부터 분리한 효소 추출액을 0.1 M PBS(pH 6.8)에 1mg/㎖가 되도록 용해시킨 후, 이 용액 100㎕에 10 mM 말타아제 400㎕, 각 균주들의 열처리된 배양상등액 200㎕를 가하여 37℃에서 45분간 반응시킨 후 90℃에서 5분간 열처리로 반응을 정지시켰다. 이 반응액을 TLC 플레이트(Merck, Silica gel F254)에 10㎕씩 점적하여 부타놀-프로파노-아세트산-물(5:3:3:1.5, v/v/v/v) 혼합용매를 통해 전개한 후 아닐린-디페닐아민 시약으로 발색하여 글루코오스의 생성 정도에 따라 알파글루코시다아제 효소원 내에 존재하는 알파글루코시다아제 중에서 말타아제 저해능이 우수한 균주를 선발하였다.
분리된 균주의 프로테아제 활성 확인
스킴밀크 2.0% (아가 1.5%)를 첨가한 선택배지에 4℃에 20분 동안 13,000rpm으로 원심분리한 분리 균주의 배양 상등액을 선택배지 상에 멸균된 옐로우팁을 이용하여 구멍을 만들고 만들어진 구멍에 배양 상등액을 100㎕을 로딩하였다. 이를 UV에서 30분간 살균 후 37에서 24시간 동안 배양한 후 투명환(clear zone)의 형성 여부를 관찰하였다.
분리된 균주의 특성 조사
선발된 균주의 최적 배양 온도를 확립하기 위해 TSB(Tryptic Soy Broth media, Difco) 배지에 접종하여 30, 40, 50, 60 및 70℃에서 250rpm으로 배양하여 성장을 관찰하였다. 선발된 균주의 최적 염도를 확립하기 위해 염도 0, 5, 7, 10 및 15%를 처리한 TSB 배지에 접종하여 배양하여 성장을 관찰하였다.
분리된 균주의 생화학적 특성
균주의 카탈라아제 분비 여부를 확인하기 위해 베니트 슬랜트(bennet slant)에 접종하여 37℃에 1일간 배양 후 3% 과산화수소를 몇 방울 뿌려 거품 생성 여부를 확인하였다.
산화효소(Oxidase) 분비 여부를 확인하기 위해 균주를 NA 배지에 도말하여 37℃에서 1일간 배양한 후 산화효소 시험 시약을 부어 균주의 변화를 관찰하였다.
또한, 임빅 시험(IMVIC test)을 수행하였는데, 인돌(Indol) 분비 분석을 위해서는 TSB(Tryptic Soy Broth media, Difco) 배지에 전배양한 균주를 1% 트립톤 배지에 접종하여 37℃에서 2일간 120rpm으로 배양한 후 코박(Kovac's) 시약을 첨가하여 혼합한 뒤 배지의 발색 여부를 관찰하였다. 메틸 레드(Methyl red) 시험은 TSB 배지에 전배양한 균주를 MR-VP 배지에 두 백금이 접종하여 37℃에서 2일간 120rpm으로 배양한 후 메틸 레드 시약을 5방울 첨가하여 혼합한 뒤 배지의 변화를 관찰하였다. 보게스 프로스카우에르 시험(Voges-Proskauer test, 부탄다이올 발효)은 TSB 배지에 전배양한 균주를 MR-VP 배지에 두 백금이 접종하여 37℃에서 2일간 120rpm으로 배양한 후 Barritt's 시약을 첨가하여 혼합한 뒤 색의 변화를 관찰하였다. 구연산(Citrate) 이용 시험은 시몬스 구연산 아가(Simmon's citrate agar: 시그마사)에 균을 접종하여 37℃ 2일간 배양 후 배지의 색 변화를 확인하였다.
가수분해 정도를 시험하기 위해, 먼저 전분의 가수분해 정도는 균주 분리용 배지에 전분 1.5%를 첨가한 선택배지((NB agar)에 미생물을 접종하여 최적온도에서 24시간 동안 배양한 후 루골액 염색을 통하여 할로 형성 여부를 관찰하였다. 스킴 밀크의 가수분해 정도는 기질로 사용되는 스킴 밀크 2.0%를 첨가한 선택배지(NB agar)에 미생물을 접종하여 최적온도에서 24~48시간 배양한 후 콜로니 주변에 투명환(clear zone)의 형성 여부를 관찰하였다. CMC 가수분해는 균주 분리용 배지에 카르복실메틸셀룰로오스(carboxylmethylcellulose: CMC) 1.5%를 첨가한 선택배지(NB) 에 미생물을 접종하여 최적온도에서 24~48시간 동안 배양한 후 0.5% 콩고 레드 용액으로 30분 동안 염색하고 1M NaCl 용액으로 30분 탈색하여 콜로니 주변에 투명환(clear zone)의 형성 여부를 관찰하였다. 리파아제 분해는 기질로 사용되는 트리부티린(TBN) 1%를 첨가한 선택배지(NB agar)에 첨가한 후 워어링 혼합기로 균질화하여 만든 선택배지에 미생물을 접종하여 최적온도에서 24~48시간 동안 배양한 후 콜로니 주변에 투명환(clear zone)의 형성 여부를 관찰하였다.
균주의 동정
API CHB 동정 키트(biomeriux, 프랑스)를 사용하여 조사하였고, 16S rRNA 염기서열분석 및 BLAST 시험을 외부 기관(솔젠트)에 의뢰 후 실시하여 동정결과를 도출했다.
청국장 제조
청국장 제조는 순창군에서 재배되는 백태를 구입하여 재료로 사용하였으며, 본 발명에서 분리된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63(Bacillus amyloliquefaciens AGI-63) 균주를 종균으로 도 4와 같은 과정을 통하여 청국장을 제조하였다.
청국장의
알파글루코시다아제
저해 활성 측정
0시간, 24시간 및 48시간 동안 발효한 청국장을 채취하여 동결건조시킨 후 시료로 사용하였다. 시료 3g에 10배의 70% 에탄올을 넣어 20℃에서 10시간 동안 250rpm으로 추출하였다. 4℃에서 15분 동안 4500rpm으로 원심 분리하여 상등액을 사용하였다. 알파글루코시다아제 저해 활성은 상기와 동일한 방법으로 진행하였다.
청국장의
아미노태
질소 함량 측정
청국장의 아미노태 질소 함량 측정은 포몰 적정법으로 시험하였으며 방법은 다음과 같다. 시료 2g에 증류수 100㎖를 가한 다음 0.1 N NaOH를 가하여 pH를 8.4로 조정한 후 중성 포르말린 용액 20㎖을 가하고 다시 0.1N NaOH 용액으로 pH 8.4가 될 때까지 조정하고 아미노태 질소 함량을 구하였다.
청국장의 유리 아미노산 측정
유리 아미노산은 시료 2g을 취하여 3차 증류수 30㎖를 넣고 교반한 후 50㎖로 정용하고 초음파를 이용하여 20분간 추출한 후 10분 동안 3000rpm으로 원심분리한 다음 상등액 2㎖에 5% TCA 2㎖를 넣은 후 10분 동안 10,000rpm으로 원심분리한 후 상등액을 취하여 0.02N-HCl로 희석한 후 0.2 시린지 필터에 통과시킨 후 표 1의 분석조건으로 아미노산 분석기로 분석하였다.
| 측정기기 | 아미노산 분석기 (Hitachi L-8900) |
| 검출기 | UV/Vis (440nm-570nm) |
| 컬럼 | Hitachi 4.6×60mm (세퍼레이션 필터) Hitachi 4.6×40mm(암모니아 필터) |
| 버퍼유속 | 0.40㎖/분 |
| 닌히드린 유속 | 0.35㎖/분 |
| 온도 | 50℃ |
| 접종량 | 20㎕ |
| 이동상 | 버퍼세트 (PH-SET KANTO) |
실시예
1. 청국장 발효균주의 분리 및 동정
1-1. 청국장 발효균주의 분리 및
알파글루코시다아제
저해능이
우수한 균주 계통 선발
순창군 전통 민속마을에서 생산되는 된장, 간장, 고추장, 청국장 등에서 분리한 균주는 총 136계통이 분리되었다. 이들 균주의 알파글루코시다아제 저해 활성을 측정한 결과는 표 2와 같다. 분리한 균주 중 45계통은 알파글루코시다아제 저해 활성이 없는 것을 확인하였으며, 나머지 91계통은 1.01~57.5%의 알파글루코시다아제 저해 활성을 나타내었다. 이 중 12계통은 10% 이상의 알파글루코시다아제 저해 활성을 보였으며, 이 중 63번 계통이 57.35%로 가장 높은 활성을 나타내었다. 표준균주로 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KCCM 40764와 바실러스 서브틸리스 KCCM 11314를, 양성 대조구로는 아카보스(2.5/g)를 사용하였다. 63번 계통의 경우, 청국장 발효용 균주 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KCCM 40764와 바실러스 서브틸리스 KCCM 11314보다도 대략 2배 정도 활성이 높았고, 알파글루코시다아제 억제제인 아카보스보다도 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
| 균주계통 | 저해율(%) | 균주계통 | 저해율 (%) |
균주계통 | 저해율 (%) |
균주계통 | 저해율 (%) |
| 1 | -1.52 | 41 | 2.76 | 81 | 7.53 | 121 | 10.54 |
| 2 | 14.03 | 42 | 9.95 | 82 | 9.32 | 122 | 14.36 |
| 3 | 11.69 | 43 | -15.62 | 83 | -9.63 | 123 | -14.45 |
| 4 | -10.52 | 44 | -3.2 | 84 | -10.32 | 124 | -15.55 |
| 5 | -2.52 | 45 | 2.63 | 85 | 1.15 | 125 | -12.47 |
| 6 | 1.23 | 46 | 3.58 | 86 | -1.35 | 126 | 7.16 |
| 7 | 1.01 | 47 | 8.81 | 87 | -2.35 | 127 | 2.77 |
| 8 | 6.96 | 48 | 6.64 | 88 | 3.56 | 128 | 6.54 |
| 9 | 9.52 | 49 | -9.52 | 89 | 4.52 | 129 | 2.26 |
| 10 | 7.54 | 50 | -5.21 | 90 | 3.62 | 130 | -0.13 |
| 11 | 1.23 | 51 | 2.30 | 91 | 7.81 | 131 | 6.28 |
| 12 | 12.52 | 52 | 5.24 | 92 | -15.26 | 132 | 1.13 |
| 13 | -1.23 | 53 | -3.85 | 93 | -2.1 | 133 | 6.26 |
| 14 | -6.15 | 54 | -3.21 | 94 | -5.23 | 134 | 9.93 |
| 15 | -7.73 | 55 | 12.1 | 95 | -2.11 | 135 | -1.36 |
| 16 | -0.23 | 56 | 1.53 | 96 | 2.31 | 136 | 1.64 |
| 17 | -0.12 | 57 | 0.23 | 97 | 4.52 | STD1 | 23.21 |
| 18 | 6.25 | 58 | 6.96 | 98 | 5.23 | STD2 | 32.80 |
| 19 | 2.52 | 59 | 0.35 | 99 | 2.35 | Acarbose | 49.98 |
| 20 | 2.74 | 60 | 0.13 | 100 | 3.52 | ||
| 21 | 2.56 | 61 | 9.65 | 101 | -6.16 | ||
| 22 | 2.62 | 62 | 5.26 | 102 | -7.74 | ||
| 23 | 2.73 | 63 | 57.35 | 103 | -1.62 | ||
| 24 | 0.19 | 64 | 19.30 | 104 | 7.57 | ||
| 25 | 2.62 | 65 | 1.63 | 105 | -5.15 | ||
| 26 | 2.74 | 66 | 3.63 | 106 | -0.97 | ||
| 27 | -1.02 | 67 | 4.85 | 107 | -0.29 | ||
| 28 | 10.12 | 68 | -6.98 | 108 | -1.62 | ||
| 29 | -0.98 | 69 | -7.89 | 109 | -0.16 | ||
| 30 | -0.74 | 70 | -3.62 | 110 | -1.67 | ||
| 31 | 3.21 | 71 | -7.85 | 111 | -18.09 | ||
| 32 | 4.21 | 72 | 2.56 | 112 | -5.97 | ||
| 33 | 1.23 | 73 | 10.32 | 113 | 3.92 | ||
| 34 | 8.82 | 74 | 9.62 | 114 | 2.70 | ||
| 35 | 8.64 | 75 | 7.15 | 115 | 0.20 | ||
| 36 | 2.62 | 76 | 3.23 | 116 | 10.05 | ||
| 37 | 6.32 | 77 | 2.52 | 117 | 8.82 | ||
| 38 | 6.47 | 78 | 1.32 | 118 | 5.52 | ||
| 39 | 9.54 | 79 | 2.13 | 119 | 8.62 | ||
| 40 | 4.52 | 80 | 7.25 | 120 | 6.65 |
STD1 : Bacillus amyloliquefaciens KCCM 40764
STD2 : Bacillus subtilis KCCM 11314
Acarbose : 2.5㎍/g
알파글루코시다아제 저해 활성을 갖는 균주 2, 3, 5, 12, 28, 33, 63 및 64 번 계통의 단백분해 활성을 측정한 결과는 도 1과 같다. 단백분해 활성은 63번 계통에서 투명환이 가장 크게 나타났다(동그라미로 표시한 균주).
한편, 분리 균주 배양액을 TLC로 분석한 결과 우선 알파글루코시다아제 저해 활성에 의해 글루코스의 생성량이 대조군 및 표준 균주에 비하여 적거나 혹은 생산되지 않은 균주들을 선발하였다. 그 결과는 도 2로, 이 중 2, 3, 5, 12, 28, 42, 47, 55, 63, 64, 120 및 121번 계통이 표준 균주에 비하여 적거나 혹은 생산되지 않았다. 63번 계통의 경우 알파글루코시다아제 저해 활성이 높은 동시에, 말타아제 저해 활성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 따라서 이 균주를 AGI-63이라 명명하였다.
1-2.
분리균주의
동정
16S rRNA 염기서열분석은 계통분류 툴(phylogenetic tool)을 이용하였으며, 그 결과 선발한 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스로 동정되었다. 상기 동정된 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63(Bacillus amyloliquefaciens AGI-63)이라 명명하였으며, 균주의 계통수는 도 3에 나타내었다.
1-3.
동정된
균주의 특성 분석
AGI-63 균주를 TSB 배지에 접종하여 각 온도별 인큐베이터에 배양하여 성장을 관찰한 결과는 표 3과 같다. 그 결과, 30~60℃ 온도에서 AGI-63 균주의 성장이 가능하였으나, 70℃ 이상의 온도에서는 균체 성장이 확인되지 않았다.
| 처리온도(℃) | 성장여부 |
| 30 | + |
| 40 | + |
| 50 | + |
| 60 | + |
| 70 | - |
한편, AGI-63 균주를 각 염도별 TSB 배지에 접종하여 배양하면서 성장을 관찰한 결과는 표 4와 같다. 상기 균주는 높은 염도에서도 균체 성장이 확인되었는데, 이는 장류에서 분리한 균주이므로 높은 염도에서도 성장이 가능한 것이라고 판단된다.
| 처리염도(%) | 성장여부 |
| 0 | + |
| 5 | + |
| 7 | + |
| 10 | + |
| 15 | + |
또한 AGI-63 균주의 생화학적 특성을 조사한 결과는 표 5와 같다. 상기 균주는 전분, 스킴 밀크, 지방을 분해하며, 카탈라아제를 생산하나, 인돌은 생성하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
| 시험 | 결과 | |
| 카탈라아제 생산 시험 | + | |
| 옥시다아제 생산 시험 | - | |
| 임빅 | 인돌 생산 시험 | - |
| 메틸 레드 시험 | ||
| - | ||
| 보게스 프로스카우에르 시험 | ||
| - | ||
| 구연산 사용 시험 | ||
| - | ||
| 가수분해 | 전분 | + |
| 스킴 밀크 | + | |
| CMC | - | |
| 리파아제 | + | |
API CHB 동정 키트를 이용하여 당 발효/이용성을 조사한 결과는 표 6과 같다. 그 결과, AGI-63 균주는 L-아라비노스, 리보오스, D-자일로스, D-글루코스, 프럭토스, 말토스 등의 당을 이용하는 것을 확인하였다.
| O | + | MNE | + | SAL | + | GEN | - |
| GLY | - | SBE | - | CEL | + | TUR | - |
| ERY | - | RHA | - | MAL | + | LYX | - |
| DARA | - | DUL | - | LAC | + | TAG | - |
| LARA | + | INO | - | MEL | - | DFUC | - |
| RIB | + | MAN | + | SAC | + | LFUC | - |
| DXYL | + | SOR | + | TRE | + | DARL | - |
| LXYL | - | MDM | - | INU | - | LARL | - |
| ADO | - | MDG | + | MLZ | - | GNT | - |
| MDX | - | NAG | + | RAF | + | 2KG | - |
| GAL | - | AMY | - | AMD | - | 5KG | - |
| GLU | + | ARB | - | GLYG | - | ||
| FRU | + | ESC | + | XLT | - |
실시예
2. 선별된 균주를 이용한 발효청국장의 특성 분석
2-1. 선별된 균주를 이용한 발효청국장의 제조
본 발명에서 분리된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63(Bacillus amyloliquefaciens AGI-63) 균주를 종균으로 도 4와 같은 과정을 통하여 청국장을 제조하였다. 청국장 제조에 쓰인 콩은 순창군에서 재배되는 백태를 구입하여 재료로 사용하였다. 구체적으로 대두를 24시간 침지하고, 침지된 대두를 121℃에 30분간 증자시켰다. 증자된 대두에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63(Bacillus amyloliquefaciens AGI-63) 균주를 0.1% 접종하고, 상기 접종된 대두를 37℃에서 48시간 발효시켜 청국장을 제조하였다.
2-2. 선별된 균주를 이용한 발효청국장의
알파글루코시다아제
저해능
분석
상기 방법에 의해 제조된 발효청국장을 이용하여 알파글루코시다아제 저해능을 측정한 결과는 도 5와 같다. 0, 24 및 48시간 발효시킨 청국장의 알파글루코시다아제 저해 활성을 비교한 결과, 0시간부터 24시간까지 완만한 증가추세를 보였으나, 24시간 이후부터 48시간까지는 급격한 증가를 보여 48시간 발효시킨 청국장에서 54.6%의 저해활성을 보였다. 반면, 48시간 이상 발효시킨 청국장의 경우 이취가 증가하여 관능에 좋지 않은 영향을 미쳤다. 그러므로 알파글루코시다아제 저해능과 관능을 고려해 볼 때, 48시간 발효시킨 청국장을 이용하는 것이 가장 이상적이라 하겠다.
2-3. 선별된 균주를 이용한 발효청국장의
아미노태
질소 및 유리 아미노산 분석
청국장의 구수한 맛을 좌우하는 아미노태 질소 함량을 측정한 결과 616.42mg%로 전통식품 품질인증 청국장 기준(300mg%이상) 및 순창전통 민속마을 청국장(364.02mg%: 식약청 용역)보다 약 2배 높은 함량을 나타내었다(표 7). 이 결과 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 AGI-63 균주는 알파글루코시다아제 저해 활성이 우수하면서도 청국장의 구수한 맛을 내기에 적합한 균주임을 확인할 수 있었다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 청국장의 유리 아미노산은 27종이 동정 되었으며, 글루탐산, 발린, 루신 및 페닐알라닌 등이 각각 35.84, 36.41, 39.92 및 48.98mg%로 높은 함량을 나타내었으며, 기존의 청국장의 아미노산 함량(글루탐산:28.66, 발린:33.75mg%)보다 더 높은 함량을 나타내었다. 위 결과는 바실러스 나토와 바실러스 서브틸리스 균주를 이용하여 각각 제조한 청국장의 아미노산 조성에 있어서 글루탐산, 발린 루신 및 페닐알라닌 등의 함량이 많았다는 보고와 유사하였다.
따라서 본 발명에서 분리한 균주로 제조한 청국장은 단맛, 구수한맛, 쓴맛을 지닌 27종의 아미노산이 어우러져 복합적인 청국장 특유의 맛을 형성하며, 상기와 같은 균주의 특이성으로 기능성을 가지는 청국장을 제조할 수 있었다
| 시료 | 아미노태 질소 함량(mg%) |
| Bacillus amyliliquefaciens AGI-63 청국장 | 616.42 |
| 순창 민속마을 청국장 평균(30개) | 364.02 |
| 아미노산 | 유리 아미노산 함량(mg%) | |
| 1 | 포스포세린(Phosphoserine) | 5.55 |
| 2 | 타우린(Taurine) | ND |
| 3 | 포스포에탄올아민(Phosphoethanolamine) | ND |
| 4 | 우레아(Urea) | 12.10 |
| 5 | 아스파틱산(Aspartic Acid) | 4.50 |
| 6 | 히드록시프롤린(Hydroxyproline) | ND |
| 7 | 트레오닌(Threonine) | 8.01 |
| 8 | 세린(Serine) | 4.57 |
| 9 | 글루탐산(Glutamic Acid) | 35.84 |
| 10 | 사르코신(Sarcosin | ND |
| 11 | α-아미노아디프산(α-Aminoadipic Acid) | 4.62 |
| 12 | 프롤린(Proline) | 5.20 |
| 13 | 글리신(Glycine) | 11.29 |
| 14 | 알라닌(Alanine) | 19.50 |
| 15 | 시트루린(Citrulline) | 4.99 |
| 16 | α-아미노뷰티르산(α-Aminobutyric Acid) | ND |
| 17 | 발린(Valine) | 36.41 |
| 18 | 시스틴(Cystine) | 1.35 |
| 19 | 메티오닌(Methionine) | 12.73 |
| 20 | 시스티오닌(Cystionine) | ND |
| 21 | 이소루신(Isoleucine) | 23.62 |
| 22 | 루신(Leucine) | 39.92 |
| 23 | 티로신(Tyrosine) | 34.60 |
| 24 | 페닐알라닌(Phenylalanine) | 48.98 |
| 25 | β-알라닌(β-Alanine) | 0.99 |
| 26 | β-아미노이소뷰티르산(β-Aminoisobutyric Acid) | 18.36 |
| 27 | γ-아미노뷰티르산(γ-Aminobutyric Acid) | 3.45 |
| 28 | 에탄올 아민(Ethanol amine) | 1.43 |
| 29 | 암모니아(Ammonia) | 47.42 |
| 30 | 오르니틴(Ornithin) | 16.95 |
| 31 | 리신(Lysine) | 24.01 |
| 32 | 1-메틸히스티딘(1-Methylhistidine) | ND |
| 33 | 히스티딘(Histidine) | 23.64 |
| 34 | 3-메틸히스티딘(3-Methylhistidine) | ND |
| 35 | 안세린(Anserine) | ND |
| 36 | 카르노신(Carnosine) | ND |
| 37 | 알기닌(Arginine) | 0.94 |
| 총 계 | 451.00 |
Claims (4)
- 알파글루코시다아제(α-glucosidase) 저해능을 가지는, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) AGI-63 균주(KCCM11407P).
- 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 청국장 발효용 조성물.
- 제1항의 균주를 증자된 대두에 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 청국장의 제조 방법.
- 제3항의 제조 방법에 의해 제조된 청국장.
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|---|---|---|---|
| KR20130041225A KR20140123847A (ko) | 2013-04-15 | 2013-04-15 | 전통장류에서 분리한 알파글루코시다아제 저해능을 갖는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 agi-63 균주 및 이의 용도 |
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