KR20210109365A

KR20210109365A - 항균 활성, 항산화 활성, 혈전 분해 활성, 항생제 내성, β-글루코시다제 및 세포외 효소 분비능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스 SRCM102027 균주 및 이의 용도

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Publication number: KR20210109365A
Application number: KR1020200024580A
Authority: KR
Inventors: 신수진; 하광수; 임수아; 김진원; 정성엽; 정도연
Original assignee: 재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority date: 2020-02-27
Filing date: 2020-02-27
Publication date: 2021-09-06

Abstract

본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항산화 활성, 혈전분해 활성이 있고, 항생제 내성과 효소 분비능을 지니고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027 균주, 상기 바실러스 서브틸리스 SRCM102027 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제, 상기 균주를 포함하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물에 관한 것이다.

Description

항균 활성, 항산화 활성, 혈전 분해 활성, 항생제 내성, β-글루코시다제 및 세포외 효소 분비능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스 SRCM102027 균주 및 이의 용도{Bacillus subtilis SRCM102027 strain having antimicrobial activity, antioxidant activity, fibrinolytic activity, antibiotic resistance, β-glucosidase and extracellular enzyme secretion activity, and not producing harmful metabolite and harmful enzyme and uses thereof}

본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항산화 활성, 혈전분해 활성이 있고, 항생제 내성과 효소 분비능을 지니고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

청국장은 콩을 삶아 볏짚을 군데군데 꽂고 따뜻한 아랫목에 덮어 두면 하룻밤사이에 표면이 회백색이 되고 끈적끈적한 실이 나게 띄워진다. 여기에 소금이나 마늘, 고춧가루 등을 섞어 절구통에서 찧어 단지에 다져 넣고 두면서 찌개의 재료로 사용하여 온 것으로 우리의 전래 간장, 된장, 고추장과는 달리 전통장류 중 유일하게 소금을 첨가하지 않고 고온에서 속성으로 발효시킨 식품이기 때문에 전통적으로 콩을 수확한 뒤 늦가을부터 초봄사이에 각 가정에서 손쉽게 제조하여 왔다. 청국장은 된장보다 콩 단백질과 지방질 함량이 많고 소화 흡수율이 높으며, 칼슘과 비타민 A, B의 중요한 공급원, 청국장균의 정장효과, 섬유질의 변비예방효과, 발암물질과 콜레스테롤의 체외 배출효과, 점질물(mucin)의 알코올 흡수에 의한 해장효과, 사포닌의 혈관강화와 혈액순환 촉진과 젖산분해효과, 레시틴의 뇌 노화와 치매, 고혈압과 동맥경화의 예방 등의 효과가 있다는 것이 많이 알려져 왔다.

장류는 한국인의 식탁에 필수적인 부식으로서 식품으로 안전성 확보는 무엇보다도 중요한 과제이다. 장류의 발효과정에서 식품 안전을 좌우하는 3가지 주요 인자는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 같은 유해 미생물, 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 등이 생산하는 아플라톡신(aflatoxin) 및 발효 미생물에 의해 생산되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)이 있다.

전통 방식에 의해 제조하는 장류는 필연적으로 자연 환경에 노출되는 상태로 발효가 이루어지기 때문에 발효나 숙성과정 동안 토양이나 대기의 유해 미생물들에 의해 독소들이 생성될 가능성이 높다. 장의 발효에 관여하는 주된 미생물 중의 하나는 바실러스(Bacillus) 속이다. 세균으로서 바실러스 서브그룹(Bacillus subgroup) 1에 속하는 바실러스 마이코이드(B. mycoides), 바실러스 튜린지엔시스(B. thuringiensis), 바실러스 안트라시스(B. anthracis) 또는 바실러스 세레우스(B. cereus)는 유해균으로 알려져 있다. 특히 바실러스 세레우스는 HBL(haemolysin BL), NHE(non-hemolytic enterotoxin) 또는 cytK(cytotoxin K)와 같은 설사나 장염을 일으키는 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 식품에 오염된 바실러스 세레우스 균이 증식하여 생산한 독소(cereulide) 및 구토를 일으키는 펩티드 형태의 안트락스(anthrax)와 유사한 호흡 질환을 유발하는 세트락스(certhrax)를 생산한다.

한국등록특허 제0927573호에는 바실러스 서브틸리스 BN-NUCI 균주를 이용한 청국장 종균의 제조방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1594446호에는 유해 미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 및 이의 용도가 개시되어 있으나, 본 발명의 항균 활성, 항산화 활성, 혈전 분해 활성, 항생제 내성, β-글루코시다제 및 세포외 효소 분비능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스 SRCM102027 균주 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자는 전통 장류에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027 균주가 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항산화 활성, 혈전분해 활성이 있고, 항생제 내성과 효소 분비능을 지니고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항산화 활성, 혈전분해 활성이 있고, 항생제 내성과 효소 분비능을 지니고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 SRCM102027 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 SRCM102027 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027 균주는 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항산화 활성, 혈전분해 활성이 있고, 항생제 내성과 효소 분비능을 지니고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않으므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 균주는 유해 미생물의 증식을 억제할 수 있으므로, 상기 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027 균주의 16S rRNA의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027의 계통수(phylogenetic tree)이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성과 항산화 활성, 혈전분해 활성 및 항생제 내성이 있고, β-글루코시다제(β-glucosidase)와 세포외 효소 분비능을 지니고, 유해물질과 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027 균주(KCCM12623P)를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 유해 미생물은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 에스케리키아 콜리(Escherichia Coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)이며, 상기 효소는 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase), 리파아제(lipase) 및 셀룰라제(cellulase)이며, 상기 유해물질은 인돌(indole) 및 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid)이며, 상기 유해효소는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다..

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 항생제는 아목시실린(Amoxicillin), 아미카신(Amikacin), 암피실린(Ampicillin), 아지트로마이신(Azithromycin), 세파클러(Cefaclor), 세프타지딤(Ceftazidime), 세프록심(Cefuroxime), 세팔렉신(Cephalexin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 클린다마이신(Clindamycin), 에리트로마이신(Erythromycin), 푸시딘산(Fusidic acid), 젠타마이신(Gentamicin), 이미페넴(Imipenem), 카나마이신(Kanamycin), 린코마이신(Lincomycin), 네틸마이신(Netilmicin), 메티실린(Methicillin), 날리딕스산(Nalidixic acid), 네오마이신(Neomycin), 니트로푸란토인(Nitrofurantoin), 노르플록사신(Norfloxacin), 오플록사신(Ofloxacin), 옥사실린(Oxacillin), 페니실린(Penicillin), 피페미드산(Pipemidic acid), 피페라실린(Piperacillin), 리팜피신(Rifampicin), 록시스로마이신(Roxithromycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 테이코플라닌(Teicoplanin), 테트라사이클린(Tetracycline), 트리메소프림(Trimethoprim), 트리메소프림 설파메톡사졸(Trimethoprim-Sulfamethoxazole) 및 반코마이신(Vancomycin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다..

또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제공한다.

본 발명에 따른 항균용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다. 상기 장류는 청국장일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1. 고추장으로부터 고초균의 분리

고초균 분리를 위하여 냉장 보관한 고추장 시료 1 g을 취하여 멸균된 0.85% NaCl 용액 9 mL에 각 단계별로 희석하였다. 희석액 100 ㎕를 Nutrient Broth agar (Difco^TM, MI, USA) 배지를 함유하는 플레이트 상에 도말하여 30℃에서 18시간 배양한 후 고초균과 유사한 형태적 특징을 갖는 균주를 1차 선별하였다. 순수 분리한 고초균은 NB 고체 배지에 배양하여 10% 탈지우유(BD Difco, Sparks, MD, USA) 용액에 현탁하고 -80℃에 보관하여 사용하였다.

2. 청국장 제조

콩을 세척한 후 물에 봄 및 가을에는 12~15시간, 겨울에는 20시간, 여름에는 6~10시간 동안 침지한 후 찜통에 넣고 5~6시간 동안 증자하였다. 상기 증자한 콩을 60~70℃로 식힌 후 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027 균주를 1% 접종한 후 40~42℃에서 18~20시간 동안 발효하였다.

3. 세포외 효소활성

선별균주의 세포외 효소 분비능을 측정하기 위해 각 효소와 특이적으로 반응하는 기질의 성분이 포함된 고체배지를 이용한 한천 확산법(agar well diffusion method)을 사용하였다. 아밀라아제 활성은 가용성 전분(soluble starch)을 기질로 선택하여 1% 가용성 전분 및 2% 한천을 첨가한 고체배지를 제조하여 사용하였으며, 프로테아제 활성을 측정하기 위해 2% 탈지우유에 1.5% 한천을 첨가하여 고체배지를 제조하여 사용하였다. 셀룰라아제 활성은 1% CMC(carboxylmethyl cellulose)에 1.5% 한천을 첨가하여 고체배지를 제조하여 사용하였다. 아밀라아제 활성 측정은 루골 용액(Lugol solution)을 사용한 염색법을 사용하였고, 셀룰라아제 활성 측정은 0.1% 콩고 레드 용액(congo red solution)을 이용하여 확인하였다.

4. 항산화 활성 측정

선별 균주의 항산화 활성을 측정하기 위해 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl(Sigma-aldrich, MO, USA)의 방법에 따라 실험하였다. 분리 균주를 NB 한천 배지에 획선 도말한 후 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였으며 단일 콜로니를 5 mL Nutrient broth에 접종하여 37℃, 150 rpm 조건에서 24시간 배양하였다. 배양액 1 mL를 1.7 mL 튜브에 취한 후 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 100 uM DPPH 메탄올 용액 180 ㎕에 20 ㎕의 상등액을 첨가한 후 반응 산물은 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(TECAN)로 517 nm에서 흡광도를 측정하여 아래 식에 따라 항산화 활성을 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성의 비교는 천연 항산화제인 아스코르브산을 표준물질로 하여 측정하였다.

항산화 활성(%) = [1-(Abs _{517nm of sample})/(Abs _{517nm of control})]

Abs: 시료 첨가 DPPH 용액의 흡광도

Abc: 시료 무첨가 DPPH 용액의 흡광도

5. 식품유해 미생물에 대한 항균활성 측정

항균력을 조사하기 위해 분리 유산균은 MRS 액체배지에 접종하였고 37℃에서 24시간 배양 후, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 0.45 ㎛ 실린지 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균 후, 0.8% 연한천 플레이트(soft agar plate)를 이용한 웰 확산(well diffusion)법에 준하여 분리 균주의 상등액을 6 mm의 웰에 100 ㎕씩 분주하였고 30℃에서 24시간 동안 배양하여 형성된 억제환의 크기를 측정하였다. 지시균주는 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 분양받고(표 1) 20% 글리세롤(glycerol)에 stock하여 -80℃에서 보관하여 사용하였다. 유해세균들은 각각 해당 배지에 알맞게 배양하여 균일한 농도(O.D.₆₀₀, 0.4)로 조절한 후 0.8% 연한천 플레이트에 접종하여 항균활성 측정을 위한 배지를 제조하였다.

유해세균 리스트

Strains	Gram strain	Requires oxygen	Medium	Temperature (℃)
Micrococcus luteus KCCM11211	positive	aerobic bacteria	Nutrient broth	30
Escherichia coli KCCM11234	negative	aerobic bacteria	Nutrient broth	37
Bacillus cereus KCCM11204	positive	aerobic bacteria	LB broth	30
Stapylococcus aureus subsp. aureus KCCM11335	positive	aerobic bacteria	Nutrient broth	37

6. 용혈성 및 유해대사산물과 유해효소 생성 분석

선별된 균주의 용혈성 확인을 위해 혈액 한천 베이스(BD, Difco)에 5% 염소 혈액(MBcell, Korea)을 첨가하여 혈액 한천 배지를 제조하였다. 선별균주는 획선 도말하여 30℃에서 24시간 배양 후 균체 주위에 생기는 환의 형태로 α, β 및 γ 용혈성을 확인하였다. 암 유발 관련 유해대사산물인 인돌(indole) 및 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid)의 생성여부를 확인하기 위해 선별된 균주를 NB(BD, Difco) 액체배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 진탕배양하고 인돌 시약 드로퍼(BBL, BD Difco)를 첨가하여 배지 표면의 색 변화로 인돌 생성 여부를 확인하였다. 페닐피루브산 생성 여부는 페닐알라닌 한천(fluka, Buchs, switzerland) 배지에 균주를 접종하여 37℃에서 24, 48시간 배양 후 10% 염화 제2철(MBcell, Korea)를 3~4방울 첨가하여 균주 주위의 색 변화로 페닐피루브산 생성 여부를 확인하였다. 그리고 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(Urease)와 같은 대장암 유발 유해효소의 생성여부를 확인하였다. 우레아제 생성 여부는 우레아제 신속 검사 키트(MB cell)에 선별 균주를 접종하였고 바세린 오일(MBcell, Korea)을 표면에 첨가하여 혐기상태로 37℃에서 4~24시간 배양 후 색변화를 통해 확인하였다. β-글루쿠로니다아제는 TBX(Tryptone bile X-glucuronide, Oxoid) 한천 배지에 선별 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후 균주의 색 변화를 관찰하여 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 활성 여부를 확인하였다.

7. 선별균주의 혈전용해 활성

혈전분해 활성은 피브린 플레이트 방법(fibrin plate method)에 준하여 측정하였다. 50 U/ml의 트롬빈(thrombin) 용액 100 ㎕를 90 mm 페트리디쉬에 분주 후, 0.5% 피브리노겐 용액(67 mM sodium phosphate buffer) 10 mL와 1.0% 아가로스(agarose) 용액 10 mL를 순차적으로 첨가하여 혈전이 고루게 형성되도록 혼합하였다. 상온에서 10~30분간 방치하면서 배지를 응고시킨 후 시료주입을 위해 8 mm 구멍을 제작하여 형성된 구멍에 균주 배양액 100 ㎕를 주입하여 30℃에서 24시간 반응시켰으며, 구멍 주변에 혈전이 분해되어 형성된 환의 직경을 측정하여 혈전용해능을 측정하였다.

8. 항생제 감수성 확인

선별된 균주의 항생제 감수성 확인을 위하여 디스크 확산법(diffusion method)으로 실시하였다. 사용한 항생제 디스크(BBL Sensi-disc, Becton Dickinson Co, USA)는 아목시실린(Amoxicillin 25㎍, AML), 아미카신(Amikacin 30㎍, AK), 아목시실린+클라불란산(Amoxicillin + Clavulanic acid 3㎍, AUG), 암피실린(Ampicillin 10㎍, AMP), 아지트로마이신(Azithromycin 15㎍, AZM), 세파클러(Cefaclor 30㎍, CEC), 세프록심(Cefuroxime 30㎍, CTX), 세프타지딤(Ceftazidime 30㎍, CAZ), 세프록심(Cefuroxime 30㎍, CXM), 세팔렉신(Cephalexin 30㎍, CL), 시프로플록사신(Ciprofloxacin 5㎍, CIP), 클린다마이신(Clindamycin 10㎍, CD), 에리트로마이신(Erythromycin 15㎍, E), 푸시딘산(Fusidic acid 30㎍, FC), 젠타마이신(Gentamicin 30㎍, CN), 이미페넴(Imipenem 10㎍, IMI), 카나마이신(Kanamycin 30㎍, K), 린코마이신(Lincomycin 15㎍, MY), 네틸마이신(Netilmicin 30㎍, NET), 메티실린(Methicillin 5㎍, MET), 날리딕스산(Nalidixic acid 30㎍, NA), 네오마이신(Neomycin 30㎍, N), 니트로푸란토인(Nitrofurantoin 300㎍, F), 노르플록사신(Norfloxacin 10㎍, NOR), 오플록사신(Ofloxacin 5㎍, OFX), 페니실린 G (1IU, P), 페니실린 G (10IU, P), 페니실린 G (2IU, P), 피페미드산(Pipemidic acid 20㎍, PI), 피페라실린(Piperacillin 100㎍, PRL), 리팜피신(Rifampicin 5㎍, RD), 록시스로마이신(Roxithromycin 15㎍, RXT), 스트렙토마이신(Streptomycin 10㎍, S), 테이코플라닌(Teicoplanin 30㎍, TEC), 테트라사이클린(Tetracycline 30㎍, TE), 트리메소프림(Trimethoprim 5㎍, TM), 트리메소프림 설파메톡사졸(Trimethoprim-Sulfamethoxazole 25㎍, SXT), 반코마이신(Vancomycin 30㎍, VA)을 사용하였다. 감수성 시험방법은 최종균주를 이용하여 MRS 고체배지를 만든 후 Disc dispenser 8 (Liofilchem, Italy)에 항생제를 꽂아 순서대로 디스크를 올려놓고 30℃에서 24시간 배양하였다. 각 항생제에 대한 억제환 크기를 측정하고 CLSI(Clinical Laboratory Standards Institute) 가이드라인에 의해 감수성과 내성을 확인하였다.

9. 당 이용성 확인

선별 균주의 당 이용성을 확인하기 위하여 총 49종의 탄수화물 이용성을 기초로 제작된 API 50 CHB kit(BioMerieux, France)를 사용하였다. 선별 균주를 5 mL의 NB 액체배지에 계대배양하여 30℃에서 24시간 배양한 후 배양액 1 mL를 13,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 걷어내고 세포 펠렛만 회수하여 PBS(phosphate buffered saline, 0.1M, pH 7.0)로 2회 세척한 뒤 실험에 사용하였다. PBS와 McFarland standard를 이용하여 2와 같은 탁도로 맞추어 현탁액을 제조하였고, API 50 CHB medium에 현탁한 균주 배양액 1 ㎖을 첨가 후 혼합하여, API 50 CH 스트립에 120 ㎕씩 분주하고, 미네랄 오일(mineral oil)로 튜브 당 2~3방울씩 첨가하여 37℃에서 24시간 및 48시간 동안 배양한 후 각각의 당 발효패턴을 비교하였다. 당 발효 패턴은 튜브의 색 변화를 확인하여 양성 및 음성으로 판독하였다.

10. 효소 생성능 확인

바실러스 서틸리스 SRCM102027 균주의 효소 생성 여부를 조사하기 위해 API ZYM kit(bioMeriux Co., France)를 사용하여 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 외 19가지 효소활성을 검사하였다. 바실러스 서틸리스 SRCM102027을 NB 고체 배지에서 배양한 후 균체를 회수하여 0.85% NaCl 용액에 현탁해 5~6 Macfarland standdard로 조정하였다. API ZYM kit의 각 캡슐에 현탁액을 분주하고 37℃에서 4시간 배양한 후에 ZYM-A 및 ZYM-B 시약을 한 방울씩 떨어뜨려 색깔의 변화를 관찰함으로써, 효소 활성 정도를 조사하였다.

11. 선별 균주의 동정 및 계통수 작성

선별된 균주의 분자학적 동정 및 계통수 작성을 위해 균주를 TSB broth에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 원심분리 하여 균체를 회수하고 ZR Fungal/Bacterial DNA Miniprep kit (Zymo Research Corp., CA., USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 universal primer인 785F(5´-GGATTAGATACCCTGGTA-3´, 서열번호 2)와 907R(5´-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3´, 서열번호 3) 프라이머로 합성하여 16S rRNA 유전자 단편을 증폭시켰고, 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purification kit (QIAGEN)를 사용하여 정제한 후 ㈜마크로젠에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다(서열번호 1, 도 1). 분석결과를 National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)의 nucleotide BLAST를 사용하여 GeneBank에 등록된 염기서열과 상동성을 비교하였다. 염기서열은 ExTaxone-e 서버(http://www.eztaxon.org)를 통해 표준균주의 염기서열을 확보하여 MEGA 7.0 program을 사용하였으며, 염기서열간 상호비교 후 계통도를 작성하였다(도 2). 계통도는 Neighbor-joining 알고리즘을 사용하였으며, 1,000회 반복을 통해 bootstrapping하여 작성한 계통도의 견고성을 확인하였다.

실시예 1. 분리 균주 특성

전통장류로부터 분리한 바실러스 서브틸리스 균주 목록은 하기 표 2와 같다.

분리된 균주 목록

NO	균주명	SRCM NO.	분리원	16S rRNA 동정명
1	JBG17003	SRCM102027	도구리제주고추장	Bacillus subtilis
2	JBG17032	SRCM102046	의령황새골고구마고추장	Bacillus subtilis
3	JBS17148	SRCM102142	순창장수원우리콩간장	Bacillus subtilis
4	JBS17150	SRCM102144	옛맛국간장	Bacillus subtilis
5	JBS17155	SRCM102149	김종례순재래식간장	Bacillus subtilis
6	JBS17180	SRCM102172	범일국간장	Bacillus subtilis

분리한 바실러스 서브틸리스 균주 6종은 인돌(indole) 및 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid)의 유해물질과 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(Urease)의 유해효소를 생성하지 않음을 확인하였다(표 3).

분리 균주의 유해물질 및 유해효소 생성 유무

SRCM NO.	유해물질		유해효소
SRCM NO.	Indole	Phenylpyruvic acid pyruve acid	β-glucuronidase	Urease
SRCM 102027	-	-	-	-
SRCM 102046	-	-	-	-
SRCM 102142	-	-	-	-
SRCM 102144	-	-	-	-
SRCM 102149	-	-	-	-
SRCM 102172	-	-	-	-

또한, 모든 균주에서 항산화 활성 및 혈전분해 활성과 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase), 리파아제(lipase) 및 셀룰라제(cellulase)의 효소 활성이 있는 것으로 나타났으며, 바실러스 서브틸리스 SRCM 102027 균주가 다른 균주에 비해 항산화 활성이 높게 나타났다(표 4).

분리 균주의 특성

SRCM NO.	DPPH 라디칼 소거능(%)	혈전분해 활성(mm)	효소 활성(mm)
SRCM NO.	DPPH 라디칼 소거능(%)	혈전분해 활성(mm)	protease	cellulase	lipase	amylase
SRCM 102027	55.46±2.58	25	23	21	23	15
SRCM 102046	55.25±0.31	26	19	18.5	15	23
SRCM 102142	51.97±1.46	24	22	20	16	14
SRCM 102144	53.63±1.50	25	18	20	20	15
SRCM 102149	47.97±0.41	19	20	20	11	10
SRCM 102172	42.63±2.08	24	18	21	21	16

항균 활성은 SRCM102027, SRCM102046, SRCM102142 및 SRCM102172 균주에서 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 에스케리키아 콜리(Escherichia Coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 4종의 유해 미생물에 대해 항균 활성이 있는 것으로 나타났다(표 5).

항균 활성

균주 종류	Antibacteriall activity(mm)
균주 종류	M. luteus KCCM 11211	E. coli KCCM 11234	B. cereus KCCM11204	S. aureus subsp. aureus KCCM11335
SRCM 102027	34	7	14	12
SRCM 102046	36	7	14	16
SRCM 102142	34	8	14	12
SRCM 102144	34	-	17	14
SRCM 102149	34	-	18	14
SRCM 102172	36	9	18	13

또한, 분리한 균주 6종 모두 하기 표 6의 항생제 내성이 있는 것으로 확인되었다(표 6).

항생제 감수성 분석

Antibiotics	3 letter symbols (conc.)	SRCM 102027	SRCM 102046	SRCM 102142	SRCM 102144	SRCM 102149	SRCM 102172
Amoxicillin	AML 25㎍	22	16	22	46	20	40
Amikacin	AK 30㎍	20	16	20	17	17	-
Amoxicillin + Clavulanic acid	AUG 3㎍	13	12	13	34	13	34
Ampicillin	AMP 10㎍	20	17	17	44	18	36
Azithromycin	AZM 15㎍	14	14	20	16	16	-
Cefaclor	CEC 30㎍	54	40	48	40	50	46
Ceftazidime	CAZ 30㎍	24	36	24	36	36	30
Cefuroxime	CXM 30㎍	46	50	54	56	50	28
Cephalexin	CL 30㎍	40	50	50	46	46	30
Ciprofloxacin	CIP 5㎍	28	20	34	30	31	22
Clindamycin	CD 10㎍	24	14	21	20	21	18
Erythromycin	E 15㎍	23	18	20	17	20	19
Fusidic acid	FC 30㎍	28	20	20	26	19	26
Gentamicin	CN 30㎍	16	16	20	16	30	16
Imipenem	IMI 10㎍	44	44	50	46	50	32
Kanamycin	K 30㎍	16	16	18	17	18	16
Lincomycin	MY 15㎍	26	13	18	22	17	32
Netilmicin	NET 30㎍	16	19	19	15	25	19
Methicillin	MET 5㎍	25	22	20	36	23	30
Nalidixic acid	NA 30㎍	32	19	20	21	19	20
Neomycin	N 30㎍	16	15	16	15	20	14
Nitrofurantoin	F 300㎍	14	15	16	15	15	12
Norfloxacin	NOR 10㎍	22	20	24	20	19	18
Ofloxacin	OFX 5㎍	20	18	23	20	22	17
Oxacillin	OX 5㎍	26	26	22	34	22	30
Penicillin G	P 1IU	12	12	11	34	10	34
Penicillin G	P 10IU	16	17	15	34	15	40
Penicillin G	P 2IU	16	17	13	40	15	36
Pipemidic acid	PI 20㎍	15	14	15	14	15	14
Piperacillin	PRL 100㎍	18	14	18	34	17	38
Rifampicin	RD 5㎍	17	15	17	23	20	20
Roxithromycin	RXT 15㎍	18	17	20	17	20	20
Streptomycin	S 10㎍	14	9	15	12	13	13
Teicoplanin	TEC 30㎍	23	22	26	25	25	24
Tetracycline	TE 30㎍	25	14	16	15	16	16
Trimethoprim	TM 5㎍	20	20	23	20	22	22
Trimethoprim-Sulfamethoxazole	SXT 25㎍	23	21	25	17	23	25
Vancomycin	VA 30㎍	20	24	23	20	26	22

분리한 균주의 19가지 효소 활성을 분석한 결과는 하기 표 7과 같다. 분리한 균주 6종 모두 β-글루코시다제(β-glucosidase) 활성이 있는 것으로 나타났다.

선별된 유산균의 API ZYM kit를 이용한 효소 활성 분석

효소	SRCM 102027	SRCM 102046	SRCM 102142	SRCM 102144	SRCM 102149	SRCM 102172
alkaline phosphatase	-	-	-	-	-	-
csterase(C4)	-	-	-	-	+	-
esterase lipase(C8)	-	-	-	-	+	-
lipase(C14)	-	-	-	-	+	-
leucine arylamidase	-	-	-	-	-	-
valine arylamidase	-	-	-	+	-	-
cystine arylamidase	-	-	-	-	-	-
trypsin	-	-	-	-	-	-
α-chymotrypsin	-	-	-	-	-	-
acid phosphatase	+	-	-	-	-	-
naphthol-AS-BI-phosphohydrolase	+	-	-	+	-	-
α-galactosidase	-	-	-	-	-	-
β-galactosidase	-	-	-	-	-	-
β-glucuronidase	-	-	-	-	-	-
α-glucosidase	-	-	-	-	-	-
β-glucosidase	+	+	+	+	+	+
N-acetyl-β-glucosaminidase	-	+	-	-	-	-
α-nabbisudase	-	-	-	-	-	-
α-fucosidase	-	-	-	-	-	-
control	-	-	-	-	-	-

분리한 균주 6종의 당 이용성을 분석한 결과는 하기 표 8 및 9와 같다.

선별된 유산균의 API 50 CH kit를 이용한 당 이용성 분석-1

No.	Active ingredients	SRCM 102027	SRCM 102046	SRCM 102142	SRCM 102144	SRCM 102149	SRCM 102172
0	0	+	+	+	+	+	+
1	GLY	-	-	+	-	-	+
2	ERY	-	-	-	-	-	-
3	DARA	-	-	+	-	-	-
4	LARA	+	+	-	+	-	+
5	RIB	+	-	+	-	-	-
6	DXYL	+	-	-	+	-	+
7	LXYL	-	-	+	-	-	-
8	ADO	-	-	-	-	-	-
9	MDX	+	-	-	-	-	-
10	GAL	+	-	-	-	+	-
11	GLU	+	+	+	+	+	+
12	FRU	+	+	+	+	+	+
13	MNE	+	+	+	-	+	+
14	SBE	+	-	+	-	-	-
15	RHA	+	-	-	-	-	-
16	DUL	+	-	-	-	-	-
17	INO	+	+	-	-	-	-
18	MAN	+	+	+	+	+	+
19	SOR	+	+	+	+	+	+
20	MDM	-	-	-	-	-	-
21	MDG	+	+	+	+	+	+
22	NAG	+	+	+	-	+	-
23	AMY	+	-	-	-	-	-
24	ARB	-	+	-	-	-	-
25	ESC	+	+	+	+	+	-

선별된 유산균의 API 50 CH kit를 이용한 당 이용성 분석-2

No.	Active ingredients	SRCM 102027	SRCM 102046	SRCM 102142	SRCM 102144	SRCM 102149	SRCM 102172
26	SAL	+	+	+	-	-	-
27	CEL	+	+	+	+	+	+
28	MAL	+	+	+	+	+	+
29	LAC	+	+	+	-	-	+
30	MEL	+	-	-	-	-	-
31	SAC	+	+	+	+	+	+
32	TRE	+	+	+	+	-	+
33	INU	+	+	-	+	-	+
34	MLZ	-	-	-	-	-	-
35	RAF	+	-	+	+	+	+
36	AMD	+	+	+	+	-	+
37	GLYG	+	+	+	+	-	+
38	XLT	-	-	-	-	-	-
39	GEN	+	+	-	-	-	+
40	TUR	+	+	-	-	-	+
41	LYX	-	+	-	-	-	-
42	TAG	+	+	-	-	-	-
43	DFUC	-	-	-	-	-	-
44	LFUC	-	-	-	-	-	-
45	DARL	-	-	+	-	-	-
46	LARL	-	-	-	-	-	-
47	GNT	-	-	-	-	-	-
48	2KG	-	-	-	-	-	-
49	5KG	-	-	-	-	-	-

상기 실험 결과, 항산화 활성과 프로테아제 활성이 높고, 다양한 유해미생물에 대한 항균 활성을 지니는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027 균주를 최종 청국장 발효 균주로 선정하였고, 상기 균주를 한국미생물보존센터에 2019년 11월 06일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM12623P).

실시예 2. 청국장 품질 특성

균주 종류에 따른 청국장의 수분, pH 및 색도를 비교한 결과는 하기 표 10과 같다. 그 결과, 균주로 발효함으로 인해 청국장 품질에는 큰 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다.

균주 종류에 따른 청국장 발효 특성

균주 종류	수분	pH	색도
균주 종류	수분	pH	L	a	b
SRCM102027	57.11±1.96	7.48	39.29	3.77	7.47
SRCM102046	56.74±0.29	7.77	39.17	3.93	7.30
SRCM102142	61.46±0.08	7.15	38.32	4.01	8.03
SRCM102144	59.42±0.37	7.54	41.02	3.57	7.12
SRCM102149	57.47±0.80	7.62	27.67	3.74	7.31
SRCM102172	54.07±3.54	7.54	40.40	3.91	7.34

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12623P

20191106

<110> Microbial Institute for Fermentation Industyry <120> Bacillus subtilis SRCM102027 strain having antimicrobial activity, antioxidant activity, fibrinolytic activity, antibiotic resistance, beta-glucosidase and extracellular enzyme secretion activity, and not producing harmful metabolite and harmful enzyme and uses thereof <130> PN19422 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1486 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 cttctccaga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg acagatggga 60 gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag 120 actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac cgcatggttc 180 aaacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt 240 ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca 300 cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca 360 atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag 420 ctctgttgtt agggaagaac aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga cggtacctaa 480 ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540 gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc 600 cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt 660 ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc 720 gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga 780 taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt 840 agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact 900 caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 960 cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc 1020 gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080 aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa 1140 ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1200 atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt 1260 taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320 agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380 tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt 1440 taggagccag ccgccgaagg tgggacagat gattggggtg aagcta 1486 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggattagata ccctggta 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccgtcaattc mtttragttt 20

Claims

유해 미생물에 대한 항균 활성과 항산화 활성, 혈전분해 활성 및 항생제 내성이 있고, β-글루코시다제(β-glucosidase)와 세포외 효소 분비능을 지니고, 유해물질과 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027 균주(KCCM12623P).
제1항에 있어서, 상기 유해 미생물은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 에스케리키아 콜리(Escherichia Coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)이며, 상기 효소는 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase), 리파아제(lipase) 및 셀룰라제(cellulase)이며, 상기 유해물질은 인돌(indole) 및 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid)이며, 상기 유해효소는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)인 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 SRCM102027 균주.
제1항에 있어서, 상기 항생제는 아목시실린(Amoxicillin), 아미카신(Amikacin), 암피실린(Ampicillin), 아지트로마이신(Azithromycin), 세파클러(Cefaclor), 세프타지딤(Ceftazidime), 세프록심(Cefuroxime), 세팔렉신(Cephalexin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 클린다마이신(Clindamycin), 에리트로마이신(Erythromycin), 푸시딘산(Fusidic acid), 젠타마이신(Gentamicin), 이미페넴(Imipenem), 카나마이신(Kanamycin), 린코마이신(Lincomycin), 네틸마이신(Netilmicin), 메티실린(Methicillin), 날리딕스산(Nalidixic acid), 네오마이신(Neomycin), 니트로푸란토인(Nitrofurantoin), 노르플록사신(Norfloxacin), 오플록사신(Ofloxacin), 옥사실린(Oxacillin), 페니실린(Penicillin), 피페미드산(Pipemidic acid), 피페라실린(Piperacillin), 리팜피신(Rifampicin), 록시스로마이신(Roxithromycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 테이코플라닌(Teicoplanin), 테트라사이클린(Tetracycline), 트리메소프림(Trimethoprim), 트리메소프림 설파메톡사졸(Trimethoprim-Sulfamethoxazole) 및 반코마이신(Vancomycin)인 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 SRCM102027 균주.
제1항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM102027 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제.
제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물.