KR101960355B1

KR101960355B1 - 항균활성, 항산화활성, 세포외 효소 분비능 및 페놀 생성능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 벨레젠시스 srcm102755 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101960355B1
Application number: KR1020180008060A
Authority: KR
Inventors: 하광수; 김진원; 정도연; 양호연; 신수진; 임수아; 정성엽
Original assignee: 재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority date: 2018-01-23
Filing date: 2018-01-23
Publication date: 2019-03-20

Abstract

본 발명은 항균활성, 항산화활성, 세포외 효소 분비능 및 페놀 생성능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 벨레젠시스 SRCM102755 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 SRCM102755 균주는 유해 미생물에 대한 항균활성, 항산화활성, 세포외 효소 분비능 및 페놀 생성능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 점을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 SRCM102755 균주는 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 미생물 제제 등 관련 산업에 다양하게 사용될 수 있는 유용한 균주로 판단된다.

Description

항균활성, 항산화활성, 세포외 효소 분비능 및 페놀 생성능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 벨레젠시스 SRCM102755 균주 및 이의 용도{Bacillus velezensis SRCM102755 strain having antimicrobial activity, antioxidant activity, extracellular enzyme secretion activity, phenol production activity and not producing harmful metabolite and harmful enzyme and uses thereof}

본 발명은 항균활성, 항산화활성, 세포외 효소 분비능 및 페놀 생성능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 벨레젠시스 SRCM102755 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

청국장은 콩을 삶아 볏짚을 군데군데 꽂고 따뜻한 아랫목에 덮어 두면 하룻밤 사이에 표면이 회백색이 되고 끈적끈적한 실이 나게 띄워진다. 여기에 소금이나 마늘, 고춧가루 등을 섞어 절구통에서 찧어 단지에 다져 넣고 두면서 찌개의 재료로 사용하여 온 것으로 우리의 전래 간장, 된장, 고추장과는 달리 전통장류 중 유일하게 소금을 첨가하지 않고 고온에서 속성으로 발효시킨 식품이기 때문에 전통적으로 콩을 수확한 뒤 늦가을부터 초봄 사이에 각 가정에서 손쉽게 제조하여 왔다. 청국장은 된장보다 콩 단백질과 지방질 함량이 많고 소화 흡수율이 높으며, 칼슘과 비타민 A, B의 중요한 공급원, 청국장균의 정장효과, 섬유질의 변비예방효과, 발암물질과 콜레스테롤의 체외 배출효과, 점질물(mucin)의 알코올 흡수에 의한 해장효과, 사포닌의 혈관강하와 혈액순환 촉진과 젖산분해효과, 레시틴의 뇌 노화와 치매, 고혈압과 동맥경화의 예방 등의 효과가 있다는 것이 많이 알려져 왔다.

된장은 우리나라의 대표적인 발효식품으로, 주재료로서 대두를 사용하는데 대두는 고단백의 식품소재이면서도 사포닌, 이소플라본, 이피리플라본 등의 생리활성물질을 포함하고 있어 항암작용, 골다공증 예방 등의 효과를 나타내어 대두를 비롯한 된장 등 대두 가공식품들은 건강식품으로 인식되고 있고, 대두 중의 이러한 유효성분들은 메주를 쑤어 발효되는 과정 중에 간장 또는 된장 등으로 상당량 옮겨가는 것으로 알려져 있다. 된장의 제조 방법은 전통적인 재래식 방법과 현대의 개량식 방법으로 크게 대별된다. 전통적인 된장의 제조방법은, 지역에 따라 다소 차이가 있으나 기본적으로 원료인 대두를 삶아서 찧고 벽돌형 또는 구형으로 성형하여, 2~3일간 건조한 뒤 균열이 생기면 짚 등으로 매달아 적당한 온도와 습도를 유지하게 한다. 이렇게 하여 주위의 다양한 미생물들이 자연적으로 착생되어 번식하게 한 메주를 깨끗이 씻어 2~3월에 소금물에 담궈 3~6개월간 발효 숙성시킨 후 액상은 달여서 간장으로 하고, 나머지는 고형물로 된장을 만든다.

고추장은 약 200년의 역사를 가진 전통 조미식품으로 된장 및 간장과 더불어 빼놓을 수 없는 중요한 발효식품이다. 주로 가정에서 소규모 단위로 제조되어 왔으나, 최근에는 식생활 양식의 변화에 따라 개량된 방식의 공업적 규모로 생산이 가능해졌고, 이러한 경향은 편리성을 추구하는 소비자 욕구와 더불어 점차 확대되고 있다. 고추장은 통상적으로 쌀, 밀가루, 보리, 수수, 팥 등의 전분질 원료에 메줏가루, 엿기름가루, 고춧가루를 섞은 후 소금으로 간을 하여 담그는 재래식 고추장의 제조방법과, 짧은 시간 안에 대량생산할 수 있는 전분질인 밀가루에 코지 또는 효소제를 사용하여 제조하는 개량형 고추장의 제조방법이 알려져 있다. 고추장은 단백질, 지방, 비타민 A와 C 등의 영양분이 풍부하며, 탄수화물이 가수분해되어 생긴 단맛과 콩 단백에서 나온 아미노산의 감칠맛, 고추의 매운맛, 소금의 짠맛 등이 잘 조화되어, 주로 각종 찌개의 맛을 내고, 생채나 숙채, 조림, 구이 등의 조미료로 이용되고 있다.

한편, 한국공개특허 제2015-0132723호에서는 '신규한 바실러스 벨레젠시스 CJBV 및 이를 포함하는 항균 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0109316호에서는 '전통메주의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '항균활성, 항산화활성, 세포외 효소 분비능 및 페놀 생성능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 벨레젠시스 SRCM102755 균주 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 바실러스 세레우스, 스타필로코커스 아우레우스, 리스테리아 모노시토게네스 및 엔테로코커스 패칼리스에 대한 항균활성, 항산화활성, 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제 분비능 및 항산화 활성이 있고, 유해물질인 인돌 및 페닐피루브산 및 유해효소인 β-글루쿠로니다아제 및 우레아제를 생성하지 않는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SRCM102755 균주(KCCM12199P)를 분리하였다.

본 발명의 바실러스 벨레젠시스 SRCM102755 균주는 상기와 같은 특징을 모두 가지므로, 품질 좋은 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 바실러스 세레우스, 스타필로코커스 아우레우스, 리스테리아 모노시토게네스 및 엔테로코커스 패칼리스인 유해 미생물에 대한 항균용 제제로도 사용이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 유해 미생물에 대한 항균활성, 항산화활성, 세포외 효소 분비능 및 페놀 생성능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SRCM102755 균주(KCCM12199P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SRCM102755 균주(KCCM12199P)는 유해 미생물에 대한 항균활성, 항산화활성, 세포외 효소 분비능 및 페놀 생성능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 점을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 SRCM102755 균주는 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 미생물 제제 등 관련 산업에 다양하게 사용될 수 있는 유용한 균주로 판단된다.

도 1은 본 발명에서 분리한 SRCM102755 균주의 계통도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 분리한 SRCM102755 균주의 DPPH 소거능(%)을 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 분리한 SRCM102755 균주의 총 페놀 함량을 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유해 미생물에 대한 항균활성, 항산화활성, 세포외 효소 분비능 및 페놀 생성능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SRCM102755 균주(KCCM12199P)를 제공한다.

본 발명에서 전통장류로부터 균주를 분리하였고, 그 중 바실러스 세레우스, 스타필로코커스 아우레우스, 리스테리아 모노시토게네스 및 엔테로코커스 패칼리스에 대한 항균활성, 항산화활성, 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제 분비능이 있고, 유해물질인 인돌 및 페닐피루브산 및 유해효소인 β-글루쿠로니다아제 및 우레아제를 생성하지 않는 균주 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)를 확인하였으며, 이를 바실러스 벨레젠시스 SRCM102755 균주로 동정하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2018년 1월 11일에 기탁하였다(기탁번호: KCCM12199P).

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 세포외 효소는 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제이며, 유해 미생물은 바실러스 세레우스, 스타필로코커스 아우레우스, 리스테리아 모노시토게네스 및 엔테로코커스 패칼리스이며, 유해물질은 인돌 및 페닐피루브산이며, 유해효소는 β-글루쿠로니다아제 및 우레아제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강하시키기 위한 목적을 달성할 수 있다.

본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 그대로 첨가하거나 다른 첨가제를 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 항균 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항진균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes) 및 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 등을 포함하는 병원성 미생물, 특히 그람 양성 병원성 미생물의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항균 조성물은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SRCM102755 균주(KCCM12199P) 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다. 상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 당질은 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있고 상기 단백질은 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으며, 상기 지질은 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있고, 상기 미네랄류는 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 각각의 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

균주 분리 및 배양

바실러스 균주를 분리하기 위해 된장시료 1g을 멸균 생리 식염수 9mL에 잘 혼합하여 각 단계별로 10진 희석한 후 희석액 100㎕를 Luria-Bertani 아가(LB 아가, BD Difco, Sparks, MD, USA)에 도말하였으며 30℃에서 18시간 배양하였으며, 형성된 집락의 형태 차이를 이용하여 균주를 1차적으로 선발한 후 다시 순수 배양하여 균주를 분리하였다. 분리한 미생물은 다음 연구에 사용을 위하여 10% 스킴 밀크(BD Difco, Sparks, MD, USA) 용액에 현탁하고 -80℃에 보관하여 사용하였다.

선발 균주의 세포외 효소 분비능 측정

분리 미생물이 균체 외로 방출하는 세포의 효소들 중 아밀라아제, 셀룰라아제 및 프로테아제 활성을 검증하기 위해 한천 확산법(agar well diffusion method)을 이용하였으며, 각 효소와 특이적으로 반응할 기질의 성분이 포함된 고체 선발배지를 사용하였다. 단백질 분해효소(protease)의 활성을 측정하기 위해 스킴 밀크를 기질로 선택하여 2% 스킴 밀크(BD Difco)에 1.5% 아가(Duchefa Biochemio, harrlem, Netherland)를 첨가하여 스킴 밀크 아가를 제조하여 사용하였다. 섬유소분해효소(cellulase)의 활성은 CMC(carboxylmethyl cellulose)를 기질로 선택하여 1% CMC(Junsei chemical Co., Ltd, Tokyo, Japan)에 1.5% 아가(Duchefa Biochemio), 0.01% 트리판 블루(sigma-aldrich, st. Louis, MO, USA)를 첨가하여 CMC 아가를 제조하여 사용하였다. 전분분해효소(amylase)의 활성은 가용성 전분을 기질로 선택하여 가용성 전분(Junsei chemical)과 2% 아가(Duchefa)를 첨가한 전분아가를 제조하여 사용하였다.

식품유해 미생물에 대한 항균활성 측정

유해미생물을 대상으로 선발한 균주의 항균활성을 식품을 대상으로 조사하였다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCTC3624, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCCM40935, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCCM11593 및 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes) KCCM43155 및 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) KCCM11814를 지시균주로 사용하여 0.8% 소프트 LB 아가 배지를 제조하였다. 선발된 균주의 항균활성을 조사하기 위해 LB 브로스(BD Difco) 배지에 균주를 접종하여 30℃에서 24시간 배양하였으며 균주 배양액을 14,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하였고, 0.45μm 시린지 필터(Sartorius)로 제균하여 상등액 시료로 사용하였다. 한천 확산법(agar well diffusion method) 방법에 준하여 선발 균주의 상등액을 6mm의 웰에 100μL씩 분주하여 30℃에서 24시간 동안 배양하여 형성된 억제환의 크기를 측정하여 선발된 균주의 유해미생물에 대한 길항능력을 확인하였다.

항산화 활성 분석( DPPH free radical scavenging activity)

선별 균주에 대한 항산화 활성은 Kedare & Singh의 방법을 응용하여 분석하였다. 0.1 mM 2,2-디페닐-1-피크릴-히드라질(DPPH, sigma-aldrich) 180uL에 20μL의 배양 상등액을 혼합하여 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 UV/VIS 스펙트로포토미터(SPECOR200, analyticjena, jena, Germany)로 흡광도를 측정하였으며, 아래 식에 대입하여 항산화 활성을 측정하였다. 음성대조구는 배양배지를 사용하였으며, 측정값은 대조군과 비교하여 동일한 방법으로 처리 후 측정하였다.

항산화활성 (%) = [1-(Abs_517nm _{of sample})/(Abs_517nm _{of control})]×100

API ZYM KIT, CHB50 kit를 이용한 바실러스 균주의 효소활성 및 당 이용성 분석

균주의 효소활성을 조사하기 위해 API ZYM 키트(bioMeriux Co., France)를 사용하여 알칼라인 포스파타제 외 18가지 효소활성을 검사하였다. 또한 API CHB50 키트를 이용하여 분리 균주의 당 이용성을 확인하였다.

독성 유전자 분석

분리 균주의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 독성 유전자 분석을 위해 QIAamp DNA mini QIAcube kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. hblC(hemolytic enterotoxin), cytK(Cytotoxin K), nheA(non-hemolytic enterotoxin), CER(emetic toxin), bceT(enterotoxin T), entFM(enterotoxin FM)의 6가지 독성 유전자 유무를 검출하기 위해 추출된 게놈 DNA를 주형(template)으로 사용하였으며, 바실러스 세레우스 톡신 6-plex 검출 키트(KOGENEBIOTECH, SeouL, Korea)를 이용한 PCR을 통해 유전자를 증폭하였으며 1% 아가로스 젤 상에서 유전자 존재 여부를 확인하였다.

용혈성 및 유해대사산물과 유해효소 생성 분석

선발된 균주의 용혈성 형태를 확인하기 위해 5% 양(sheep)의 혈액(MBcell, SeouL, Korea)을 첨가하여 혈액 아가 배지를 제조하였으며, 균주를 획선 도말하여 37℃에서 24시간 배양한 후 균주 주위의 생기는 환의 형태로 용혈성 형태를 확인하였다. 또한 인돌(indol), 페닐피루브산(phenylpyruvic acid)의 유해대사산물 및 우레아제(urease), β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)의 유해 효소 생성여부를 확인하였다. 인돌 생성 여부를 확인하기 위하여 선발된 균주를 TSB(BD, Difco) 액체배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 진탕배양하고 인돌 리전트 드롭퍼(BBL, BD Difco)를 첨가하여 배지 표면의 색 변화로 인돌 생성 여부를 확인하다. 페닐피루브산 생성 여부를 확인하기 위해 페닐알라닌 아가(fluka, Buchs, switzerland) 배지에 균주를 접종하여 37℃에서 24시간, 48시간 배양 후 10% 염화 제2철(MBcell)을 3-4 방울 첨가하여 균주 주위의 색 변화로 페닐피루브산 생성 여부를 확인하였다. 우레아제(urease) 생산 여부를 확인하기 위해 우레아 신속 테스트 키트(MB cell)에 선발 균주를 접종하고 바셀린 오일(MBcell)을 표면에 첨가하여 산소가 차단된 상태로 37℃에서 4-24시간 배양한 후 색변화 관찰을 통해 우레아제 생성 여부를 확인하였다. β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 활성 여부를 확인하기 위해 트립톤 바일 X-글루쿠로니드 (TBX, Oxoid) 아가 배지에 선발 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후 균주의 색 변화를 관찰하여 β-글루쿠로니다제 활성 여부를 확인하였다.

균주 배양액의 총 페놀 함량 분석

선별된 균주를 LB 아가 배지에 획선도말한 후 30℃ 배양기에서 하룻밤 배양하였으며 단일 콜로니를 5ml TSB 브로스(OXOID)에 접종하여 30℃, 150rpm 조건에서 하룻밤 배양하였다. 배양액 2ml을 2ml 튜브에 취한 후 13,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 새로운 2ml 튜브에 취하여 시료액으로, 갈산 모노하이드레이트(Gallic acid monohydrate, Sigma-Aldrich)를 표준용액으로 사용하였다. 선발 균주 TSB 배양액의 총 페놀 함량을 측정하기 위해 건강기능식품 플랫폼 공정의 총 페놀 함량 측정방법 이용하였다. 표준용액, 시료 10㎕를 96 웰 플레이트(SPL)에 넣은 후, 90㎕의 증류수와 폴린 시오칼테우 시약(Folin ciocalteu reagent, Sigma-Aldrich)를 10㎕씩 넣고 5분간 상온에서 배양하였다. 그 후 7% (w/v) 소듐 카보네이드 용액(Sigma-Aldrich) 100㎕을 각 웰에 넣고 20분간 실온에서 배양하였으며 마이크로플레이트 리더(TECAN)을 이용하여 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 갈산의 검량선으로부터 총 페놀 함량을 산출하였으며 블랭크(TSB broth)를 측정하여 흡광도 값을 0으로 맞췄다. 검량선의 일원일차방정식(linear equation)은 다음과 같다.

y = 0.002x + 0.044, R² = 1

y는 흡광도, x는 총 페놀 함량(㎍·ml^-1(ppm))

선발 균주의 동정 및 계통수 작성

선발된 균주의 분자학적 동정 및 계통수 작성을 위해 균주를 TSB 브로스에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하고 ZR Fungal/Bacterial DNA Miniprep kit (Zymo Research Corp., CA., USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 유니버셜 프라이머인 785F(5'-GGATTAGATACCCTGGTA-3', 서열번호 2)와 907R(5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3', 서열번호 3)로 합성하여 16S rRNA 유전자 단편을 증폭시켰고, 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR 정제 키트 (QIAGEN)를 사용하여 정제한 후 ㈜마크로젠에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 분석결과를 National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)의 뉴클레오티드 BLAST를 사용하여 GeneBank에 등록된 염기서열과 상동성을 비교하였다. 염기서열은 ExTaxone-e 서버(http://www.eztaxon.org)를 통해 표준균주의 염기서열을 확보하여 MEGA 7.0 program을 사용하였으며, 염기서열간 상호비교 후 계통도를 작성하였다. 계통도는 Neighbor-joining 알고리즘을 사용하였으며, 1,000회 반복을 통해 부트스트랩핑(bootstrapping)하여 작성한 계통도의 견고성을 확인하였다.

실시예 1. 균주 선발

전통 방식으로 제조된 된장 시료를 단계 희석하여 LB 아가(BD Difco) 배지에 배양하여 형태적 특징으로 1차 선발하였으며, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 선발하는 배지를 사용하여 균주를 2차 선발하였다. 분리된 바실러스를 세포외 효소활성, 항균활성 및 항산화활성 평가를 통하여 4종의 균주를 최종 선발하였다.

실시예 2. 균주의 동정

최종 선발된 SRCM102755의 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1) 분석 결과를 바탕으로 BLAST 검색한 결과 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)로 판명되었으며, Eztaxon server에서 표준 균주와 상동성을 비교 분석하였다. 서열 정렬 분석에 사용한 파라미터 및 옵션(option) 값은 프로테인 웨이트 매트릭스(protein weight matrix)로 고넷 시리즈(Gonnet series)를 사용하였고, 갭 오프닝(gap opening) 15, 갭 익스텐션(gap extension) 6.66, 딜레이 트랜지션 웨이트(delay transition weight) 0.5로 설정하였으며, 갭 패널티(gap penalty)는 5, K-터플 사이즈(K-tuple size)는 2, 탑 디아고날스(top diagonals)는 4, 윈도우 사이즈(window size)는 4로 설정하였다.

그 결과 SRCM102755 (1502 bp, 서열번호 1)는 바실러스 벨레젠시스 CR-502(AY603658)와 99%의 상동성을 나타내었다. 염기서열을 이용하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하기 위해 진화적 거리(evolutionary distances)의 추론은 맥시멈 컴포지트 라이크후드(maximum composite Likehood) 방법을 모델로 사용하였다. 최종적으로 선발된 균주를 바실러스 벨레젠시스 SRCM102755로 명명하였고, SRCM102755은 한국미생물보존센터(KCCM, Korean CuLture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM12199P로 기탁하였다.

실시예 3. 선발 균주의 세포외 효소 분비능 분석

미생물 유래의 아밀라제는 식품 산업에 있어서 식품원료를 가공하거나 특성을 개선하는데 있어서 오래전부터 전분을 가공하는 핵심 효소로서 지속적으로 활용되어 왔다(Natasa B et al., 2011, Biochem Eng J, Vol.53; pp.203-209). 또한 당분의 감미성분 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 프로테아제는 발효 시 단백질을 분해하여 특유의 구수한 맛 성분인 유리 아미노산의 함량에 영향을 준다고 밝혀졌으며(Kim et al., 2005, Kor. J. Life Science, 15, 749-754), 셀룰라제는 식물 세포벽의 주 구성 성분인 셀룰로스를 분해하여 장내 이용성을 향상시키는 역할을 한다. 곰팡이 및 세균 등에 의하여 분비되는 셀룰라제 성분으로는 엔도-1,4-β-D-글루카나제, 엑소-1,4-β-글루카나제, β-글루코시다제가 있으며, 콩 발효과정에서는 β-글루코시다제에 의하여 이소플라본 배당체가 아글리콘으로 전환되어 항산화 등의 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다(Ra, K.S et al., 2004. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 33: 439-442).

된장에서 찾은 균주 4종의 세포 외 효소활성을 비교 분석하였으며, 선별된 4개의 균주의 프로테아제의 활성은 비슷하였으나, SRCM102755 균주가 아밀라제 및 셀룰라제 활성은 비슷하거나 높은 것을 확인하였다(표 1).

선발 균주의 세포외 효소 분비능 측정

No.	Strains No.	Extracellular enzyme activity
No.	Strains No.	Amylase	Protease	Cellulase
1	SRCM102755	+++	++++	+++
2	SRCM102756	+	++++	+++
3	SRCM102747	+++	++++	++
4	SRCM102750	+	++++	-

+ : < 1cm, ++ : > 1cm, +++ : > 1.5cm, ++++ : > 2cm, +++++ : > 2.5cm

SRCM102756 : 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)

SRCM102747 : 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)

SRCM102750 : 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)

실시예 4. 선발 균주의 식품유해 미생물에 대한 항균활성 분석

바실러스 세레우스 KCTC3624, 바실러스 세레우스 KCCM40935, 스타필로코커스 아우레우스 KCCM11593, 리스테리아 모노시토게네스 KCCM43155 및 엔테로코커스 패칼리스 KCCM11814인 총 5종의 병원성 미생물에 대하여 항균활성 실험을 진행한 결과, SRCM102755 균주는 다양한 식품 유해 병원성 미생물 5종에 대하여 항균활성을 지니고 있었으며, 저해 효과 또한 우수하였다(표 2).

식품유해 미생물에 대한 항균활성 측정

No	Strains No.	Antimicrobial activity
No	Strains No.	B. cereus KCTC3624	B. cereus KCCM40935	S aureus KCCM11593	L. monocytogenes KCCM43155	E. faecalis KCCM11814
1	SRCM102755	+++	++++	+++	++++	+++++
2	SRCM102756	++	++	-	++++	++++
3	SRCM102747	++	++	++	++	++++
4	SRCM102750	+	+	-	-	+++

+ : < 1cm, ++ : > 1cm, +++ : > 1.5cm, ++++ : > 2cm, +++++ : > 2.5cm

실시예 5. 선발 균주의 독소 유전자 분석 결과

4종의 균주의 게놈 DNA를 추출하여 바실러스 세레우스가 생성하는 것으로 알려진 용혈성 장독소(hemolytic enterotoxin, hblC), 사이토톡신 K(Cytotoxin K, CytK), 비용혈성 장독소(non-hemolytic enterotoxin, nheA), 구토제 독소(emetic toxin, CER), 장독소 T(enterotoxin T, bceT) 유전자 및 장독소 FM(enterotoxin FM, entFM) 유전자 6종에 대해 PCR을 통해서 선발균주의 보유 여부를 확인한 결과 선발된 균주들 모두 독소유전자를 보유하지 않는 것을 확인하였다(표 3).

SRCM102755의 바실러스 세레우스 독소 유전자 분석 결과

No.	Strains No.	PowerChek^TM Bacillus cereus Toxin 6-plex Detection Kit
No.	Strains No.	CytK	nheA	entFM	bceT	hblC	CER
1	SRCM102755	ND	ND	ND	ND	ND	ND
2	SRCM102756	ND	ND	ND	ND	ND	ND
3	SRCM102747	ND	ND	ND	ND	ND	ND
4	SRCM102750	ND	ND	ND	ND	ND	ND

ND : 미검출

실시예 6. 선발 균주의 항산화 활성 분석

항산화제는 지방질 식품의 산패, 변색의 방지를 위해 자유 라디칼에 전자를 공여해주는 식품 내 지방질 산화를 억제하는 역할을 한다. 따라서 DPPH 방법을 이용해서 항산화 활성을 측정한 결과 SRCM102755 균주는 12.98%, SRCM102747은 9.93%, SRCM102750은 7.64%, SRCM102756은 11.54%로 높은 항산화 활성을 나타냈다(도 2).

실시예 7. 선발 균주 배양액의 총 페놀 함량 분석

식물성 식품 속에 함유되어 있는 많은 생리활성 물질 중 페놀은 가장 많이 함유되어 있으며 또한 높은 황산화 활성을 가지는 것으로 알려져 있다(Park et al., 2007, Kor. J. FOOD CULTURE, 22(3), 353-358). 균주 배양 상등액의 총 페놀 분석 결과 SRCM102755 균주는 63.59ppm, SRCM102747은 52.78ppm, SRCM102750은 35.55ppm, SRCM102756은 25.25ppm으로 높은 페놀을 함유하는 것을 나타냈다(도 3).

실시예 8. 선발 균주의 유해대사산물 및 유해 효소 생성 여부 분석

SRCM102755 균주를 대상으로 헤몰리신(hemolysin)을 유리하여 적혈구를 용해하거나 혈액을 변색시키는 용혈성을 보유하고 있는지 확인한 결과, 선발 균주는 용혈연쇄상구균이나 폐렴연쇄상구균에 의한 용혈에 대한 알파형 용혈(α-hemolysis)을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 선발 균주가 트립토파나제(tryptophanase)에 의해 트립토판을 분해하여 생성되는 발암 관련 물질인 인돌과 페닐피브르산, 발암에 관련된 효소인 우레아제(urease)와 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)를 생성하는지를 확인하는 실험을 진행한 결과, 표 4와 같이 선발 균주는 발암 관련 물질을 생성하지 않는 것으로 확인되었다.

Bacillus velezensis SRCM102755
용혈 (Hemolysis)	α-hemolysis
β-글루코시다제 (Glucosidase)	ND
β-글루쿠로니다아제 (Glucuronidase)	ND
우레아제 (Urease)	ND
인돌 (Indole)	ND
페닐피루브산 (Phenyl pyruvic acid)	ND

실시예 9. 선발 균주의 효소활성 분석

효소활성 시험 결과 SRCM102755 균주는 에스터라제 및 에스터라제 리파아제의 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다(표 5).

Bacillus velezensis SRCM102755
Control	-
alkaline phosphatase	-
esterase(C4)	+
esterase lipase(C8)	+
lipase(C14)	-
leucine arylamidase	-
valine arylamidase	-
cystine arylamidase	-
trypsin	-
α-chymotrypsin	-
acid phosphatase	-
naphthol-AS-BI-phosphohydrolase	-
α-galactosidase	-
β-galactosidase	-
β-glucuronidase	-
α-glucosidase	-
β-glucosidase	-
N-acetyl-β-glucosaminidase	-
α-nabbisudase	-
α-fucosidase	-

실시예 10. 선발 균주의 당 이용성 분석

API 50CHB 키트를 이용하여 SRCM102755 균주의 당 이용성을 분석하였다(표 6). 글리세롤(Glycerol), L-아라비노스(L-arabinose), D-리보스(D-ribose), D-자일로스(D-xylose), D-글루코스(D-glucose), D-프럭토스(D-fructose), D-만노스(D-mannose), 만니톨(Mannitol), 소르비톨(Sorbitol), 메틸-α-D-글루코피라노스(Methyl-α-D-glucopyranose), 메틸-α-D-글루코시드(Methyl-α-D-glucoside), 아미그달린(Amygdalin), 아르부틴(Arbutin), 에스쿨린(Esculin), 살리신(Salicin), D-셀로비오스(D-cellobiose), D-말토스(D-maltose), D-락토스(D-lactose), 수크로스(Sucrose), 트레할로스(Trehalose), D-라피노스(D-raffinose), 전분(Starch), 글리코겐(Glycogen) 및 젠티오비오스(Gentiobiose)를 이용할 수 있는 능력이 있는 것을 확인하였다(표 6).

선발된 SRCM102755 균주의 당 이용성

Test	Reaction	Test	Reaction
Contorl	-	Esculin	+
Glycerol	+	Salicin	+
Erythritol	-	D-cellobiose	++
D- arabinose	-	D-maltose	++
L-arabinose	+	D-lactose	+
D-ribose	+	D-melibiose	-
D-xylose	+	Sucrose	++
L-Xylose	-	Trehalose	+
D-adonitol	-	Inulin	-
Methyl-D-xylopyranoside	-	D-melezitose	-
D-galactose	-	D-raffinose	+
D-glucose	++	Starch	++
D-fructose	++	Glycogen	++
D-mannose	++	Xylitol	-
L-sorbose	-	Gentiobiose	+
Rhamnose	-	D-turanose	-
Dulcitol	-	D-lyxose	-
Inositol	-	D-tagatose	-
Mannitol	+	D-fucose	-
Sorbitol	++	L-fucose	-
Methyl-α-D-glucopyranose	++	D-arabitol	-
Methyl-α-D-glucoside	+	L-arabitol	-
N-Acetyl-D-glucosamine	-	Glycogen	-
Amygdalin	+	2-Ketogluconate	-
Arbutin	++	5-Ketogluconate	-

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12199P

20180111

<110> Microbial Institute for Fermentation Industry <120> Bacillus velezensis SRCM102755 strain having antimicrobial activity, antioxidant activity, extracellular enzyme secretion activity, phenol production activity and not producing harmful metabolite and harmful enzyme and uses thereof <130> PN18021 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1502 <212> DNA <213> Bacillus velezensis SRCM102755 <400> 1 aggttttgga acctgctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60 ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120 cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180 accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240 cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420 cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480 gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540 gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600 gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660 gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720 agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780 aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840 tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900 aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960 ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020 gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080 agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140 tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200 atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1260 aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320 tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380 tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440 gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtctac 1500 aa 1502 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggattagata ccctggta 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccgtcaattc mtttragttt 20

Claims

바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes) 및 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)에 대한 항균활성, 항산화활성, 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제 분비능 및 페놀 생성능이 있고, 인돌, 페닐피루브산, β-글루쿠로니다아제 및 우레아제를 생성하지 않는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) SRCM102755 균주(KCCM12199P).
삭제
제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물.
제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes) 또는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)에 대한 항균용 조성물.