KR102117877B1

KR102117877B1 - 간편식 즉석 된장의 제조방법

Info

Publication number: KR102117877B1
Application number: KR1020200007081A
Authority: KR
Inventors: 김종덕
Original assignee: 농업회사법인 주식회사 순창성가정식품
Priority date: 2019-05-08
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2020-06-03

Abstract

본 발명은 (a) 수침하고 증자한 대두에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 접종하여 메주로 성형하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 성형한 메주를 건조하고 염수에 침지하여 숙성시킨 후 된장을 분리하고, 상기 분리한 된장을 숙성하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 숙성시킨 된장과 물 및 설탕을 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 간편식 된장의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 간편식 된장에 관한 것이다.

Description

간편식 즉석 된장의 제조방법{Method for producing convenient instant Doenjang}

된장은 콩을 주원료로 하는 우리나라 전통 발효 식품 중의 하나로, 단백질 섭취가 부족했던 옛 조상들에 있어서는 독특한 맛과 향을 주는 조미식품의 역할뿐만 아니라 쌀밥과 같이 섭취하게 되면 쌀이나 곡식에서는 부족한 리신(lysine)과 트립토판(tryptophan) 등을 보충할 수 있는 주요 단백질의 공급원으로 이용되어 왔으며, 필수아미노산, 지방산, 유기산, 미네랄, 비타민 등이 풍부하여 현대인들에게 필요한 영양분을 보충해 주는 것으로 알려져 있다.

된장은 항산화 기능, 항돌연변이성, ACE 저해 물질, 혈전 용해 물질 등 여러 가지 유익한 생리활성 물질들이 함유되어 있음이 여러 실험을 통해 밝혀지면서 건강기능 식품으로의 효능이 더해져 많은 소비자들이 찾고 있으며, 현재도 활발한 연구가 이루어지고 있다.

최근에는 된장국을 가정이나 야외에서 간편하게 물과 혼합하여 끓여서 먹을 수 있는 인스턴트 식품이 개발되어 된장국의 대중화와 세계화에 앞장서고 있고, 종래 인스턴트 된장국은 된장과 양념을 분말화한 분말 및 채소를 동결건조한 블럭으로 구성되어 일반적인 인스턴트 식품과 같이 물만 부어서 먹는 형태가 대부분이다. 하지만, 시중에 판매되고 있는 인스턴트 된장국은 집에서 끓여먹는 국의 맛과 비교하여 조직감은 물론 재료에서 우러나는 깊은맛이 부족한 문제점이 있다. 따라서 끓이지 않고 뜨거운 물만 부어 즉석에서 먹을 수 있으면서 집에서 직접 끓여 먹는 된장국과 유사한 갚은 맛, 조직감 및 색상을 나타낼 수 있는 된장국이 요구되고 있다.

한국등록특허 제1732899호에는 청국장을 첨가한 즉석 청된장국의 제조방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1173211호에는 즉석 된장의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 간편식 즉석 된장의 제조방법과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 품질 및 기호도가 우수한 간편식 된장을 제조하기 위해, 균주 선정, 배합 및 제조조건을 최적화하여, 기존의 즉석 된장국에 비해 풍미가 향상되어 기호도가 증진되고 간편하게 뜨거운 물만 부으면 손쉽게 섭취할 수 있는 품질이 우수한 간편식 된장의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 수침하고 증자한 대두에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 접종하여 메주로 성형하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 성형한 메주를 건조하고 염수에 침지하여 숙성시킨 후 된장을 분리하고, 상기 분리한 된장을 숙성하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 숙성시킨 된장과 물 및 설탕을 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 간편식 된장의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 간편식 된장을 제공한다.

본 발명의 간편식 된장에 첨가되는 된장은 유용 균주로 발효하여 된장의 발효 과정 동안 발생하는 유해 미생물의 증식을 억제하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않아 독성이 없는 안전한 된장을 제조할 수 있으며, 또한, 본 발명의 간편식 된장은 조미료나 식품첨가물은 일체 첨가하지 않고도 된장국의 구수한 맛과 감칠맛을 증진시키고, 따로 양념을 준비하지 않고 즉석으로 뜨거운 물만 부으면 간편하게 섭취할 수 있어, 전통식품인 된장의 섭취를 증진시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103727 균주의 16S rRNA의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM103727 균주의 계통도를 나타낸 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 수침하고 증자한 대두에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 접종하여 메주로 성형하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 성형한 메주를 건조하고 염수에 침지하여 숙성시킨 후 된장을 분리하고, 상기 분리한 된장을 숙성하는 단계; 및

(c) 상기 (b)단계의 숙성시킨 된장과 물 및 설탕을 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 간편식 된장의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 간편식 된장의 제조방법에서, 상기 (a)단계는 바람직하게는 12~24시간 동안 수침하고 110~130℃에서 100~140분 동안 증자한 대두에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 접종하여 메주로 성형할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 12~24시간 동안 수침하고 121℃에서 120분 동안 증자한 대두에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 접종하여 메주로 성형할 수 있다. 상기와 같이 수침한 후 고온에서 증자하는 것이 증자에 적합하도록 충분히 대두를 불릴 수 있으면서, 증자하는 과정에서 곰팡이나 기타 세균의 오염을 방지하고, 콩 비린내가 나지 않으면서 된장 제조에 적합한 메주로 성형할 수 있었다.

또한, 본 발명의 간편식 된장의 제조방법에서, 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103727 균주(기탁번호: KCCM12483P)로, 프로테아제(protease), 셀룰라제(cellulase), 아밀라제(amylase), 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase) 및 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase)의 세포외 효소 분비능, 혈전분해 활성, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 및 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)의 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항산화 활성 및 항당뇨 활성이 있고, 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)의 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 전통장류 유래의 균주로, (재)발효미생물산업진흥원으로부터 분양받아 메주 발효용 균주로 사용하였다.

또한, 본 발명의 간편식 된장의 제조방법에서, 상기 (b)단계는 바람직하게는 성형한 메주를 20~25℃에서 1~3개월 동안 건조하고 18~22%(w/v) 염수에 20~25℃에서 2~4개월 동안 침지하여 숙성시킨 후 된장을 분리하고, 상기 분리한 된장을 20~25℃에서 2~4주 동안 숙성할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 성형한 메주를 20~25℃에서 2개월 동안 건조하고 20%(w/v) 염수에 20~25℃에서 3개월 동안 침지하여 숙성시킨 후 된장을 분리하고, 상기 분리한 된장을 20~25℃에서 3주 동안 숙성할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 메주를 건조하는 것이 메주 겉면의 수분이 충분히 말라 유해한 세균 및 곰팡이가 번식하지 않으면서 이로운 곰팡이가 충분히 번식할 수 있었고, 또한, 상기와 같은 조건으로 숙성시켜 제조된 된장은 된장의 감칠맛 및 구수한 맛이 증진되어 품질 및 기호도가 우수한 된장을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 간편식 된장의 제조방법에서, 상기 (c)단계의 혼합은 바람직하게는 간편식 된장 총 중량 기준으로, 숙성시킨 된장 38~44 중량%와 물 52~58 중량% 및 설탕 3~4 중량%를 혼합할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 간편식 된장 총 중량 기준으로, 숙성시킨 된장 41.4 중량%와 물 55.2 중량% 및 설탕 3.4 중량%를 혼합할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 재료를 혼합하는 것이 스틱이나 튜브 형태로 소포장 시 간편하게 섭취할 수 있는 액상 형태의 간편식 된장을 제공할 수 있으며, 단맛, 짠맛 및 감칠맛이 잘 조화되어 양념을 따로 준비하지 않고도 뜨거운 물만 있으면 간편하게 된장국을 섭취할 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 간편식 된장의 제조방법은, 보다 구체적으로는

(a) 12~24시간 동안 수침하고 110~130℃에서 100~140분 동안 증자한 대두에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103727 균주(기탁번호: KCCM12483P)를 접종하여 메주로 성형하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 성형한 메주를 20~25℃에서 1~3개월 동안 건조하고 18~22%(w/v) 염수에 20~25℃에서 2~4개월 동안 침지하여 숙성시킨 후 된장을 분리하고, 상기 분리한 된장을 20~25℃에서 2~4주 동안 숙성하는 단계; 및

(c) 된장국 총 중량 기준으로, 상기 (b)단계의 숙성시킨 된장 38~44 중량%와 물 52~58 중량% 및 설탕 3~4 중량%를 혼합하는 단계를 포함할 수 있으며,

더욱 구체적으로는

(a) 12~24시간 동안 수침하고 121℃에서 120분 동안 증자한 대두에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103727 균주(기탁번호: KCCM12483P)를 접종하여 메주로 성형하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 성형한 메주를 20~25℃에서 2개월 동안 건조하고 20%(w/v) 염수에 20~25℃에서 3개월 동안 침지하여 숙성시킨 후 된장을 분리하고, 상기 분리한 된장을 20~25℃에서 3주 동안 숙성하는 단계; 및

(c) 된장국 총 중량 기준으로, 상기 (b)단계의 숙성시킨 된장 41.4 중량%와 물 55.2 중량% 및 설탕 3.4 중량%를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 간편식 된장을 제공한다. 본 발명의 방법으로 제조된 간편식 된장은 뜨거운 물을 부으면 즉석으로 된장국을 섭취할 수 있으며, 개인의 기호에 따라 두부, 고춧가루, 호박, 감자, 후춧가루 등을 첨가하여 먹을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 간편식 된장 제조

(a) 세척한 대두(원산지: 순창)를 12~24시간 동안 수침하고 120℃에서 2시간 동안 증자한 후 (재)발효미생물산업진흥원에 보관중인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103727 균주(KCCM12483P)를 분양받아, 증자한 콩 무게의 0.05%(흡광도 0.5) 접종하여 메주로 성형하였다.

(b) 상기 (a)단계의 성형한 메주를 20~25℃에서 2개월 동안 건조하고 20%(w/v) 염수에 20~25℃에서 3개월 동안 침지하여 숙성시킨 후 된장을 분리하고, 분리한 된장을 20~25℃에서 3주간 숙성시켰다.

(c) 상기 (b)단계의 숙성시킨 된장 41.4 중량%와 정제수 55.2 중량% 및 설탕 3.4 중량%를 혼합한 후 분쇄하고 포장한 후 80℃에서 30분 동안 살균하였다.

재료 및 방법

(1) 균주 분리 및 배양 조건

바실러스 균주 분리를 위하여 시중에 판매되고 있는 장류 29종 시료를 각 1 g을 취하여 멸균된 0.85% 염화나트륨 용액 9 mL에 단계별로 희석하였다. 희석액 100 ㎕을 1.5% LB 아가 배지(Luria-Bertani agar, BD Difco, Sparks, MD, USA)에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 집락의 형태 차이를 이용하여 균주를 1차적으로 선별한 후 다시 순수 배양하여 균주를 분리하였다. 순수 분리한 미생물은 10% 스킴 밀크(BD Difco, Sparks, MD, USA) 용액에 현탁하고 -80℃에서 보관하여 사용하였다.

(2) 세포외 효소 분비능 측정

발효에 적합한 균주를 선별하기 위해 분리 미생물이 균체 외로 방출하는 세포외 효소들 중 전분 분해효소(amylase), 단백질 분해효소(protease) 및 섬유소 분해효소(cellulase) 활성을 검증하였다. 각 효소와 특이적으로 반응하는 기질의 성분이 포함된 고체 배지를 이용한 한천 확산법을 사용하였다. 전분 분해 활성은 1% 가용성 전분과 2% 아가를 첨가한 전분 아가 배지를 제조하였고, 단백질 분해효소 활성을 측정하기 위해 2% 스킴 밀크에 1.5% 아가를 첨가하여 스킴 밀크 아가 배지를 제조하였다. 또한, 섬유소 분해효소(cellulase)의 활성은 Teather와 Wood의 방법에 따라 1% CMC(carboxylmethyl cellulose)에 1.5% 아가를 첨가하여 CMC 아가 배지를 제조하였고, 웰 확산(well diffusion) 방법을 이용하여 효소활성을 측정하기 위하여 각각의 배지에 8 mm의 구멍을 뚫었다. 선별된 균주는 LB 액체 배지에서 30℃, 24시간 진탕 배양하였으며, 선별 균주 배양액은 13,000 rpm로 10분간 원심 분리하여 상등액을 취하고, 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 제균한 뒤 100 ㎕씩 각각의 세포외 효소 활성 측정 배지의 구멍에 분주하여 25℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 웰 주위로 생기는 환의 크기를 측정하였다. 전분 분해효소 활성의 경우 반응 후 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색한 뒤 생기는 환의 크기를 측정하였으며, 섬유소 분해효소 활성 측정은 0.1% 콩고 레드(Conco red) 시약으로 염색한 뒤 생기는 환의 크기를 측정하였다.

(3) 선별 균주의 동정

선별균주를 동정하기 위해 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 서열 증폭을 위해 유니버설 프라이머인 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3', 서열번호 2)와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3', 서열번호 3)을 사용하였으며, NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 서열의 일치도가 높은 표준균주들의 16S rRNA 유전자 서열을 얻었다. 서열간의 상호 비교를 위해 Clustal W 2.0 program을 사용하였으며, Mega 7.0.26 program을 이용하여 계통도를 작성하였다. 계통도 분석에는 근린결합법(neighbor joining method)을 사용하였으며, 1,000회 반복을 통해 bootstrapping하여 작성한 계통도의 견고성을 확인하였다.

(4) 식품유해 미생물에 대한 항균활성 측정

식품 유해미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCCM40935, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) KCCM11814, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) KCCM43155를 한국종균협회(KCCM, Korean Culture C enter of Microorganisms)에서 분양받아 지시균주로 사용하였으며, 한천확산법에 준하여 선별한 균주의 항균활성을 조사하였다. 선별된 균주는 각각 LB 액체 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양하였으며, 배양 후 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하고 0.45 ㎛ 시린지 필터로 제균하여 사용하였다. 각 지시균주가 포함된 0.8% 아가 배지에 8 mm의 구멍을 제작한 후 각 선별 미생물 배양 상등액 100 ㎕를 분주하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 구멍 주변에 형성된 억제환의 지름을 측정하여 선발된 균주의 유해 미생물에 대한 길항능력을 확인하였다.

(5) 항산화 활성 분석

항산화 활성은 Kedare & Singh의 방법을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 0.1mM DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl in methanol) 180 ㎕에 균주 배양 상등액(Tryptic soy broth) 20 ㎕를 혼합하여 30분간 실온에서 암반응 한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 하기 식에 따라 항산화 활성을 산출하였다. 음성 대조구는 TSB 액체 배지를 사용하였으며, 측정값은 대조군과 비교하여 동일한 방법으로 처리 후 측정하였다.

항산화 활성(%) = [1-(A/B)]×100

A: Absorbance of DPPH solution with sample at 517㎚

B: Absorbance of DPPH solution without sample at 517㎚

(6) 항당뇨 활성

선별 균주의 α-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해활성을 측정하기 위해 하기 표 1에 개시한 조건으로 평가하였다. 선별 균주의 배양상등액 12.5 ㎕에 100mM PPB(potassium phosphate buffer, pH 7.0 at 37℃) 50 ㎕를 첨가한 후 0.5 U/㎖의 α-글루코시다아제 용액 12.5 ㎕를 첨가하고, 20mM PNPG(p-nitrophenyl-β-D-glucanopyranoside) 용액을 첨가하여 37℃에서 20분간 반응하였다. 이후 200mM 탄산나트륨 수용액 100 ㎕를 첨가한 후 마이크로플레이트 리더(SPARK, TECAN, Austria)를 사용하여 400 nm에서 흡광도를 측정하였으며, α-글루코시다아제 저해활성은 백분율(%)로 표시하였다.

α-글루코시다아제 저해활성 = 1-(sample volume activity/enzyme volume activity) × 100%

Enzyme volume activity(U/㎖) = (A_t1-A_b) × 0.0442

Sample volume activity(U/㎖) = (A_t2-A_b) × 0.0442

α-글루코시다아제 저해활성 측정 조건

용액	Test 1(t1)	Test 2(t2)	Blank
Mix by inversion and equilibrate to 37℃
DW	12.5㎕	-	25㎕
시료 용액	-	12.5㎕	-
100mM PPB	50㎕	50㎕	50㎕
0.5U/㎖ α-글루코시다아제 용액	12.5㎕	12.5㎕	-
20mM PNPG	25㎕	25㎕	25㎕
200mM 탄산나트륨 용액	100㎕	100㎕	100㎕

(7) 바이오제닉 아민(Biogenic amines) 생성

선별 균주의 바이오제닉 아민 생성 확인용 고체 배지는 0.25% 글리세롤, 0.006% 브로모크레솔 퍼플(bromocresol purple) 및 0.1% 히스티딘 또는 티로신이 포함된 LB 아가 배지를 제조하여 사용하였다. 선별 균주를 각 배지에 획선 도말 후 37℃에서 24시간 배양 후 대조구인 일반 LB 배지와 발색 정도를 비교함에 따라 바이오제닉 아민의 생성 여부를 확인하였다.

(8) API ZYM 키트를 이용한 효소활성 분석

선별 균주의 효소 생성 여부를 조사하기 위해 총 20종의 각종 효소의 기질 이용성을 기초로 제작된 API ZYM 키트(bioMeriux Co., France)를 사용하였다. 선별 균주를 LB 고체 배지에서 배양한 후 균체를 회수하여 0.85% NaCl 용액에 현탁해 Macfarland로 탁도 5~6으로 조정하였다. API ZYM 키트의 각 튜브에 현탁액을 분주하고 37℃에서 4시간 배양한 후 ZYM-A 및 ZYM-B 시약을 각 튜브에 한 방울씩 떨어뜨리고 5분간 실온에서 반응시켜 색 변화로 각각의 기질 효소에 대한 활성 여부를 판독하였다. 색의 변화 정도에 따라 0~5까지 값으로 표시하였으며, 0은 음성반응, 5 (=40 nanomoles)는 최대 강도의 반응이고 4~1은 각각 30, 20, 10 및 5 nanomoles의 중간 값을 나타내며 3 이상일 경우 양성으로 판정하였다.

(9) API 50 CH 키트를 이용한 당 이용성 분석

선별 균주의 당 이용성을 확인하기 위하여 총 49종의 탄수화물 이용성을 기초로 제작된 API 50 CH 키트(BioMerieux, France)를 사용하였다. 선별 균주를 5 ㎖의 LB 액체 배지에 계대배양하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 배양액 1 ㎖을 13,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 세포 펠렛만 회수하여 PBS(phosphate buffered saline, 0.1M, pH 7.0)로 2회 세척한 뒤 실험에 사용하였다. McFarland(BioMerieux)로 탁도 2로 조정하여 현탁액을 제조하였고, API 50 CHB/E 배지에 현탁한 균주 배양액 1 ㎖을 첨가 후 혼합하여 API 50 CH 스트립에 120 ㎕씩 분주하고 37℃ 배양기에서 24시간 및 48시간 동안 배양한 후 각각의 당 발효패턴을 비교하였다. 당 발효 패턴은 튜브의 색 변화를 확인하여 양성 및 음성으로 판독하였다.

(10) 혈전분해 활성 측정

혈전분해 활성은 피브린 플레이트 방법(fibrin plate method)에 준하여 측정하였다. 구체적으로, 50U/㎖의 트롬빈(thrombin) 용액 100 ㎕를 90mm 페트리 디쉬에 분주한 후, 0.5% 피브리노겐 용액(in 67mM sodium phosphate buffer) 10 ㎖과 1.0% 아가로오스 용액 10 ㎖을 순서대로 첨가하여 혈전이 골고루 형성되도록 혼합하였다. 상온에서 10~30분간 방치하면서 배지를 응고시킨 후 시료 주입을 위해 8 mm 구멍을 제작하여 형성된 구멍에 균주 배양액 100 ㎕를 주입하여 30℃에서 24시간 반응시켰으며, 구멍 주변에 혈전이 분해되어 형성된 환의 직경을 측정하여 혈전 용해능을 측정하였다.

실시예 1. 된장 제조를 위한 균주 선발

장류 29종에서 총 164종의 바실러스(Bacillus) 속 균주를 분리하였으며, 이 중 식품 원료로 사용가능하며, 바이오제닉 아민을 생성하지 않고, 세포외 분비효소활성, 유해미생물에 대한 항균활성, 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 혈전분해 활성이 우수한 SRCM103727 균주를 선별하였으며, 선별된 SRCM103727 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1, 도 1)을 분석하였으며, 결과를 바탕으로 NCBI BLAST 검색 결과, SRCM103727 균주는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)와 99%의 상동성을 나타내었으며, 표준 균주의 16S rRNA 염기서열을 토대로 계통수(phylogenetic tree)를 작성한 결과, 바실러스 서틸리스 NBRC13719와 가장 가까운 근연관계로 확인되었다(도 2). 최종적으로, 선별된 균주를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103727로 명명하였고, 2019년 04월 04일 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12483P를 부여받았으며, 이를 된장 제조를 위한 균주로 최종 선정하였다.

실시예 2. SRCM103727 균주의 특성 분석

최종 선별한 SRCM103727 균주의 세포 외 효소활성을 확인하였다. 그 결과, 아밀라아제, 프로테아제 및 셀룰라아제 활성이 모두 우수하였으며(표 2), API ZYM 키트를 이용하여 다양한 세포 외 효소 활성을 확인하였을 때, 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase) 및 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase) 활성이 있음을 확인하였다(표 3).

또한, 최종 선별한 SRCM103727 균주가 식품 유해미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCCM40935, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) KCCM11814, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) KCCM43155에 대해 우수한 항균 활성을 나타내었고, 항산활 활성 및 혈전분해 활성이 있으며 바이오제닉 아민인 히스타민 및 티라민을 생성하지 않는 것을 확인하였다(표 2). 뿐만 아니라 SRCM103727 균주가 α-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해활성이 있는 것을 통해 항당뇨 활성도 있음을 확인하였다(표 2). API 50 CH 키트를 사용하여 SRCM103727 균주의 당 이용성을 확인한 결과, 글리세롤(Glycerol, GLY), L-아라비노오스(LArabinose, LARA), 글루코오스(Glucose, GLU), D-만노오스(D-Mannose, MNE), 이노시톨(Inositol, INO), 만니톨(Mannitol, MAN), 솔비톨(Sorbitol, SOR), 셀로비오스(Cellobiose, CEL) 및 말토오스(Maltose, MAL)를 탄소원으로 이용할 수 있음을 확인하였다(표 4).

SRCM103727 균주의 세포 외 효소활성, 항균 활성, 항산화 활성, 혈전분해 활성, 바이오제닉 아민 생성 및 항당뇨 활성 확인

세포외 효소활성(mm)	아밀라아제	22
	프로테아제	19
	셀룰라아제	26
항균 활성(mm)	바실러스 세레우스 KCCM40935	17
	엔테로코커스 패칼리스 KCCM11814	20
	리스테리아 모노사이토제네스 KCCM43155	12
항산화 활성(%)		48.52
혈전분해 활성(mm)		17
바이오제닉 아민(히스타민 또는 티라민) 생성		ND
항당뇨 활성(%)		30.97

ND: 미검출

SRCM103727 균주의 API ZYM 키트를 이용한 효소 활성 확인

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-

1: alkaline phosphatase; 2: esterase(C4); 3: esterase lipase(C8); 4: lipase(C14); 5: leucine arylamidase; 6: valine arylamidase; 7: cystine arylamidase; 8: trypsin; 9: α-chymotrypsin; 10: acid phosphatase; 11: naphthol-AS-BI-phosphohydrolase; 12: α-galactosidase; 13: β-galactosidase; 14: β-glucuronidase; 15: α-glucosidase; 16: β-glucosidase; 17: N-acetyl-β-glucosaminidase; 18: α-nabbisudase; 19: α-fucosidase; 20: control-: 음성 반응, +: 양성 반응.

SRCM103727 균주의 API 50 CH 키트를 이용한 당 이용성 확인

당	반응	당	반응
control	-	ESC	-
GLY	+	SAL	-
ERY	-	CEL	+
DARA	-	MAL	+
LARA	+	LAC	-
RIB	-	MEL	-
DXYL	-	SAC	-
LXYL	-	TRE	-
ADO	-	INU	-
MDX	-	MLZ	-
GAL	-	RAF	-
GLU	+	AMD	-
FRU	-	GLYG	-
MNE	+	XLT	-
SBE	-	GEN	-
RHA	-	TUR	-
DUL	-	LYX	-
INO	+	TAG	-
MAN	+	DFUC	-
SOR	+	LFUC	-
MDM	-	DARL	-
MDG	-	LARL	-
NAG	-	GNT	-
AMY	-	2KG	-
ARB	-	5KG	-

GLY: Glycerol; Ery: Erythritol; DARA: D-Arabinose; LARA: L-Arabinose; RIB: Ribose; DXYL: D-Xylose; LXYL: L-Xylose; ADO: Adonithol; MDX: Methyl xyloside; GAL: Galactose; GLU: Glucose; FRU: D-Fructose; MNE: D-Mannose; SBE: Sorbose; RHA: Rhamnose; DUL: Dulcitol; INO: Inositol; MAN: Mannitol; SOR: Sorbitol; MDM: Methyl-D-mannoside; MDG: Methyl-D-glucose; NAG: N-acetyl-glucosamine; AMY: Amygdalin; ARB: Arbutin; ESC: Esculine; SAL: Salicin; CEL: Cellobiose; MAL: Malotose; LAC: Lactose; MEL: Melibiose; SAC: Sucrose; TRE: Trehalose; INU: Inulin; MLZ: Melizitose; RAF: D-raffinose; AMD: Starch; GLYG: Glycogen,; XLT: Xylitol; GEN: Gentibiose; TUR: Turanose; LYX: Lyxose; TAG: Tagatose; DFUC: D-Fucose; LFUC: L-Fucose; DARL: D-Arabitol; LARAL: L-arabitol; GNT: Gluconate; 2KG: 2, Keto-gluconate; 5KG: 5, Keto-gluconate

-: 음성 반응, +: 양성 반응.

실시예 3. 된장국 관능검사

상기 제조예 1의 간편식 된장, 제조예 1의 방법으로 간편식 된장을 제조하되, 바실러스 서브틸리스 균주 종류를 달리하여 제조한 간편식 된장을 가지고 끓는 물을 기호에 맞게 넣어 혼합한 된장국을 가지고 9점 척도법을 이용하여 30명을 대상으로 관능검사를 실시하였다. 시료검사 전 입안을 헹구도록 하였으며, 관능평가는 맛, 향, 구수한 맛, 전반적 기호도로 특성이 강할수록 높은 점수로 평가하였다.

즉석 된장국 관능검사

균주 종류	맛	향	구수한 맛	전반적 기호도
시판 된장국	5.74	5.38	6.00	5.88
바실러스 서브틸리스 SRCM103727	7.60	7.92	8.02	7.86
바실러스 서브틸리스 BCH3751	5.90	5.84	7.10	6.60

그 결과, 시판 된장국에 비해 바실러스 서브틸리스 균주를 이용한 된장으로 제조한 된장국이 모든 항목에서 더 선호하였고, 특히 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103727 균주를 이용한 간편식 된장으로 제조한 된장국이 가장 높은 기호도를 나타내었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12483P

20190404

<110> Agricultural Corporation Sunchang Sung Ga Jung Foods Co., Ltd. <120> Method for producing convenient instant Doenjang <130> PN19480 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1487 <212> DNA <213> Bacillus subtilis SRCM103727 <400> 1 ctgctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg acagatggga 60 gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag 120 actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac cgcatggttc 180 aaacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt 240 ggtgaggtaa cggctcacca aggcaacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca 300 cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca 360 atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag 420 ctctgttgtt agggaagaac aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga cggtacctaa 480 ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540 gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc 600 cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt 660 ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc 720 gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga 780 taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt 840 agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact 900 caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 960 cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc 1020 gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080 aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa 1140 ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1200 atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt 1260 taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320 agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380 tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt 1440 taggagccag ccgccgaagg tgggacagat gattggggtg aagtcgt 1487 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

삭제
삭제
(a) 12~24시간 동안 수침하고 110~130℃에서 100~140분 동안 증자한 대두에 프로테아제(protease), 셀룰라제(cellulase), 아밀라제(amylase), 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase) 및 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase)의 세포외 효소 분비능, 혈전분해 활성, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 및 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)의 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항산화 활성 및 항당뇨 활성이 있고, 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)의 바이오제닉 아민을 생성하지 않은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103727 균주(기탁번호: KCCM12483P)를 접종하여 메주로 성형하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 성형한 메주를 20~25℃에서 1~3개월 동안 건조하고 18~22%(w/v) 염수에 20~25℃에서 2~4개월 동안 침지하여 숙성시킨 후 된장을 분리하고, 상기 분리한 된장을 20~25℃에서 2~4주 동안 숙성하는 단계; 및
(c) 간편식 된장 총 중량 기준으로, 상기 (b)단계의 숙성시킨 된장 38~44 중량%와 물 52~58 중량% 및 설탕 3~4 중량%를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 간편식 된장의 제조방법.
삭제
제3항의 방법으로 제조된 간편식 된장.