KR102239073B1 - 멸치 발효액으로부터 분리된 신규 바실러스 벨레젠시스 l2 균주 및 이를 이용하여 제조된 액젓 - Google Patents
멸치 발효액으로부터 분리된 신규 바실러스 벨레젠시스 l2 균주 및 이를 이용하여 제조된 액젓 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 락토오스(Lactose), 아미그달린(Amygdalin), 멜리바이오스(Melibiose) 및 겐티오비오스(gentiobiose)에 양성반응을 나타내며, 단백질 분해활성이 우수한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM12498P) 및 이를 이용하여 제조된 액젓에 관한 것이다.
본 발명에서 선별하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P)는 액젓 발효의 종균으로 이용되어, 알레르기 반응이나 염증에 관여하는 성분인 히스타민의 생성량을 최소화 시킬 수 있고, 총 질소 및 아미노태 질소의 생성량을 증대시켜, 풍미를 개선시킬 수 있다.
본 발명에서 선별하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P)는 액젓 발효의 종균으로 이용되어, 알레르기 반응이나 염증에 관여하는 성분인 히스타민의 생성량을 최소화 시킬 수 있고, 총 질소 및 아미노태 질소의 생성량을 증대시켜, 풍미를 개선시킬 수 있다.
Description
본 발명은 멸치 발효액으로부터 분리된 신규 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis)L2 (KCCM12498P)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 락토오스(Lactose), 아미그달린(Amygdalin), 멜리바이오스(Melibiose) 및 겐티오비오스(gentiobiose)에 양성반응을 나타내며, 단백질 분해활성이 우수한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM12498P)에 관한 것이다.
액젓은 김치와 더불어 우리나라의 대표적인 발효식품의 하나로 예로부터 계절에 관계없이 고단백질과 염분을 공급하기 위해 이용되어 왔다.
구체적으로, 액젓은 넓은 의미의 염장품으로서, 어패류를 염장하여 숙성발효시킨 다음 상징액을 분리 여과하여 수득한 것으로, 어패류의 근육, 내장, 알 등에 소금을 첨가한 다음, 특정 종균을 투입시켜 발효되게 함으로써, 각종 아미노산이 생성되어 특수한 풍미 및 감칠맛을 낼 뿐 아니라, 아미노산이나 무기성분이 풍부하여 영양적으로 뛰어나며, 저분자들로 구성되어 있어 소화흡수율 또한 양호하다고 알려져 있다.
이러한, 액젓은 일반적으로 발효기간이 대게 3개월 내지 24개월의 기간 소요되므로 생산효율이 떨어지는 문제점을 지니고 있어, 액젓의 생산효율을 증대시키기 위해서는, 높은 활성의 단백질 분해능을 지닌 단백질 가수분해 효소가 생성되는 균주를 개발하는 것이 필요하다.
또한, 종래의 액젓에는 바이오제닉 아민 성분 중의 하나인 히스타민이 소정 함유량 이상 함유되어 있는데, 이 히스타민은 알레르기 반응이나 염증에 관여하는 성분으로 알려져 있으며, 다량으로 생성된 히스타민을 함유하는 어패류 식품을 섭취할 경우, 두통이나 두드러기, 발작을 수반하는 급성 중독을 일으키는 문제점을 지니고 있으므로, 히스타민의 생성량을 최소화시킬 수 있는 새로운 균주의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 이러한 필요성에 의해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 단백질 분해능이 우수하고, 액젓 발효의 종균으로 이용되어 유리 아미노산의 함량을 증가시킬 수 있으며, 히스타민의 생성량을 최소화시킬 수 있는 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 제조한 액젓을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 16S rRNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis)로서, 멸치 발효액으로부터 분리되고, 단백질 분해활성을 지니는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)는 락토오스(Lactose), 아미그달린(Amygdalin), 멜리바이오스(Melibiose) 및 겐티오비오스(gentiobiose)에 양성반응을 나타낸다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)는, 어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 이용되어, 휘발성 염기질소 및 히스타민의 생성량을 억제시킨다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)는, 어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 이용되어, 총 질소 및 아미노태 질소의 함유량을 증대시킨다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)는, 어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 이용되어, 단맛 계열 아미노산 및 감칠맛 계열 아미노산의 함유량을 증대시킨다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)는, 어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 이용되어, 세린(Serine), 글루타민산(Glutamic acid), 발린(Valine) 및 프롤린(Proline)을 포함하는 아미노산의 함유량을 증대시킨다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis)L2 (KCCM 12498P), 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P)의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 액젓 발효용 종균 조성물을 제공하며, 상기 액젓 발효용 종균 조성물을 첨가하여 제조된 액젓을 더 제공한다.
본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 가진다.
본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)에 의하면, 표준균주인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) LMG 22478과 비교하여, 약 1.5배 높은 단백질 분해활성을 지니고 있어, 액젓 제조를 위한 종균으로 이용시, 발효기간을 단축시킬 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)에 의하면, 알레르기 반응이나 염증에 관여하는 성분인 히스타민의 함유량과 신선도 지표가 되는 성분인 휘발성 염기질소의 함유량이 획기적으로 감소되어 고품질의 액젓을 제공할 수 있는 이점을 지닌다.
또한, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)에 의하면, 단맛 계열 아미노산 및 감칠맛 계열 아미노산의 함유량이 증대된 액젓을 제조할 수 있어, 맛의 기호도를 개선시킬 수 있는 장점을 지닌다.
도 1은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)를 배지에서 배양시킨 것을 보여주는 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)의 단백질 분해능을 나타내는 투명환 생성여부 실험 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)의 그람 염색 결과를 광학 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)의 유전학적 계통수(Phylogenetic tree)를 나타낸 그림이다.
도 5는 염 농도별로 배양된 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)의 16S rRNA 염기서열을 확인한 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)의 염 농도별 생균수를 확인한 그래프이다.
도 7은 염 농도별로 배양된 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)의 단백질 분해 활성을 확인한 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)의 단백질 분해능을 나타내는 투명환 생성여부 실험 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)의 그람 염색 결과를 광학 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)의 유전학적 계통수(Phylogenetic tree)를 나타낸 그림이다.
도 5는 염 농도별로 배양된 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)의 16S rRNA 염기서열을 확인한 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)의 염 농도별 생균수를 확인한 그래프이다.
도 7은 염 농도별로 배양된 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)의 단백질 분해 활성을 확인한 그래프이다.
본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.
이하, 첨부한 도면에 도시된 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명은 16S rRNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)로서, 표준균주인 B. velezensis LMG 22478 및 동일 속종의 분리균인 B. velezensis J3 및 B. subtilis KCCM 11316과 비교하여, 현저하게 우수한 단백질 분해활성을 지니는 것을 특징으로 하는 신규 균주인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)를 제공한다.
본 발명에서는 전통방법으로 제조된 멸치 발효액으로로부터 우수한 균주를 스크리닝하였으며, 그 중에서 선별된 일부 콜로니에 대하여 투명환을 생성하는 것을 단백질 분해능이 있는 것으로 판단하였고, 생리적 및 생화학적 실험을 실시한 결과가 가장 우수한 균주를 선별해냄으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)는, 표준 균주인 B. velezensis LMG 22478와 달리, 락토오스(Lactose), 아미그달린(Amygdalin), 멜리바이오스(Melibiose) 및 겐티오비오스(gentiobiose)에 대한 양성반응, 다시 말해 당 이용능을 지니는 것을 확인되었다.
또한, 본 발명의 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)는, 후술할 실험예들을 통해, 어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 사용되어, 휘발성 염기질소 및 히스타민의 생성량은 억제시키고, 총 질소 및 아미노태 질소의 함유량은 증대시키는 것이 확인되었다.
그리고, 상기 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P)는 단맛 계열 아미노산 및 감칠맛 계열 아미노산의 함유량을 증대시키는 것이 확인되었는데, 보다 구체적으로는 단맛을 내는 아미노산인 세린(Serine) 및 발린(Valine), 감칠맛을 내는 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid), 달고 신맛을 내는 아미노산인 프롤린(Proline) 등을 포함하는 아미노산의 함유량을 증대시키는 것이 확인되었다.
한편, 본 발명은 상기 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis)L2 (KCCM 12498P), 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P)의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 액젓 발효용 종균 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
여기서, 종균 조성물은 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 조성물을 의미하고, 배양물은 특정 미생물을 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 배양물 및 배양물의 농축물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체 또는 고체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 액젓 발효용 종균 조성물을 첨가하여 제조된 액젓을 더 제공한다.
여기서, 상기 액젓은 예를 들면, 멸치 액젓, 까나리 액젓, 갈치 액젓, 새우 액젓, 꽁치 액젓, 조개 액젓 또는 빙어 액젓일 수 있으며, 어패류를 원료물질로 제조한 액젓이면, 그 종류에 제한되는 바가 아니다.
(실시예 1) 단백질 분해활성이 우수한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 선발 및 분리동정
1-1. 단백질 분해활성이 우수한 균주의 선발
국내 전남지역에서 생산된 멸치 발효액 원액을 TSA(Trypticase Soy Agar) 평판 배지에 100㎕ 도말하였으며, 도말한 평판 배지를 37℃에서 72시간 동안 배양하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 배지를 72시간 동안 배양한 후, 우점 균주(W)를 선별하여, L2로 명명하였다.
그리고, 분리된 L2 균주를 1%의 탈지유(skim milk)를 함유한 TSA(Trypticase Soy Agar) 평판 배지에 선조접종(스트리킹, streaking)한 다음, 48시간 동안 배양하여, 투명환 생성여부를 확인하였다.
도 2에 나태낸 바와 같이, 분리된 L2 균주는 배양과정에서 생성된 단백질 분해효소에 의해, 집락주변으로 투명환을 형성하는 것을 확인하였다.
1-2. 선별 균주의 동정
선별된 분리균주의 동정을 위하여, 일차적으로 형태학적, 생화학적 조사를 수행하였고, 최종적인 동정을 위하여 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 수행하였다.
상기 형태학적 조사는 그람 염색 여부와 현미경을 이용하여 균의 형태 및 집락의 형태 등을 관찰하는 방법으로 수행하였고, 상기 생화학적 조사는 API 50 CHB Kit(BioMerieux SA)을 이용하여 당 종류별 기질 발효여부를 조사하는 방법으로 수행하였다.
형태학적 조사 결과를 도 3에 도시하였으며, 도 3을 참조하면, L2 균주는 그람 양성의 간균인 것을 확인하였다.
또한, 생화학적 조사 결과를 하기 표 1에 나타내었는데, L2 균주의 분자생물학적 동정 후, 동일 종의 표준 균주인 B. velezensis LMG 22478에 대한 결과를 함께 비교하였다.
| Sugar | Metabolism | Sugar | Metabolism | ||
| 표준 균주 |
L2 균주 |
표준 균주 |
L2 균주 |
||
| Control | - | - | Esculin | + | + |
| Glycerol | - | - | Salicin | - | - |
| Erythritol | - | - | Cellobiose | + | + |
| D-Arabinose | - | - | Maltose | + | + |
| L-Arabinose | - | - | Lactose | - | + |
| Ribose | + | - | Melibiose | - | + |
| D-Xylose | - | - | Sucrose | + | + |
| L-Xylose | - | - | Trehalose | + | + |
| Adonitol | - | - | Inulin | - | - |
| Methyl β-D- xylopyranoside |
- | - | Melezitose | - | - |
| Galactose | - | - | Raffinose | + | + |
| Glucose | + | + | Starch | + | + |
| Fructose | + | + | Glycogen | + | + |
| Mannose | + | + | Xylitol | - | - |
| Sorbose | - | - | Gentiobiose | - | + |
| Rhamnose | - | - | D-Turanose | - | - |
| Dulcitol | - | - | D-Lyxose | - | - |
| Inositol | + | - | D-Tagatose | - | - |
| Mannitol | + | + | D-Fucose | - | - |
| Sorbitol | + | + | L-Fucose | - | - |
| Methyl α-D- mannopyranoside | - | - | D-Arabitol | - | - |
| Methyl α-D-glucoside | + | + | L-Arabitol | - | - |
| N-Acethyl-glucosamine | + | - | Gluconate | - | - |
| Amygdalin | - | + | 2-Keto-gluconate | - | - |
| Arbutin | + | + | 5-Keto-gluconate | - | - |
여기서, "+"는 양성, "-"는 음성을 의미한다.
표 1을 참조하면, 상기 L2 균주는 glucose, fructose, mannose, mannitol, sorbitol, Methyl α-D-glucoside, Amygdalin, Arbutin, Esculin, Cellobiose, Maltose, Lactose, Melibiose, Sucrose, Trehalose, Raffinose, Starch, Glycogen, Gentiobiose에 대한 당 이용능을 지니고 있는 것으로 확인 되었다.
또한, 표준균주인 B. velezensis LMG 22478와 비교하여, 상기 L2 균주는 락토오스(Lactose), 아미그달린(Amygdalin), 멜리바이오스(Melibiose) 및 겐티오비오스(gentiobiose)에 대한 당 이용능을 지니고 있는 점에서 차이가 있다.
또한, 상기 L2 균주의 정확한 동정을 위하여 16S rRNA gene분석을 통한 유전학적 동정을 실시하였다.
L2 균주의 콜로니 샘플의 16S rRNA 증폭을 위해 프라이머인 forward primer 27F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와, reverse primer 1492R(5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하여, 95℃에서 30초, 52℃에서 30초, 72℃에서 90초 총 35사이클의 조건으로, PCR(Polymerase chain reaction)을 수행한 다음 전기영동으로 증폭된 PCR product의 gene 크기를 확인한 후, NCBI genebank를 통한 시퀀싱 분석 결과를 토대로 유전학적 동정을 실시하였다.
일반 분류학상으로 97% 이상의 염기서열 상동성을 나타내는 균주들의 경우 하나의 종으로 정의할 수 있는데, 분석 결과 99%이상의 상동성으로 Bacillus velezensis로 동정되었으며, "바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2"로 명명하였다.
동정된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2는, 한국미생물보존센터에 2019년 4월 18일자로 수탁하였으며, 수탁번호 KCCM12498P를 부여 받았다.
또한, 동정된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2의 유전학적 계통수(phylogenetic tree)는 도 4와 같이 나타낼 수 있고, 16S rRNA 염기서열은 서열번호 1 및 도 5에 나타내었다.
(실험예 1) 균주의 단백질 분해활성 확인
상기 실시예 1에서 분리 및 동정된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2의 단백질에 대한 가수분해활성을 확인하였다.
보다 구체적으로, 단백질 효소 활성 실험은 Azocasein assay로 수행하였으며, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주, 표준균주인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) LMG 22478 균주, 동일 속/종의 분리균인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) J3 균주 및 바실러스 서브틸리스(Bxacillus subtilis) KCCM 11316 균주를 이용하였다.
TSB 5ml 배지에 각각의 균주를 접종하여, 37℃, 24시간 동안 배양한 다음, 배양액 1ml을 원심분리(12,000rpm, 10분, 4℃) 한 후, 상등액을 각각 회수하였다.
각 균주의 상등액 50㎕에 100mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)에 녹인 0.5% azocasein을 150㎕첨가하여 혼합하고, 30℃ 항온수조에서 1시간 반응시켰다.
이후, 2분간 정치하여 반응을 정지시킨 후, 원심분리(12,000rpm, 10분, 4℃)하였으며, 상득액 500㎕을 취하고, 525mM NaOH 700㎕를 가하여 혼합하였다.
다음, 혼합액 1ml을 48 well plate에 넣어, 432nm에서 흡광도를 측정하여, 각 균주들에 의해 생성된 단백질 분해 효소 활성을 확인하였으며, 아래 표 2에 그 결과를 나타내었다.
| 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) LMG 22478 균주 | 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주 | 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) J3 균주 | 바실러스 서브틸리스(Bxacillus subtilis) KCCM 11316 균주 | |
| unit/ml | 526 | 768 | 484 | 41 |
여기서, 효소 활성은 30℃에서 1시간 동안 432nm에서의 흡광도 0.01을 증가시킬 때, 1 unit/ml로 규정하였다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주는 단백질 분해효소의 활성이 768unit/ml로 측정되어, 가장 우수한 단백질 분해능을 지니고 있는 것으로 확인되었으며, 표준균주인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) LMG 22478 균주와 비교해보면, 약 1.5배 높은 단백질 분해 활성을 지니고 있는 것으로 확인되었다.
(실험예 2) 염 농도별 생육도 및 단백분해효소 활성 측정
상기 실시예 1에서 분리 및 동정된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주를 이용하여, 염 농도별 생육도 및 염 농도별 단백질 분해활성을 확인하였다.
보다 자세하게 설명하면, NaCl을 0, 5, 10, 15%로 달리 첨가한 TSB 배지 5ml을 제조하여 준비한 다음, 각각의 배지에 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주를 접종하여, 37℃, 24시간 배양한 후, 생균수와 단백질 분해효소 활성을 평가하였다.
생균수 확인 실험은, 배양된 배양액을 10배씩 희석하여, TSA 배지 100㎕ 도말한 후, 37℃에서 24시간 배양 후, colony 수를 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 도시된 바와 같이, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주의 염 농도별 생육도는 염 농도 5%에서 가장 적합한 것으로 확인되었다.
또한, 단백질 단백질 효소 활성 실험은 배양된 배양액을 이용하여, 실험예 1에서 실험한 Azocasein assay와 동일한 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주는 5% NaCl 배양조건에서 배양되었을 때, 가장 우수한 단백질 분해 활성을 지니는 것으로 확인되었다.
(실험예 3) 멸치 액젓 품질 확인
상기 실시예 1에서 분리 및 동정된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주를 이용하여 멸치 액젓을 제조하여, 제조된 멸치 액젓의 품질을 확인하였다.
상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주를 이용하여 제조된 멸치 액젓(시험군)과의 품질 비교를 위하여, 대조군으로 별도의 균주를 이용하지 않고 멸치 액젓을 제조하였으며, 비교군으로 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) LMG 22478 균주를 이용하여 멸치 액젓을 제조하였다.
보다 상세하게는, 수산물의 원료로 남해안에서 어획된 길이 약 17cm의 신선한 멸치를 이용하여 염수로 2회 세척한 다음, 함수율 30% 내지 55%로 반건조하여 원료물질을 준비하였다. 이후, 반건조된 멸치에 원료물질 100 중량부를 기준으로 5 중량부의 염을 첨가하여 혼합시켰다. 다음, 염이 혼합된 원료물질에 원료물질 100 중량부를 기준으로 1 중량부가 되도록, 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주를 배양한 다음 첨가하여, 50℃, 혐기 조건에서 8주 동안 발효시켜 발효물을 생성하였으며, 이후 생성된 발효물을 잔사가 제거되도록 여과하여 액젓을 제조하였다.
한편, 대조군으로는 별도의 균주를 이용하지 않았고, 비교군으로는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) LMG 22478 균주를 이용하여 액젓을 제조하였으며, 이를 제외한 액젓의 제조공정은 전술한 바와 동일하게 실시하여 대조군 액젓과 비교군 액젓을 각각 제조하였다.
3-1. 토탈 질소, 아미노태질소, 휘발성염기질소, 히스타민 함량 확인
발효기간 총 8주 동안 2주 간격으로 시험군, 대조군, 비교군에 대한 액젓 샘플 5ml을 각각 취하였으며, 이 액젓 샘플들을 이용하여, 총질소 함량, 아미노태 질소 함량, 휘발성 염기 질소(VBN, Volatile Basic Nitrogen)함량 및 히스타민 함량 을 확인하였으며, 그 결과를 아래 표 3 내지 표 5에 나타내었다.
| 대조군(균주 이용 X) | |||||
| 발효 기간 | 0주차 | 2주차 | 4주차 | 6주차 | 8주차 |
| 총질소(%) | 0.83 | 1.28 | 1.32 | 1.35 | 1.35 |
| 아미노태질소(AN, mg/100g) | 990 | 1392 | 1414 | 1436 | 1437 |
| 휘발성 염기질소(mg%) | 20.8 | 21.6 | 21.4 | 21.2 | 21.2 |
| 히스타민(ppm) | 123.4 | 128.8 | 136 | 149.1 | 155.5 |
| 비교군(바실러스 벨레젠시스LMG 22478 균주 이용) | |||||
| 발효 기간 | 0주차 | 2주차 | 4주차 | 6주차 | 8주차 |
| 총질소(%) | 0.86 | 1.48 | 1.51 | 1.55 | 1.56 |
| 아미노태질소(AN, mg/100g) | 995 | 1573 | 1609 | 1620 | 1620 |
| 휘발성 염기질소(mg%) | 20.7 | 19.4 | 17.6 | 17 | 16.8 |
| 히스타민(ppm) | 123.7 | 113.3 | 106.4 | 102.4 | 102.1 |
| 시험군(바실러스 벨레젠시스 L2 균주 이용) | |||||
| 발효 기간 | 0주차 | 2주차 | 4주차 | 6주차 | 8주차 |
| 총질소(%) | 0.84 | 1.81 | 1.86 | 1.89 | 1.89 |
| 아미노태질소(AN, mg/100g) | 989 | 1890 | 1928 | 1931 | 1932 |
| 휘발성 염기질소(mg%) | 21 | 18.3 | 15.2 | 14.6 | 14.4 |
| 히스타민(ppm) | 124.1 | 75 | 55.6 | 49.9 | 48 |
표 3 내지 표 5에 나타난 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주를 이용하여, 멸치 액젓을 제조할 경우, 약 4주차 만에 발효가 완료되므로 발효기간을 단축시킬 수 있으며, 총질소, 아미노태 질소의 함량이 높고, 알레르기 반응이나 염증에 관여하는 성분인 히스타민의 함유량과 신선도 지표가 되는 성분인 휘발성 염기질소의 함유량이 획기적으로 감소되어 고품질의 액젓으로 제공될 수 있는 이점을 지닌다.
3-2. 관능검사
8주 기간동안 발효되어 제조된 액젓(대조군, 비교군, 시험군)에 대한 관능적 기호성에 대한 평가로서, 관능검사를 실시하여 아래 표 6에 나타내었다.
여기서, 평가 항목은 전체적인 색, 향, 맛, 감칠맛, 비린맛, 후미, 종합 기호도로 하였고, 제품을 실제 사용하는 타켓 소비자 패널 30명을 대상으로 9점 척도법을 긴반으로, 관능검사를 실시하였다.
| 대조군 (균주 이용 X) |
비교군 (바실러스 벨레젠시스LMG 22478 균주 이용) |
시험군 (바실러스 벨레젠시스 L2 균주 이용) |
|
| 색 | 6.5 | 7.0 | 8.0 |
| 향 | 4.8 | 6.0 | 7.4 |
| 맛 | 3.3 | 5.6 | 7.5 |
| 감칠맛 | 4.8 | 5.0 | 7.8 |
| 비린맛 | 4.8 | 6.2 | 7.5 |
| 후미 | 4.1 | 6.1 | 7.7 |
| 종합기호도 | 4.3 | 5.3 | 7.5 |
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주에 의해 발효처리되어 제조된 멸치 액젓은, 대조군의 액젓 및 비교군의 액젓과 비교하여, 색, 향, 맛, 감칠맛, 비린맛, 후미에 대한 모든 지표에서 우수하여, 종합적인 기호도에서 우수한 것으로 조사되었다.
3-3. 유리아미노산 분석
8주 기간동안 발효되어 제조된 액젓(대조군, 비교군, 시험군)을 이용하여, 유리 아미노산의 분석을 수행하였으며, 그 결과를 아래 표 7에 나타내었다.
여기서, 유리 아미노산 분석은 자동아미노산 분석기(Hitach Amino Acid Analyzer L-8900)를 이용하여 확인하였다.
| Amino acid (mg%) | 대조군 (균주 이용 X) |
비교군 (바실러스 벨레젠시스LMG 22478 균주 이용) |
시험군 (바실러스 벨레젠시스 L2 균주 이용) |
비고 (표준균주 비교군 대비) |
| Taurine | 88.0 | 56.5 | 128.0 | |
| Aspartic acid | 10.0 | 12.8 | 24.3 | |
| Threonine | 0.0 | 0.0 | 87.9 | |
| Serine | 153.8 | 190.0 | 471.9 | 2.5배 증가,단맛아미노산 |
| Asparagine | 0.0 | 0.0 | 17.3 | |
| Glutamic acid | 423.8 | 554.0 | 923.9 | 1.7배 증가,감칠맛 |
| Glutamine | 0.0 | 0.0 | 0.0 | |
| Glycine | 139.6 | 199.1 | 3.8 | |
| Alanine | 338.5 | 420.6 | 286.6 | |
| Valine | 276.4 | 374.8 | 790.6 | 1.9배 증가,단맛아미노산 |
| Methionine | 127.0 | 184.7 | 37.4 | |
| Isoleucine | 168.2 | 270.9 | 491.1 | |
| Leucine | 284.2 | 439.8 | 618.9 | |
| Tyrosine | 94.9 | 101.7 | 227.4 | |
| Phenylalanine | 125.3 | 183.8 | 389.2 | |
| γ-Amino-n-butyric acid | 2.7 | 0.0 | 7.9 | |
| Lysine | 388.2 | 418.4 | 540.0 | |
| Histidine | 106.1 | 160.2 | 223.6 | |
| Arginine | 5.9 | 124.3 | 478.2 | |
| Hydroxyproline | 304.1 | 488.5 | 34.9 | |
| Proline | 99.4 | 109.6 | 365.0 | 3.3배 증가, 달고 신맛 |
| Total | 3,136.1 | 4,289.7 | 6,147.9 |
표 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주에 의해 발효처리되어 제조된 멸치 액젓은, 대조군의 액젓 및 비교군의 액젓과 비교하여, 단맛 계열 아미노산 및 감칠맛 계열 아미노산의 함유량이 증대된 액젓을 제조할 수 있어, 맛의 기호도를 개선시시킬 수 있었던 것으로 사료된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 균주에 의해 발효처리되어 제조된 멸치 액젓은, 표준균주인 바실러스 벨레젠시스 LMG 22478 균주에 의해 발효된 액젓과 비교하여, 단맛을 내는 아미노산인 세린(Serine)의 경우, 약 2.5배 함유량이 높으며, 감칠맛을 내는 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid)의 경우, 약 1.7배 함유량이 높고, 단맛을 내는 아미노산인 발린(Valine)의 경우, 약 1.9배 함유량이 높으며, 달고 신맛을 내는 아미노산인 프롤린(Proline)의 경우, 약 3.3배 함유량이 높은 것으로 확인되었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM1 2498P) 균주 및 이 균주에 의해 제조된 액젓에 의하면, 표준균주인 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) LMG 22478과 비교하여, 약 1.5배 높은 단백질 분해활성을 지니고 있어, 액젓 제조를 위한 종균으로 이용시, 발효기간을 단축시킬 수 있으며, 알레르기 반응이나 염증에 관여하는 성분인 히스타민의 함유량과 신선도 지표가 되는 성분인 휘발성 염기질소의 함유량이 획기적으로 감소되고, 동시에, 단맛 계열 아미노산 및 감칠맛 계열 아미노산의 함유량이 증대된 고품질의 액젓을 제공할 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 바람직한 실시예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.
<110> Jeonnam Bioindustry Foundation
<120> Novel Bacillus velezensis L2 separated from fermented broth of
anchow and Fish sauce prepared by using the same
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<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1517
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> Bacillus velezensis
<400> 1
ttagagtttg attcaggctc aggacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga 60
gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt 120
aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg atggttgttt 180
gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg 240
cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag 300
agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta 360
gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt 420
ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata gggcggcacc 480
ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 540
aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt 600
ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg 660
cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca 720
ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag 780
cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg 840
ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc 900
gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat 1020
aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg ccagcattca 1140
gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atgggcagaa caaagggcag 1260
cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc gcagtctgca 1320
actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1380
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg 1440
gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg aaggtgggac agatgattgg ggtgaagtcg 1500
taacagggta aaccgta 1517
Claims (8)
16S rRNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis)로서,
멸치 발효액으로부터 분리되고, 단백질 분해활성을 지니며, 락토오스(Lactose), 아미그달린(Amygdalin), 멜리바이오스(Melibiose) 및 겐티오비오스(gentiobiose)에 양성반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P).
멸치 발효액으로부터 분리되고, 단백질 분해활성을 지니며, 락토오스(Lactose), 아미그달린(Amygdalin), 멜리바이오스(Melibiose) 및 겐티오비오스(gentiobiose)에 양성반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P).
제 1항에 있어서,
상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)는,
어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 이용되어, 휘발성 염기질소 및 히스타민의 생성량을 억제시키는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P).
상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)는,
어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 이용되어, 휘발성 염기질소 및 히스타민의 생성량을 억제시키는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P).
제 1항에 있어서,
상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)는,
어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 이용되어, 총 질소 및 아미노태 질소의 함유량을 증대시키는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P).
상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)는,
어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 이용되어, 총 질소 및 아미노태 질소의 함유량을 증대시키는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P).
제 1항에 있어서,
상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)는,
어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 이용되어, 단맛 계열 아미노산 및 감칠맛 계열 아미노산의 함유량을 증대시키는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P).
상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)는,
어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 이용되어, 단맛 계열 아미노산 및 감칠맛 계열 아미노산의 함유량을 증대시키는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P).
제 4항에 있어서,
상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)는,
어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 이용되어, 세린(Serine), 글루타민산(Glutamic acid), 발린(Valine) 및 프롤린(Proline)을 포함하는 아미노산의 함유량을 증대시키는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P).
상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)는,
어패류 원료물질을 이용한 액젓 제조의 종균으로 이용되어, 세린(Serine), 글루타민산(Glutamic acid), 발린(Valine) 및 프롤린(Proline)을 포함하는 아미노산의 함유량을 증대시키는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P).
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis)L2 (KCCM 12498P), 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) L2 (KCCM 12498P)의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 액젓 발효용 종균 조성물.
제 6항의 액젓 발효용 종균 조성물을 첨가하여 제조된 액젓.
삭제
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