KR102426030B1 - 효소 활성, 항균 활성 및 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 srcm209231 균주 및 이의 용도 - Google Patents

효소 활성, 항균 활성 및 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 srcm209231 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성과 내산성, 내담즙성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, β-글루코시다아제 활성을 지니며, 프로테아제 및 리파아제 효소를 분비하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주(기탁번호: KCCM13136P); 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물, 상기 균주를 이용한 쌈장의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 쌈장에 관한 것이다.

Description

효소 활성, 항균 활성 및 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 SRCM209231 균주 및 이의 용도{Lactobacillus brevis SRCM209231 strain having enzyme activity, antimicrobial activity and probiotics property and uses thereof}
본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성과 내산성, 내담즙성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, β-글루코시다아제 활성을 지니며, 프로테아제 및 리파아제 효소를 분비하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
우리나라에서는 옛날부터 쌈 문화가 상당히 발달하여 현대에 이르고 있다. 쌈은 갖가지 야채를 밥과 포개어 먹거나 고기 또는 다른 음식을 야채에 포개어 먹는 방법으로써, 그 쌈의 맛을 더욱 풍미있게 하기 위해서 대개 고추장, 된장 혹은 쌈장을 첨가하여 먹는 것이 일반적이다.
이와 같이 쌈은 우리나라의 전통음식으로 남녀노소 누구나가 즐기는 음식이며, 특히 현대에 있어서는 쌈이 갖는 특징, 즉 각종 야채나 산나물 등에는 각종 영양이 포함되어 있어 현대인들의 고민인 비만과 성인병 예방에 효능이 있다는 점 때문에 쌈은 건강식품으로서 주목을 받고 있다.
쌈장은 쌈과 함께 먹는 양념장을 말하는 것으로, 주로 잎채소 또는 야채와 함께 쌈을 싸서 먹을 때 먹는 것으로 널리 이용되고 있으며, 막장이나 재래식 된장을 주원료로 하고 고추장, 마늘, 생강, 후추 등의 양념 원료를 가하여 제조하는 우리나라 고유의 조미식품으로 식품공전의 분류에서는 장류 식품 중 혼합장으로 구분하고 있다.
상기와 같은 종래의 쌈장은 특히 어린이들의 입맛에 맞지 않아 쌈장을 꺼려할 뿐만 아니라 영양분이 부족하여 다양한 영양소를 고르게 섭취할 수 없다는 문제점이 있다.
한국등록특허 제0693458호에는 허브쌈장의 제조방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1580963호에는 영양 쌈장의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SRCM209231 균주 및 이를 이용한 쌈장과는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 고품질의 쌈장을 제조할 수 있는 유산균을 선별하고자 하여, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주를 분리하였고, 상기 균주는 항균 활성, 장내 상피세포 부착능 및 프로바이오틱스 특성을 가지며, 효소를 분비함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 분리한 락토바실러스 브레비스 SRCM209231 균주는 고품질의 쌈장 제조에 중요하게 사용될 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성과 내산성, 내담즙성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, β-글루코시다아제 활성을 지니며, 프로테아제 및 리파아제 효소를 분비하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주(기탁번호: KCCM13136P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 쌈장용 당화죽 발효용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 수세한 대두에 물을 가하여 침지한 후 물기를 빼고, 증자한 후 분쇄하여 증자 대두를 제조하는 단계; (2) 상기 (1)단계의 제조한 증자 대두에 곡자, 소금 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주(기탁번호: KCCM13136P) 배양액을 혼합하여 쌈장용 당화죽을 제조하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계의 제조한 쌈장용 당화죽을 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 쌈장의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 쌈장을 제공한다.
본 발명에서는 분리한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주가 항균 활성, 장내 상피세포 부착능 및 프로바이오틱스 특성을 가지며, 효소를 분비함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 분리한 락토바실러스 브레비스 SRCM209231 균주는 고품질의 쌈장 제조에 중요하게 사용할 수 있어, 관련 업계에 매우 중요한 발명으로 평가된다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성과 내산성, 내담즙성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, β-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성을 지니며, 프로테아제(protease) 및 리파아제(lipase) 효소를 분비하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주(기탁번호: KCCM13136P)를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 내산성은 pH 2.5~3.0에 대한 내산성이며, 내담즙성은 옥스갈(oxgall) 0.1~1.0%에 대한 내담즙성일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 SRCM209231 균주는 쌈장용 당화죽 발효 시 항산화 활성, PLI(Pancreatic lipase inhibitor) 활성 및 AGI(α-glucosidase inhibitor) 활성을 증진시킬 수 있어, 쌈장용 당화죽 발효에 적합한 균주로 선발한 것이다.
상기 선발된 본 발명의 SRCM209231 균주는 16S rRNA 영역의 염기서열 분석을 실시한 결과, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 동정되었다.
본 발명의 균주 락토바실러스 브레비스 SRCM209231 균주를 한국미생물보존센터에 2022년 02월 22일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM13136P).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 "항균(antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다. 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품 형태일 수 있고, 상기 식품은 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 락토바실러스 브레비스 SRCM209231 균주를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 균주는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 락토바실러스 브레비스 SRCM209231 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다. 상기 의약품은 항균물질을 함유하고 있으므로 유해 세균에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 균주는 바람직하게는 락토바실러스 브레비스 SRCM209231 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 쌈장용 당화죽 발효용 조성물을 제공한다.
상기 균주가 항균 활성, 장내 상피세포 부착능 및 프로바이오틱스 특성이 있고, 효소를 분비하는 특징을 가지며, 쌈장용 당화죽 발효 시 항산화 활성, PLI(Pancreatic lipase inhibitor) 활성 및 AGI(α-glucosidase inhibitor) 활성을 증진시킬 수 있어, 쌈장용 당화죽 발효의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한,
(1) 수세한 대두에 물을 가하여 침지한 후 물기를 빼고, 증자한 후 분쇄하여 증자 대두를 제조하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 제조한 증자 대두에 곡자, 소금 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주(기탁번호: KCCM13136P) 배양액을 혼합하여 쌈장용 당화죽을 제조하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 제조한 쌈장용 당화죽을 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 쌈장의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 쌈장의 제조방법은, 보다 구체적으로는
(1) 수세한 대두에 물을 1~3배(v/w) 가하여 10~14시간 동안 침지한 후 물기를 빼고, 110~130℃에서 20~40분 동안 증자한 후 분쇄하여 증자 대두를 제조하는 단계;
(2) 쌈장용 당화죽 총 중량 기준으로, 상기 (1)단계의 제조한 증자 대두 35~39 중량%에 곡자 28~32 중량%, 소금 13~17 중량% 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주(기탁번호: KCCM13136P) 배양액 16~20 중량%를 혼합하여 쌈장용 당화죽을 제조하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 제조한 쌈장용 당화죽을 35~40℃에서 1~3일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있으며,
더욱 구체적으로는
(1) 수세한 대두에 물을 2배(v/w) 가하여 12시간 동안 침지한 후 물기를 빼고, 121℃에서 30분 동안 증자한 후 분쇄하여 증자 대두를 제조하는 단계;
(2) 쌈장용 당화죽 총 중량 기준으로, 상기 (1)단계의 제조한 증자 대두 37 중량%에 곡자 30 중량%, 소금 15 중량% 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주(기탁번호: KCCM13136P) 배양액 18 중량%를 혼합하여 쌈장용 당화죽을 제조하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 제조한 쌈장용 당화죽을 37℃에서 2일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 쌈장을 제공한다.
이하, 본 발명의 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 쌈장 제조
(1) 세 차례 수세한 대두에 증류수를 2배(v/w) 가하여 12시간 동안 침지한 후 채반을 이용하여 30분 동안 물기를 빼고, 121℃에서 30분 동안 증자한 후 믹서기를 이용하여 분쇄하여 증자 대두를 제조하였다.
(2) 쌈장용 당화죽 총 중량 기준으로, 상기 (1)단계의 제조한 증자 대두 37 중량%에 곡자 30 중량%, 소금 15 중량% 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주(기탁번호: KCCM13136P) 배양액 18 중량%를 혼합하여 쌈장용 당화죽을 제조하였다.
상기 곡자는 증자한 소맥분에 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 접종하고, 곡을 띄워 제조한 것으로, 토박이순창식품으로부터 제공받았다.
상기 락토바실러스 브레비스 SRCM209231 균주 배양액은 락토바실러스 브레비스 SRCM209231 균주를 식품용 MRS broth에 1%(v/v) 접종 후 37℃에서 2일 동안 배양한 것이다.
(3) 상기 (2)단계의 제조한 쌈장용 당화죽을 37℃에서 2일 동안 발효하였다.
실험 재료 및 방법
1. 유산균 배양
실험에 사용된 유산균은 MRS broth(Difco Co., USA)에 1%(v/v) 접종 후 37℃에서 2일간 배양하여 실험에 사용하였다.
2. 효소활성
1) β-글루코시다아제 활성
β-글루코시다아제(β-Glucosidase) 활성 측정 배지는 MRS agar(Difco Co., USA)와 Esculin Iron agar(Difco Co., USA)를 멸균 후 1:1(v/v) 비율로 혼합하여 제조하였으며 직접법(direct method)을 이용하여 측정하였다. 제조된 배지에 유산균을 l ㎕ 루프(loop)를 사용하여 5 mm 길이로 그어준 후 37℃에서 48시간 배양하였으며 β-글루코시다아제 활성은 콜로니(colony) 주변의 색(검은색) 변화 유무에 따라 활성을 -, +로 나타내었다.
2) 용혈(Hemolysis) 활성
용혈 활성 측정 배지는 Blood agar plate(BAP, Mbcell, Korea)를 사용하였으며 직접법(direct method)을 이용하여 측정하였다. BAP 배지에 유산균을 l ㎕ 루프(loop)를 사용하여 5 mm 길이로 그어준 후 37℃에서 48시간 배양하였으며, 용혈 활성은 콜로니 주변에 형성된 투명환의 유무에 따라 활성을 -, +로 나타내었다.
3) 프로테아제(Protease)
프로테아제 활성 측정 배지는 탈지유(Difco Co., USA)와 한천(Difco Co., USA)을 각각 2%(w/v), 1.5%(w/v)가 되도록 첨가 후 멸균하여 제조하였으며 well diffusion 방법을 이용하여 측정하였다. 활성 측정을 위한 유산균 배양액은 원심분리(10,000 ×g, 10분)한 후 상등액을 0.22 ㎛ 실린지 필터로 필터링하여 사용하였다. 제조된 배지에 6 mm의 구멍을 뚫은 후 필터링한 배양 상등액 100 ㎕를 분주하였으며, 상온에서 1시간 동안 말린 후 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 프로테아제 활성은 웰 주변에 형성된 투명환의 크기(cm)로 나타내었다.
3. 프로바이오틱스 활성
1) 내산성
내산성은 pH 2.0, 2.5, 3.0(in 1N HCl(Sigma-aldrich))로 조정하여 제조한 MRS broth에 유산균을 접종(5~6 log CFU/mL)한 후 37℃에서 3시간 배양하여 유산균의 생균수와 생존율을 측정하였다.
2) 내담즙성
내담즙성은 Oxgall(Sigma-aldrich) 0.1, 0.5, 1%(w/v)을 첨가하여 제조한 MRS broth에 유산균을 접종(5~6 log CFU/mL)한 후 37℃에서 6시간 배양하여 유산균의 생균수와 생존율을 측정하였다.
4. 단백질 및 지방 분해 활성
1) 시료 준비
선발 유산균을 MRS broth(Difco Co., USA)에 1%(v/v) 접종하여 37℃에서 2일간 배양한 후 원심분리기(Sorvall Legend Micro 17R, Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA)로 원심분리(10,000 ×g, 4℃, 10분)한 후 상등액을 0.22 ㎛ 멤브레인 필터(Futecs Co., Ltd., Daejeon, Korea)로 여과하여 연육활성 분석을 위한 시료로 사용하였다.
2) 프로테아제(Protease) 활성
시료 200 ㎕에 0.65%(w/v) casein 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.5) 500 ㎕를 첨가한 후 37℃에서 10분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 TCA(trichloroacetic) 500 ㎕를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 원심분리(10,000 ×g, 4℃, 3분)하여 얻은 상등액 200 ㎕에 500 mM NaCO3와 0.5M Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 냉각한 후 원심분리(10,000 ×g, 4℃, 10분)하여 얻은 상등액의 흡광도를 660 nm에서 측정하였다. 표준물질로는 L-티로신(L-tyrosine)을 사용하였으며 시료 1 mL이 1분 동안 반응 후 카제인(casein)으로부터 유리된 티로신(1 μM)의 양을 환산하여 U/mL로 나타내었다.
3) 리파아제(Lipase) 활성
리파아제(Lipase) 활성은 Lipase activity assay kit(K722-100, Biovision)를 이용하여 측정하였으며 시료 1 mL이 1분 동안 반응 후 글리세롤(glycerol)으로부터 유리된 트리글리세리드(1 μM)의 양을 환산하여 U/mL로 나타내었다.
5. 항균 활성
항균활성 측정에 사용한 식품 유해 병원성 미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)을 LB broth(Difco Co., USA)에 1%(v/v) 접종한 후 37℃에서 2일간 배양하여 실험에 사용하였다. 활성 측정을 위한 유산균 배양액은 10,000 ×g으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 0.22 ㎛ 실린지 필터(Sartorius, Germany)로 필터링하여 사용하였다. 영양 배지(Nutrient agar)에 배양된 병원성 미생물을 106 CFU/mL 정도로 희석하여 도말한 후 배지에 6 mm의 구멍을 뚫어 필터링한 배양 상등액 100 ㎕를 분주하였다. 항균 활성은 37℃에서 1일간 배양한 후 웰(well) 주변에 형성된 투명환의 크기(cm)를 측정하였다.
6. 장 부착능
선별 유산균의 장내 상피세포 부착능을 확인하기 위해 HT-29 세포를 사용하였으며 37℃, 5% CO2 및 95% 공기 조건으로 배양하였다. 장내 부착능 실험은 24 웰 조직 배양 플레이트에 2×105 cell/well로 접종한 다음 2~3일 간격으로 배지를 교체해주었으며 세포가 완전하게 단층막을 형성될 때까지 15일 동안 분화시켜 사용하였다. 선발 유산균 4종(L4, L16, L26, L27) 및 양성대조구 LGG 균주를 MRS 액체배지에 1%(v/v) 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 후 원심분리하여 균체 회수한 후 PBS로 3번 세척하였다. 유산균 균수에 따른 부착성 변화를 측정하기 위하여 약 7 Log CFU/mL로 준비하여 현탁한 후 각 웰(well)에 넣어주었다. 이를 37℃, 5% CO2 및 95% 공기 조건에서 1시간 동안 배양한 후 부착하지 못한 균을 제거하기 위하여 PBS로 3번 세척하였고, 각 웰마다 0.05% 트리톤 X-100 1 mL씩 넣고 10분간 진탕해준 후 회수하여 MRS agar 배지에 도말하여 생균수를 측정하였다. 장내 상피세포 부착율은 아래식을 이용하여 산출하였다.
부착율(%) = (부착 균수/초기 처리균수) × 100
7. 식품 소재로 이용하기 위한 쌈장용 당화죽 제조 및 기능성 평가
1) 유산균 배양
실험에 사용된 유산균은 식품용 MRS broth에 1%(v/v) 접종 후 37℃에서 2일간 배양하여 실험에 사용하였다.
2) 대두 증자
대두는 세 차례 수세한 후 증류수를 2배(w/v) 가하여 12시간 동안 침지하였고, 채반을 이용하여 30분 동안 물기를 빼준 다음 121℃에서 30분간 증자하였다. 증자한 대두를 믹서기를 이용하여 분쇄한 후 당화죽 제조에 사용하였다.
3) 당화죽 제조
쌈장 제조를 위한 선발균주의 발효 특성 및 기능성을 확인하기 위하여 쌈장용 당화죽을 제조하였으며 곡자는 토박이순창식품으로부터 제공받아 사용하였다. 당화죽은 증자대두 37%, 곡자 30%, 유산균 배양액 18%, 소금 15%를 배합비에 맞게 첨가한 후 혼합하여 제조하였으며 대조구는 유산균 배양액 대신 물을 첨가하여 제조하였다.
4) 이화학적 특성
가) pH, 총산도
pH와 총산도는 시료 1 g을 증류수로 50배 희석한 후 자동적정기(Mettler Toledo CH/MPC227, Switzerland)를 사용하여 측정하였으며, 총산도는 0.1N NaOH를 첨가하여 pH 8.3까지 도달할 때까지 소모된 양을 젖산(lactic acid) 함량으로 산출하였다.
총 산도(%) = (V×F×A×D)/S × 100
V: 0.1 N-NaOH 용액의 적정치 소비량 (mL)
F: 0.1 N-NaOH 용액의 역가
A: 0.1 N-NaOH 용액 1 mL에 상당하는 유기산의 양 (g) (젖산 : 0.009)
D: 희석배수
S: 시료의 채취량 (g)
나) 염도
염도는 시료 10 g에 증류수 90 mL를 가하여 1분 동안 교반한 후 염도계(ATAGO, TM-30D)를 이용하여 측정하였다.
다) 아미노태 질소
아미노태 질소(amino nitrogen, AN) 함량은 자동적정기(Mettler Toledo CH/MPC227, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 시료 1 g을 비커에 취하고 증류수 50 mL를 가하고 240초 동안 진탕 혼합하여 충분히 용해한 다음 0.1N NaOH 용액으로 적정하여 pH 8.4로 하였다. 여기에 중성 포르말린(formalin) 20 mL를 가하고 20초 동안 진탕 혼합한 뒤 다시 0.1N NaOH 용액으로 pH 8.4가 되도록 중화·적정하였다.
아미노태 질소 함량(mg%) = {(0.1N NaOH 적정량×1.401×F×희석배수) / 시료량(g)} × 100
5) 당화죽 추출
당화죽에 1 g/10 mL의 농도로 증류수를 첨가한 후 30분 동안 음파처리(sonication)를 통해 추출하였고, 추출물을 원심분리기(Sorvall Legend Micro 17R, Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA)로 원심분리(10,000 ×g, 4℃, 10분)한 후 상등액을 0.22 ㎛ 멤브레인 필터(Futecs Co., Ltd., Daejeon, Korea)로 여과하여 생리활성 분석을 위한 시료로 사용하였다.
6) 생리활성
가) DPPH 라디칼 소거 활성
DPPH 라디칼 소거 활성은 시료 50 ㎕에 100 μM DPPH 용액 150 ㎕를 첨가하여 암소에서 20분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성대조구로는 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다. DPPH 라디칼 소거능은 아래의 식으로 산출하여 나타내었다.
DPPH 라디칼 소거능(%) = {(대조구 흡광도 - 시료 흡광도)/대조구 흡광도} × 100
나) ABTS 라디칼 소거 활성
ABTS 라디칼 소거 활성은 시료는 증류수를 이용해 2배 희석(v/v)하여 사용하였다. 시료 20 ㎕에 ABTS 용액 180 ㎕를 첨가하여 암소에서 2분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성대조구로는 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다. ABTS 라디칼 소거능은 아래의 식으로 산출하여 나타내었다.
ABTS 라디칼 소거능(%) = {(대조구 흡광도 - 시료 흡광도)/대조구 흡광도} × 100
다) 항비만 활성
항비만 활성인 PLI(pancreatic lipase inhibition) 활성은 Porcine pancreatic lipase(Sigma-Aldrich) 0.3 mg에 10 mM MOPS와 1 mM EDTA(pH 6.8)을 포함하는 buffer를 30 ㎕를 넣고 tris buffer(100 mM tris-HCl, 5 mM CaCl2, pH 7.0)를 850 ㎕ 첨가하여 enzyme buffer를 준비하였다. 시료 20 ㎕에 enzyme buffer 880 ㎕와 10 mM ρ-nitrophenyl butyrate(Sigma-Aldrich) 20 ㎕를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 400 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성대조구로는 orlistat(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. PLI 활성은 아래의 식으로 산출하여 나타내었다.
췌장 리파아제 억제능(%) = {1-(대조구 흡광도 - 시료 흡광도)/대조구 흡광도} × 100
라) 항당뇨 활성
항당뇨 활성인 AGI(α-glucosidase inhibition) 활성은 α-글루코시다아제(sigma, G3651-50UN)를 0.1M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 용액에 녹여 효소액(0.5 unit/mL)으로 조제하였고, 5 mM ρ-NPG(ρ-nitro-phenyl-α-glucopyranoside, sigma, N1377-5G)도 동일한 buffer에 용해하여 기질용액으로 하였다. 기질용액 40 ㎕에 시료액 20 ㎕와 효소액 40 ㎕를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 0.25M 탄산나트륨(sodium carbonate) 0.1 mL를 첨가하여 반응 정지 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조구로 아카보스(acarbose)를 사용하였으며 아래의 계산식으로 저해 활성을 평가하였다.
α-글루코시다아제 저해능(%) = {1-(시료 흡광도 - Blank 흡광도)/대조구 흡광도} × 100
8. 선별 균주의 동정 및 계통수 작성
상기 실험을 통대로 최종 선별된 유산균을 마크로젠(Seoul, Korea)에 16S rDNA sequence 분석을 의뢰하였고, 분석된 염기서열은 NCBI의 data base와 비교하여 동정하였다.
실시예 1. 효소활성 측정
유산균의 효소활성 분석 결과는 다음과 같다. 모든 균주에서 용혈성은 나타나지 않았으며, β-글루코시다아제 활성은 SRCM209231, L26 균주에서 확인되었고, 단백질 분해효소인 프로테아제 활성은 SRCM209231 균주가 가장 높게 나타났다.
유산균의 효소활성
No. 균주명 Enzyme activity(size: cm)
β-glucosidase Hemolysis Protease
1 SRCM209231 + - 1.80
2 L12 - - 1.30
3 L16 - - 1.50
4 L26 + - 1.30
실시예 2. 프로바이오틱스 활성(내산성, 내담즙성)
식품소재로 널리 활용될 수 있는 유산균을 선정하기 위해 pH 범위(pH 2.0, 2.5, 3.0) 및 oxgall의 농도(0.1, 0.5, 1.0%)에 따른 내산성과 내담즙성을 측정하였다. 내산성 측정 결과 pH 3.0에서는 초기 생균수와 비슷한 수준의 균수가 생존함을 확인하였으며, pH 2.5에서는 86~76%의 생존율을 보였으며 pH 2.0에서는 모든 균주의 생존률이 30% 이하로 감소하여 pH가 낮아질수록 생존률 또한 낮아지는 것으로 나타났다(표 2). 내담즙성은 oxgall의 첨가량이 많을수록 생존률이 낮아지는 경향을 보였으나 모든 균주에서 생존률이 95% 이상 유지되었다(표 3).
유산균의 pH별 내산성
균주명 생균수(log CFU/mL)
생존률(%)1)
pH
Control 2.0 2.5 3.0
SRCM209231 6.25±0.072)
(100.00±0.00Aa)		 1.61±0.02
(25.79±0.34Cb3))		 5.06±0.08
(80.94±1.30Bb)		 6.15±0.02
(98.39±0.37Aa)
L12 6.32±0.06
(100.00±0.00Aa)		 1.35±0.04
(21.43±0.62Dc)		 4.86±0.08
(76.88±1.28Cc)		 6.12±0.02
(96.92±0.29Bb)
L16 6.40±0.11
(100.00±0.00Aa)		 1.66±0.05
(25.96±0.74Cab)		 5.45±0.06
(85.26±0.95Ba)		 6.30±0.06
(98.50±0.93Aa)
L26 6.44±0.06
(100.00±0.00Aa)		 1.74±0.03
(26.99±0.49Da)		 5.58±0.03
(86.57±0.53Ca)		 6.35±0.04
(98.60±0.61Ba)
1) 내산성의 생존률은 Control(초기 생균수) 대비 각 pH의 생균수로 나타내었다
2) 3회 반복하여 얻은 결과를 평균±표준편차로 나타냄
3) Duncan의 다중범위 검정을 이용하여 같은 열(a, b, c, etc)과 행(A, B, C, etc)의 유의적 차이를 P<0.05 수준에서 검증함
유산균의 oxgall 농도별 내담즙성
균주명 생균수(log CFU/mL)
생존률(%)1)
Oxgall(%)
Control 0.1 0.5 1.0
SRCM209231 6.25±0.072)
(100.00±0.00Aa)		 6.16±0.01
(98.55±0.17Ba3))		 6.12±0.01
(97.91±0.16Ba)		 6.02±0.05
(96.29±0.80Ca)
L12 6.32±0.06
(100.00±0.00Aa)		 6.27±0.06
(99.22±0.96ABa)		 6.20±0.05
(98.10±0.80Ba)		 6.09±0.10
(96.37±0.17Ca)
L16 6.40±0.11
(100.00±0.00Aa)		 6.37±0.07
(99.56±1.08Aa)		 6.32±0.08
(98.79±1.24ABa)		 6.19±0.04
(96.75±0.63Ba)
L26 6.44±0.06
(100.00±0.00Aa)		 6.36±0.02
(98.70±0.31Ba)		 6.29±0.02
(97.60±0.31Ba)		 6.18±0.04
(95.90±0.62Ca)
1) 내담즙성의 생존률은 Control(초기 생균수) 대비 각 농도의 생균수로 나타내었다
2) 3회 반복하여 얻은 결과를 평균±표준편차로 나타냄
3) Duncan의 다중범위 검정을 이용하여 같은 행(A, B, C, etc)과 열(a, b, c, etc)의 유의적 차이를 P<0.05 수준에서 검증함
실시예 3. 단백질 및 지방 분해 활성
연육 활성인 프로테아제(protease)와 리파아제(lipase) 활성 모두 SRCM209231 균주가 가장 활성이 높았으며 L16, L26, L12 순으로 활성이 높은 것으로 나타났다(표 4).
유산균의 프로테아제(protease), 리파아제(lipase) 활성
균주명 Protease
(U/mL)		 Lipase
(U/mL)
SRCM209231 1.33±0.001)a2) 1.59±0.01a
L12 0.86±0.01d 1.10±0.01d
L16 1.29±0.01b 1.38±0.01b
L26 0.99±0.01c 1.14±0.01c
1) 3회 반복하여 얻은 결과를 평균±표준편차로 나타냄
2) Duncan의 다중범위 검정을 이용하여 같은 열(a, b, c, etc)의 유의적 차이를 P<0.05 수준에서 검증함
실시예 4. 항균 활성
식품산업에서 문제가 되는 병원성 미생물에 대한 항균 활성 측정 결과 모든 균주에서 병원성 미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 생육 억제 활성이 나타났다. 그 중 SRCM209231가 가장 높은 항균활성을 지님을 확인하였다.
유산균의 항균 활성(size: cm)
균주명 B.
cereus 		L.
monocytogenes 		E.
coli 		M.
luteus 		S.
aureus 		S. typlimurium
SRCM209231 1.60±
0.071)a2) 		1.60±
0.07a 		1.90±
0.07a 		1.80±
0.28a 		2.00±
0.00a 		1.50±
0.07a
L12 1.30±
0.14b 		1.40±
0.07a 		1.50±
0.14c 		1.40±
0.07b 		1.60±
0.07c 		1.10±
0.14c
L16 1.40±
0.07b 		1.50±
0.14a 		1.70±
0.07b 		1.60±
0.07b 		1.80±
0.00b 		1.30±
0.07b
L26 1.40±
0.07b 		1.50±
0.14a 		1.70±
0.00b 		1.50±
0.14b 		1.70±
0.14bc 		1.30±
0.00b
1) 3회 반복하여 얻은 결과를 평균±표준편차로 나타냄
2) Duncan의 다중범위 검정을 이용하여 같은 열(a, b, c, etc)의 유의적 차이를 P<0.05 수준에서 검증함
실시예 5. 장 부착능
유산균의 프로바이오틱스 활성을 확인하기 위하여 장 부착능을 측정한 결과 SRCM209231 균주가 78.53%로 가장 높게 나타났으며 LGG가 72%, L26, L12, L16 순으로 활성이 높은 것으로 나타났다. 이는 프로바이오틱스 활성이 우수하다고 알려진 Lactobacillus rhamnosus GG균주의 부착율 72%보다 높은 것으로 확인되어 SRCM209231 균주를 프로바이오틱스로 섭취 시 장내로 도달하여 장내 상피세포에 부착하여 장내 환경 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다. 그리하여 장부착능이 뛰어난 SRCM209231 균주를 최종 선발하여, 쌈장 당화죽 제조시 사용하고 추후 식품소재로 활용가능성을 확인하고자 하였다.
유산균의 장내 부착능
균주명 초기 생균수
(Log CFU/mL)		 반응 후 생균수
(Log CFU/mL)		 부착율(%)
SRCM209231 7.05±0.071)bc2) 5.54±0.05a***3) 78.53±0.64a
L12 7.10±0.05abc 2.94±0.06d*** 41.41±0.85d
L16 7.02±0.06c 2.84±0.09d*** 40.46±1.28d
L26 7.19±0.09ab 3.15±0.04c*** 43.76±0.49c
LGG4) 7.21±0.09a 5.22±0.08b*** 72.45±1.04b
1) 3회 반복하여 얻은 결과를 평균±표준편차로 나타냄
2) Duncan의 다중범위 검정을 이용하여 같은 열(a, b, c, etc)의 유의적 차이를 P<0.05 수준에서 검증함
3) Levene's t-test를 이용하여 같은 행(생균수)의 평균 차이를 ** P<0.01, *** P<0.001 수준에서 검증함
4) Lactobacillus rhamnosus GG
실시예 6. 식품 소재로 이용하기 위한 쌈장 당화죽의 제조
1) 당화죽의 이화학적 특성
상기의 실험을 토대로 선발된 유산균을 쌈장에 적용하기 위하여 유산균 배양액 첨가 당화죽의 이화학적 특성을 측정한 결과 모든 구간에서 숙성 후 유의적으로 pH는 감소하고 총산도는 증가하는 결과를 보였으며 염도의 경우 숙성에 따른 유의적 차이를 보이지 않았다. 한편 장류의 구수한 맛에 영향을 미치며, 장류의 일반적인 품질지표로 사용되는 아미노태질소 함량은 모든 구간에서 숙성 후 유의적으로 증가하는 경향을 보여 쌈장 적용 가능성을 확인하였다. 한편 SRCM209231 균주(359 mg%)가 대조구(409 mg%)에 비하여 낮은 함량을 보였으나 이는 유산균 배양액 첨가로 인해 당화죽의 pH가 낮아져 효소를 생산하는 미생물의 생육이 저하되거나, 단백질 분해효소의 활성이 감소하게 되어 대조구 보다 유산균 배양액 첨가 당화죽에서 상대적으로 아미노태 질소 함량이 낮게 나타난 것으로 판단된다.
유산균 배양액 첨가 당화죽의 숙성기간에 따른 이화학적 특성
이화학적 특성 균주명 숙성 전 숙성 후
pH 대조구1) 6.02±0.042) 5.50±0.08**3)
SRCM209231 4.97±0.06 4.78±0.04*
총산도
(젖산,%)		 대조구 0.74±0.01 1.95±0.02***
SRCM209231 1.26±0.02 2.17±0.02***
염도
(%)		 대조구 14.30±0.21 14.00±0.07
SRCM209231 14.10±0.28 13.70±0.07
AN
(mg%)		 대조구 116.15±4.20 409.04±9.76***
SRCM209231 130.06±6.99 359.23±10.99***
1) 대조구는 유산균 배양액 대신 증류수를 첨가
2) 3회 반복하여 얻은 결과를 평균±표준편차로 나타냄
3) Levene's t-test를 이용하여 같은 행(숙성 유무)의 평균 차이를 * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 수준에서 검증함
2) 당화죽의 생리활성
쌈장 개발을 위한 유산균 배양액 첨가 당화죽의 생리활성을 측정한 결과 항산화 활성인 DPPH, ABTS 라디칼 소거능과 항비만(PLI), 항당뇨(AGI) 활성은 숙성 전에 비하여 숙성 후 유의적으로 증가하였다. 그 이유는 쌈장 제조 시 당화죽의 발효에 관여하는 다양한 미생물이 생산하는 효소 등으로부터 생리활성물질들이 유래하는 것으로 추정된다. 특히 모든 생리활성 실험에서 유산균 배양액 첨가 당화죽이 대조구에 비하여 생리활성이 증가하였는데, 이는 유산균으로부터 발생되는 대사산물들로 인하여 생리활성이 높게 측정되었을 것으로 추정되지만 보다 정확한 원인 규명을 위해서는 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다. 따라서 이를 통하여 유산균 당화죽을 활용하여 장류제품을 제조하였을 경우 항산화, 항비만, 항당뇨 소재로의 활용이 가능할 것으로 사료된다.
유산균 배양액 첨가 당화죽의 숙성기간에 따른 생리활성
생리활성 균주명 숙성 전 숙성 후 양성대조구
DPPH 라디칼
소거능(%)		 대조구1) 50.57±1.502) 57.78±1.65***3) Ascorbic acid
IC50:4.24 ㎍/mL
SRCM209231 50.75±2.01 65.72±1.10a***
ABTS 라디칼
소거능(%)		 대조구 64.04±1.00 75.17±0.66*** Ascorbic acid
IC50:9.18 ㎍/mL
SRCM209231 64.74±1.11 77.19±1.22***
PLI 활성
(%)		 대조구 24.69±0.67 39.08±0.64*** Orlistat
IC50:1.62 ㎍/mL
SRCM209231 26.11±1.50 48.03±0.79***
AGI 활성
(%)		 대조구 33.45±0.35 39.71±0.68*** Acarbose
IC50:1.62 ㎍/mL
SRCM209231 35.90±0.29 42.99±0.84***
1) 대조구는 유산균 배양액 대신 증류수를 첨가
2) 3회 반복하여 얻은 결과를 평균±표준편차로 나타냄
3) Levene's t-test를 이용하여 같은 행(숙성 유무)의 평균 차이를 * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 수준에서 검증함
실시예 7. 선발유산균의 동정
최종 선발된 유산균 SRCM209231 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석(서열번호 1)한 결과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 판명되었고, 최종적으로 락토바실러스 브레비스 SRCM209231으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2022년 02월 22일에 기탁하였다(KCCM13136P).
결과적으로, 다양한 식품에 소재로 적용 가능한 유산균을 선별하기 위하여 연육작용(단백분해, 지방분해), 프로바이오틱 활성(내산성, 내담즙성, 장부착능), 항균활성 및 생리활성이 뛰어난 유산균을 선발하고자 하였다. 그 결과 선발된 유산균은 농도별 내산성과 내담즙성, 효소활성, 항균활성 및 장부착능 실험으로 다양한 식품소재에 적용가능한 유산균으로서 가능성을 다시 한번 확인하였다. 추후 실제로 산업화 하기 위해서는 실제 개발하고자 하는 제품(쌈장 등)에 적용하기 위한 품질분석 및 생리활성분석 결과, 최종적으로 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주를 선발하였다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM13136P 20220222
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Claims (8)

  1. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 유해 미생물에 대한 항균 활성과 내산성, 내담즙성 및 장내 상피세포 부착능이 있고, β-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성을 지니며, 프로테아제(protease) 및 리파아제(lipase) 효소를 분비하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주(기탁번호: KCCM13136P).
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 쌈장용 당화죽 발효 시 항산화 활성, PLI(Pancreatic lipase inhibitor) 활성 및 AGI(α-glucosidase inhibitor) 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주.
  4. 제1항 또는 제3항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)에 대한 항균용 조성물.
  5. 제1항 또는 제3항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는, 쌈장용 당화죽 발효용 조성물.
  6. (1) 수세한 대두에 물을 가하여 침지한 후 물기를 빼고, 증자한 후 분쇄하여 증자 대두를 제조하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계의 제조한 증자 대두에 곡자, 소금 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주(기탁번호: KCCM13136P) 배양액을 혼합하여 쌈장용 당화죽을 제조하는 단계; 및
    (3) 상기 (2)단계의 제조한 쌈장용 당화죽을 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 쌈장의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    (1) 수세한 대두에 물을 1~3배(v/w) 가하여 10~14시간 동안 침지한 후 물기를 빼고, 110~130℃에서 20~40분 동안 증자한 후 분쇄하여 증자 대두를 제조하는 단계;
    (2) 쌈장용 당화죽 총 중량 기준으로, 상기 (1)단계의 제조한 증자 대두 35~39 중량%에 곡자 28~32 중량%, 소금 13~17 중량% 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM209231 균주(기탁번호: KCCM13136P) 배양액 16~20 중량%를 혼합하여 쌈장용 당화죽을 제조하는 단계; 및
    (3) 상기 (2)단계의 제조한 쌈장용 당화죽을 35~40℃에서 1~3일 동안 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 쌈장의 제조방법.
  8. 제6항 또는 제7항의 방법으로 제조된 쌈장.
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