KR100979448B1 - 유청 단백질 가수분해물과 프로바이오틱(ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ) 유산균을 첨가한 기능성 음료 및그의 제조방법 - Google Patents
유청 단백질 가수분해물과 프로바이오틱(ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ) 유산균을 첨가한 기능성 음료 및그의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유청 단백질 가수분해물과 프로바이오틱 (probiotic) 유산균을 첨가한 기능성 식품 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항산화 효과를 가지는 유청 단백질 가수분해물 및/또는 생리 활성 펩타이드들을 생산하는 데 유용한 프로바이오틱 유산균을 유효성분으로 함유하는 기능성 건강음료 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 유청 단백질 가수분해물을 첨가한 건강식품은 항산화 효과에 더하여 항종양 및 DNA 손상 억제 효과가 탁월할 뿐만 아니라 프로바이오틱의 작용으로 다양한 생리활성 펩타이드가 생성될 수 있으므로, 인체의 면역력을 효과적으로 강화시키는 기능성 식품 및 음료 등으로 널리 개발될 수 있다.
유청 단백질 가수분해물, 프로바이오틱 (probiotic) 유산균, 항산화 효과, 기능성 건강음료, 생리활성 펩타이드
Description
본 발명은 유청 단백질 가수분해물과 프로바이오틱 (probiotic) 유산균을 첨가한 기능성 식품에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항산화 효과를 가지는 유청 단백질 가수분해물 및/또는 생리 활성 펩타이드들을 생산하는 데 유용한 프로바이오틱 유산균을 유효성분으로 함유하는 기능성 건강음료 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
유청은 우유로부터 치즈의 제조 시에 형성되는 커드를 수확하고 남는 액체를 지칭한다. 이러한 유청이 제대로 처리되지 못하는 경우 식품 자원의 손실과 환경 및 경제적 부담을 초래할 수 있다. 또한 현재 웰빙 추세와 함께 치즈의 소비가 증가하고 있고, 이와 더불어 농가형 치즈를 제조하려는 움직임도 활발하다. 이와 같이 치즈 생산이 증가하면서 유청은 공해 요인으로 크게 작용할 수도 있으나, 이를 이용하여 식품 등을 개발하면 다양한 산업에서 가치있는 소재로 이용될 수 있다.
실제로, 유청 단백질은 용해성, 점성, 보수성, 기포 생성, 유화 그리고 젤 생성 등을 포함하는 넓은 범위의 기능성을 제공한다. 또한, 유청 단백질 제품은 pH 변화에 안정되어 광범위한 pH 에서 용해성을 보유할 수 있다. 이와 같은 특성으로 인해 유청 단백질은 넓은 범위의 식품에서 응용되는 기능성 소재로 널리 개발될 수 있는 장점을 가진다. 또한, 유청 단백질의 가수분해는 영양적 특성과 조직을 개선시키고 품질 저하를 억제하며 조직을 개선시키는 효과가 있다. 구체적으로 천연 상태의 단백질은 그 기능성이 제한적이지만, 프로테아제 (protease) 등에 의해 가수분해되어 얻어지는 생리활성 펩타이드는 영양학적 및 기능적 특성을 부가적으로 소지하게 됨으로써, 부가가치 높은 건강식품 및 의약품을 제조하는데 유용하게 사용할 수 있다.
이러한 유청 단백질에서 가수분해된 펩타이드는 다양한 세포화학적 (cytochemical) 연구를 통하여 암세포의 증식을 억제하는데 관여할 수 있다는 것이 입증되어 있다. 또한, 프로바이오틱 유산균를 함유하는 가수분해된 유청단백질 (WPC)은 각종 식품들에 첨가되어 칼슘 흡수를 촉진하고 성장을 유도하는 기능으로 아동과 노인을 비롯한 소비자에게 중요한 역할을 할 수 있다. 구체적으로 생리활성 펩타이드를 이용하는 식품을 개발하기 위하여, 유청 단백질에 필요한 효소들과 프로바이오틱 유산균을 첨가하여 ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 저해효과를 나타내는 알파-락토핀 (α-lactorphin)과 베타-락토핀 (β-lactorphin)을 생성하고, 또한 알파-락토알부민 (α-lactalbumin)에서 유래하는 가수분해물인 펩타이드도 생산할 수 있다. 이외에도 베타-락토글로불린 (β-lactoglobulin)에서 유래되 는 가수분해 펩타이드도 역시 ACE 저해효과를 나타낸다. 특히 알파-락토알부민으로부터 유래한 알파-락토핀은 인체의 말초 혈액 임파구(peripheral blood lymphocytes, PBL)를 증식시켜 면역력을 강화시키는 작용을 가지므로, 이에 관한 많은 연구들이 이루어지고 있다. 이 때 가수분해된 펩타이드를 생성하기 위해서는 반응 조건이 최적화되고 적합한 기능성을 보유해야 한다.
프로바이오틱 (probiotic), 즉 생균제는 '생명을 위하여 (for life)' 라는 의미의 그리스어로부터 유래한 것이다. 처음에는 생균제가 '원생동물에 의하여 생성된 물질로서 다른 원생동물의 생장을 촉진시키는 것'으로 정의되었고, 그 후에 '장내 미생물 균형에 기여하는 미생물과 물질'로 다시 정의되었으나, 이는 항생제를 포함하는 의미를 가지므로 만족할만한 것이 되지 못하였다.
또한, 풀러 (Fuller)는 생균제가 항생제와 미생물 촉진제를 제외한 의미의 '장내 미생물 균총의 균형을 개선시켜 숙주동물에게 유익한 살아있는 미생물 사료 첨가제'로 정의하였고, 뒤이어 '섭취 시 장내 미생물 상의 성질을 개선시켜 숙주에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물의 단독 또는 복합균주'로 다시 정의하였다. 최근 들어 유럽의 전문가들은 미생물 균총의 조정만이 아니고 작용기작까지도 포함하는 것으로 의미를 넓히고 있다. 또한, 생균제는 그 효능을 입증하는 최근의 응용 및 과학적 자료에서 식품뿐만 아니라 건강증진 효과를 보고하는 기타 응용 분야에도 사용되고 있다. 이외에도 미생물 세포뿐만 아니라 세포의 대사산물도 숙주의 건강을 증진시키는 결과들이 보고되었으나, 이에 의한 유용 효과는 현재까지 생균제의 정의에는 포함되지 않고 있다.
또한, 이 및 살미넨 (Lee 및 Salminen) 등은 생균제가 인체나 동물의 건강을 증진시키기 위하여 고안된 식품 및 사료 또는 식이첨가제에 들어있는 살아있는 미생물 제제라고 정의하였다. 이와 같은 생균제는 장내 균총을 안정화시키고 유해세균의 정착을 억제하여 부패산물의 생성을 감소 및 경감시키며 또한 변비도 억제하는 등의 기능을 갖고 있다고 알려져 있다. 따라서, 이러한 생균제를 이용하여 기능성 식품을 연구 및 개발하려는 시도들이 활발하게 이루어지고 있다. 이 때, 생균제로서 필요한 특성은 안전성, 기능성 즉 생존성, 정착성, 서식성, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, 항원 억제 활성 (antigenotoxic), 병원성 세균의 억제능, 그리고 기술적 장점 즉 관능적 특성, 안정성, 박테리오파지 저항성, 제조과정 중의 생존성 등이 우수해야 하고, 또한 GRAS (Generally Recognized As Safe) 미생물로서 장내 생존력이 커야 한다는 점이다.
유산균 (Lactic acid bacteria, LAB)은 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물로서, 오래 전부터 발효 유제품 (발효유, 치즈 등)을 포함하여 각종 장류, 김치, 발효 소시지, 의약품 및 가축의 사료첨가제에 이르기까지 그 특성에 따라 인류 생활에 광범위하게 활용되어 왔다. 지금까지 유산균의 종류로는 300 내지 400여종이 알려져 있으며, 이들 균의 형태, 발효 형식 및 산소 내성 등의 성상에 따라 락토바실러스과 (Lactobacillaceae)에 속하는 스트렙토코커스 속 (Streptococcus), 류코노스톡 속(Leuconostoc), 페디코커스 속 (Pediococcus), 락토바실러스 속 (Lactobacillus) 그리고 악티노마이세타과 (Actinomycetaceae)에 속하는 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium), 또한 바실러스과 (Bacillacea)에 속하는 스포로락토 바실러스 속 (Sporolactobacillus)을 포함하는 6가지 속 (genus)으로 구분된다.
이와 같은 유산균은 발효 유제품의 스타터 (starter)로 이용될 뿐만 아니라 장내 세균 균총을 안정화하고, 위장관 내 병원균의 증식을 억제하며, 혈중 콜레스테롤을 저하시키고, 특이 및 비특이 면역 반응을 유도하며, 영양소의 이용을 향상시키고, 또한 암을 퇴화시키고, 장내 효소 활성을 감소하여 결장암을 예방하는 효과를 가지며 그리고 비타민과 같은 인체 유용물질을 합성하여 영양 및 건강을 증진시키려는 등의 목적으로 광범위하게 이용되고 있다.
이에 본 발명자들은 새로운 기능성 건강식품을 개발하기 위하여 계속 연구한 결과, 유청 단백질을 프로테아제로 처리한 유청 단백질 가수분해물이 항종양, DNA 손상 억제 및 항산화 효과를 가지는 것을 조사하여 이를 첨가한 기능성 음료를 제조하고 또한 프로바이오틱 유산균도 함께 첨가하여 생리활성 펩타이드들의 작용으로 인체 면역력이 효과적으로 강화되는 것을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.
본 발명은 유청 단백질 가수분해물 및/또는 프로바이오틱 (probiotic) 유산균을 첨가한 기능성 식품 및 그의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항산화 효과를 가지는 유청 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 기능성 건강음료를 제공한다.
상기 유청 단백질 가수분해물의 최종 단백질 함량은 1.0% 이하 범위로 조절되는 것이 바람직하며, 상기 유청 단백질 가수분해물의 가수분해도는 5% 이하 범위로 조절되는 것이 바람직하고, 3 내지 4% 범위로 조절되는 것은 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 유청 단백질 가수분해물에 더하여 프로바이오틱 유산균, 설탕, 구연산, 향료 및/또는 색소를 첨가한 기능성 건강음료를 제공한다.
상기 기능성 건강음료의 바람직한 배합비는 유청 단백질 가수분해물, 프로바이오틱 유산균, 설탕, 구연산, 향료 및 색소를 각각 20.8 : 0.1 : 77.50 : 1.15 : 0.28 : 0.28의 중량비로 혼합하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 항산화 효과를 가지는 유청 단백질 및/또는 유청 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품을 제공한다. 상기 유청 단백질 가수분해물은 상기 항산화 활성에 더하여 DNA 손상 억제 및 항종양 활성을 나타낸다.
또한, 본 발명은 항산화 효과를 가지는 유청 단백질 가수분해물 및 프로바이오틱 미생물을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품을 제공한다.
상기 프로바이오틱 미생물은 생리 활성 펩타이드들을 효과적으로 생산하며 이에는 인체 면역력 강화 효능 등을 가지는 알파-락토핀 및 베타-락토핀 등이 포함된다. 상기 프로바이오틱 유산균으로는 종래에 사용되는 모든 종류의 유산균들을 선택하여 사용할 수 있으나, 락토코커스 락티스 NK34 (Lactococcus lactis NK34) 균주 및/또는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD (Bacillus polyfermenticus SCD) 균주를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 프로바이오틱 유산균은 유청 단백질 및/또는 그의 가수분해물을 포함하는 배지를 사용하여 배양하는 것이 바람직하고, 이 때 전배양 및 본배양 공정으로 나누어 종래의 회분식 배양법을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD (Bacillus polyfermenticus SCD) 균주를 사용한 경우에는 TSB 액체 배지를 사용하여 2% 접종비로 접종한 다음 37℃에서 적절한 회전속도로 진탕 배양하는 것이 바람직하며, 이 때 안티-폼(anti-foam)을 첨가하여 거품 생성을 방지하는 것도 바람직하다.
또한, 상기 기능성 식품은 기능성 건강음료인 것이 바람직하고, 상기 기능성 건강음료는 상기 유청 단백질 및/또는 유청 단백질 가수분해물 그리고 상기 프로바이오틱 미생물에 더하여 설탕, 구연산, 향료 및/또는 색소를 첨가하여 조성되는 것이 바람직하다.
상기 유청 단백질 및 그의 가수분해물은 최종 단백질 함량이 1.0% 이하 범위인 것을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 유청 단백질 가수분해물은 5% 이하로 가수분해 된 것을 사용하는 것이 바람직하고, 3 내지 4% 범위로 가수분해된 것을 사용하는 것은 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 유청 단백질 가수분해물을 첨가한 기능성 건강음료의 제조방법을 제공한다.
상기 유청 단백질 가수분해물은 유청 단백질 농축액을 프로테아제 효소로 처리한 것을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 유청 단백질 농축액은 단백질 함량 65 내지 85% 범위인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 단백질 함량 70 내지 80% 범위인 것을 사용하는 것은 더욱 바람직하다. 또한, 단백질 함량 30 내지 40% 범위인 것을 사용하는 것도 바람직하고, 단백질 함량 35% 내외 범위인 것을 사용하는 것은 더욱 바람직하다. 또한, 상기 프로테아제는 뉴트라제 (neutrase), 트립신 (trypsin), 플라보자임 (flavorzyme), 알칼라제 (alcalase) 및 프로타맥스 (protamax) 중에서 선택된 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 건강음료는 국내 음료업체에서 제품의 다양화 및 고급화에 활용될 수 있고, 우유 소비가 침체되어 있는 상태에서 탄산 음료와 콜라 같은 소프트드링크와 경쟁이 가능한 유음료의 개발에 기여할 수 있다. 따라서 축산농가의 소득에 기여가 될 수 있으며 고부가가치의 기능성 유음료의 공급으로 말미암아 국민의 건강에 크게 기여할 수 있다. 이외에도 건강기능성 음료 식품으로서 두부, 국수, 라면, 햄, 스포츠 음료 등의 재료에 사용되어 모든 연령층의 기호에 맞는 제품으로 개발될 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 유청 단백질의 제조
서울우유 신갈공장에서 공급된 신선한 모짜렐라 치즈 유청을 pH 7.0으로 조정하고 70℃에서 5분 동안 열처리한 다음 50℃로 냉각하였다. 열처리된 유청은 한외여과 과정을 거쳐 다음과 같이 유청 단백질 (WPC)로 제조되었다. 이때 폴리설폰으로 된 분자량 범위 (cut off rate) 20,000 달톤인 막을 장착한 회전형 (spiral wound type) 한외여과기를 사용하였다. 상기 유청은 한외여과기의 밸런스 탱크 (balance tank)에 넣고 다양한 방식으로 부피를 줄이도록 가공되었다. 이 때 압력은 유입압력 1.5 bar와 유출압력 5 bar이 적용되었고, 온도는 50℃로 하여 세균의 증식을 억제하였다. 상기 여과 과정을 통해 투과액의 제거하여 유청을 각각 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97.5%까지 농축시킨 다음 각 요구되는 투과 액의 양에서 공정은 중지되었다. 상기에서 얻은 유청 단백질 (WPC)은 그의 종류에 따라 상기 한외여과 과정을 1단계 또는 2단계로 실시한 후 (diafiltration) 유입온도 175℃와 유출온도 70℃ 조건 하에서 분무건조기 (Buechi; 스위스)를 사용하여 분무건조시켰다.
(1) 유청 단백질-35 (WPC-35)의 제조
단백질 함량 35%인 유청 단백질 (WPC-35)은 100 ℓ 유청을 50℃에서 한외여과하여 80 내지 85 ℓ의 투과액 (permeate)을 제거한 다음 이로부터 얻어진 농축액 (retentate)을 15 내지 20 ℓ 분리하여 분무건조시켰다. 이 한외여과 과정에서는 우유로부터 유당과 수용성 염류의 대부분 그리고 수분이 유출되고 유청 단백질을 포함한 단백질 및 유지방이 농축액에 남게 된다. 전체 과정은 최종 제품의 종류에 따라 달라지는 데 상기 WPC-35 생산에는 총 6시간이 소요되었다.
(2) 유청 단백질-70 (WPC-70)의 제조
단백질 함량 70%인 유청 단백질 (WPC-70)은 100 ℓ 유청을 50℃에서 한외여과하여 95 내지 97.5%로 투과액을 제거한 다음 이로부터 얻어진 농축액을 5 내지 2.5 ℓ 분리하고 다시 동일한 부피의 물을 첨가하였다. 상기 농축액으로부터 물을 첨가하여 빼내는 한외여과 공정 (diafiltration)을 1차 실시하여 동량의 여과 물을 제거하고 그 결과 70% 단백질을 함유한 WPC-70을 제조하였다.
(3) 유청 단백질-80 (WPC-80)의 제조
단백질 함량 80%인 유청 단백질 (WPC-80)은 상기 (2) 과정과 동일한 방법으로 농축액을 얻은 다음 여기에 다시 상기 농축액의 양만큼 50℃ 증류수를 추가로 첨가하여 첨가된 증류수에 상응하는 양의 투과액을 제거하는 2차 한외여과 과정을 실시하였다. 그 결과 80% 단백질을 함유한 WPC-80을 제조하였다.
실시예 2. 유청 단백질 가수분해물의 제조
상기 실시예 1에서 제조한 유청 단백질 (WPC)과 상업적으로 판매되는 유청 단백질 분말을 사용하여 유청 단백질 가수분해물을 다음과 같이 제조하였다. 먼저 단백질분해효소로서 뉴트라제 (neutrase), 트립신 (trypsin), 플라보자임 (flavorzyme), 알칼라제 (alcalase) 및 프로타맥스 (protamax)를 사용하고 가수분해 반응은 쇼바 (Shobha, 2002)의 방법에 따라 실시하였다 (Shobba, K.P.: Diss. Univ. Agric. Sci. Bangalore, India, 2002). 각 단백질분해효소 1 ㎖에 유청 단백질 25 g의 비율로 첨가하여 온도 40℃에서 배양시간 3시간으로 반응을 실시하였다. 그 다음 가수분해 반응을 종료시키고 가수분해물은 원심분리한 후 상층액만을 분리하였다. 이로부터 얻은 WPC 가수분해물은 상기 실시예 1과 동일한 과정으로 분무건조시키고 분무건조된 가수분해물은 바로 포장하여 보존하였다.
실시예 3. 기능성 음료의 제조
본 발명의 프로바이오틱 유산균을 첨가한 기능성 건강음료를 제조하기 위하여, 유청 단백질 WPCH40에 더하여 설탕, 구연산, 향료, 색소를 첨가하여 재조합한 혼합음료의 배합비는 하기 표 1에 나타내었다. 또한 위약 (placebo)은 배합비(g) 각각 20.8, 77.50, 1.15, 0.28 및 0.28로 재조합하였고, 가수분해된 WPC와 설탕, 구연산, 향료, 색소를 첨가한 시료 1는 배합비(g) 각각 20.8, 77.50, 1.15, 0.28 및 0.28로 재조합하였고 가수분해된 WPC와 설탕, 구연산, 향료, 색소에 프로바이오틱(probiotics)을 첨가한 시료 2는 배합비(g) 각각 20.8, 77.50, 1.15, 0.28, 0.28 및 0.1로 재조합하였다.
또한, 상기 유청 단백질 가수분해물 및 프로바이오틱을 함유하는 기능성 건강음료를 제조하기 위하여, 재조합된 WPC 가수분해물의 특성 실험 및 가수분해된 유청단백질 시료(WPCH)의 생리활성 펩타이드 분석 결과를 기초로 하여 알카라제로 3시간 처리한 WPCH40을 음료의 제조에 사용하였다. 재조합된 WPC의 단백질 함량은 20%이고 음료의 단백질은 1%로 조정하였다. 배합이 끝난 음료 혼합물은 -50℃의 온도로 동결건조를 하였다. 이 때 가수분해도는 3.53%인 것으로 조사되었다.
| 위약 | 시료 1 | 시료 2 | |
| WPC | 20.80 | 0.00 | 0.00 |
| H-WPC | 0.00 | 20.80 | 20.80 |
| 설탕 | 77.50 | 77.50 | 77.40 |
| 구연산 | 1.15 | 1.15 | 1.15 |
| 향료 | 0.28 | 0.28 | 0.28 |
| 색소 | 0.28 | 0.28 | 0.28 |
| 프로바이오틱스 | 0.00 | 0.00 | 0.10 |
| 합계 | 100.01 | 100.01 | 100.01 |
실시예 4. 재조합된 건강음료의 화학적 조성
본 발명의 건강음료의 화학적 조성은 표 2에서 나타난 바와 같이 재조합된 시료의 단백질 함량이 15%에서 22%까지 증가함에 따라 총고형분 함량은 20.65 내지 30.14%로 증가하고 동시에 유당 함량은 3.72 내지 5.41%, 회분 함량은 1.04 내지 1.47% 그리고 지방 함량은 0.88 내지 1.28%로 증가하는 것을 알 수 있었다.
| 화학적 조성 (%) |
건조 WPC | 단백질 (%) (재조합된 WPC) |
|||
| 15 | 18 | 20 | 22 | ||
| 단백질 | 70.13 | 14.99 | 17.98 | 20.04 | 21.98 |
| 락토스 | 17.38 | 3.72 | 4.43 | 4.92 | 5.41 |
| Ash | 4.87 | 1.04 | 1.21 | 1.34 | 1.47 |
| Fat | 3.99 | 0.88 | 1.05 | 1.16 | 1.28 |
| T.S. | 96.58 | 20.65 | 24.67 | 27.46 | 30.14 |
실시예 5. 재조합된 건강음료의 이화학적 성질
본 발명에서는 설탕, 구연산, 향료, 색소를 첨가한 가수분해된 유청 단백질 (WPCH)을 각각 15%. 17%, 20% 및 22%의 단백질 함량으로 재조합하고, 각각 물에 희석하여 음료로 제조하였다. 재조합 정도에 따른 재조합된 WPC의 물리적 특성은 표 3에 나타내었다.
그 결과, 재조합된 WPC 시료의 pH는 단백질 함량이 높아질수록 4.96 내지 6.79로 높아지는 경향을 나타내었고, 이는 0.27 내지 0.35 범위까지 변화하는 산도와 상응하는 결과인 것을 확인하였다. 재조합된 시료들의 비중은 1.044, 1.045, 1.046 및 1.046으로 단백질 함량에 따라 증가하였다. 상기 시료들의 밀도 (bulk density)는 단백질 함량이 높아질수록 0.66 내지 0.83로 증가하였다. 이 결과로부터 재조합된 시료의 단백질 함량이 증가함에 따라 pH는 감소하였고 산도와 밀도, 비중은 증가하는 것을 알 수 있었다.
| 물리적 성질 | 단백질 (%) | |||
| 15 | 17 | 20 | 22 | |
| pH | 4.96 | 4.92 | 4.87 | 4.79 |
| TA(%) | 0.27 | 0.30 | 0.32 | 0.35 |
| 비중 | 1.004 | 1.045 | 1.046 | 1.046 |
| 밀조 | 0.66 | 0.71 | 0.77 | 0.83 |
(1)
WPC
음료의
pH
본 발명에서 WPC는 설탕, 구연산, 향료, 색소를 첨가한 위약 (placebo)과 가수분해 된 WPC와 설탕, 구연산, 향료, 색소를 첨가한 시료 1 그리고 가수분해 된 WPC와 설탕, 구연산, 향료, 색소에 프로바이오틱을 첨가한 시료 2로 재조합하였다. 또한 4℃ 냉장보관과 22℃의 온도유지가 가능한 배양기에서 0 내지 42일 동안 보관한 후 각각 물에 희석하여 pH를 측정하였다. 온도와 시료의 종류에 따라 각기 측정한 pH의 값은 표 4에 나타내었다.
그 결과, 42일 기간이 지남에 따라 위약의 pH 결과 값은 냉장보관 시 4.39 내지 4.24 범위까지 감소하였고 배양기에서 보관 시 4.39 내지 4.23로 감소하는 값을 나타내었다. 또한 시료 1의 냉장보관 시 4.27 내지 4.16로 감소하였고 배양기에서 보관 시 4.27 내지 4.14로 감소하였다. 또한 시료 2도 냉장보관 시 4.26 내지 4.11 범위까지 감소하였고 배양기에서 보관 시 4.26 내지 4.05 범위로 감소되는 값을 나타내었다. 대체적으로 냉장보관보다는 배양기 보관에서 pH 값의 변화가 큰 것을 알 수 있었고, 시료 1보다 프로바이오틱을 첨가한 시료 2에서 가장 큰 폭으로 감소하기 때문에 첨가된 프로바이오틱이 pH를 감소시키는 영향을 미친 것으로 판단되었다.
| 보관 (일) |
위약 | 시료 1 | 시료 2 | |||
| 콜드룸 | 항온기(22℃) | 콜드룸 | 항온기(22℃) | 콜드룸 | 항온기(22℃) | |
| 0 | 4.39 | 4.39 | 4.27 | 4.27 | 4.26 | 4.26 |
| 14 | 4.34 | 4.34 | 4.24 | 4.21 | 4.22 | 4.20 |
| 28 | 4.29 | 4.29 | 4.20 | 4.18 | 4.16 | 4.11 |
| 42 | 4.24 | 4.23 | 4.16 | 4.14 | 4.11 | 4.05 |
(2) WPC 음료의 산도
본 발명에서 WPC는 설탕, 구연산, 향료, 색소를 첨가한 위약과 가수분해 된 WPC와 설탕, 구연산, 향료, 색소를 첨가한 시료 1 그리고 가수분해 된 WPC와 설탕, 구연산, 향료, 색소에 프로바이오틱을 첨가한 시료 2로 재조합하였다. 또한 4℃ 냉장보관과 22℃의 온도유지가 가능한 항온기에서 0 내지 42일 동안 보관한 후 각각 물에 희석하여 측정한 TA의 값은 표 5에 나타내었다.
그 결과, 42일 기간이 지남에 따라 TA (titrable acidity) 결과 값은 위약의 냉장보관 시 0.18 내지 0.25 범위까지 증가하였고 항온기에서 보관 시 0.18에서 0.28까지 증가하였다. 또한 시료 1은 냉장보관 시 0.27에서 0.32까지 증가하였고 항온기 보관 시 0.27에서 0.36까지 증가하였다. 또한 시료 2도 냉장보관 시 0.26에서 0.35까지 증가하였고 항온기 보관 시 0.26에서 0.39까지 증가하는 값을 나타내었다. 대체적으로 냉장보관보다는 항온기 보관에서 TA의 변화가 큰 것을 알 수 있었다. 또한 시료 1보다 프로바이오틱을 첨가한 시료 2에서 가장 큰 폭으로 증가하기 때문에 첨가된 프로바이오틱이 TA를 증가시키는 영향을 미친 것으로 판단되었다.
| 보관 (일) |
위약 | 시료 1 | 시료 2 | |||
| 콜드룸 | 항온기(22℃) | 콜드룸 | 항온기(22℃) | 콜드룸 | 항온기(22℃) | |
| 0 | 0.18 | 0.18 | 0.27 | 0.27 | 0.26 | 0.26 |
| 14 | 0.20 | 0.21 | 0.28 | 0.30 | 0.29 | 0.30 |
| 28 | 0.22 | 0.24 | 0.30 | 0.33 | 0.32 | 0.34 |
| 42 | 0.25 | 0.28 | 0.32 | 0.36 | 0.35 | 0.39 |
(3)
WPC
음료의 비중
본 발명에서 WPC는 설탕, 구연산, 향료, 색소를 첨가한 위약과 가수분해 된 WPC와 설탕, 구연산, 향료, 색소를 첨가한 시료 1 그리고 가수분해 된 WPC와 설탕, 구연산, 향료, 색소에 프로바이오틱을 첨가한 시료 2로 재조합하였다. 또한 4℃ 냉장보관과 22℃의 온도유지가 가능한 항온기에서 0 내지 42일 동안 보관한 후 각각 물에 희석하여 측정한 비중의 값은 표 6에 나타내었다.
그 결과, 42일 기간이 지남에 따라 위약의 비중 값은 냉장보관 시 1.042, 1.041, 1.040 및 1.041의 값을 나타내었고 항온기에서 보관 시 1.042, 1.041, 1.039 및 1.039의 비슷한 값을 나타내었다. 또한 시료 1의 냉장보관 시 1.041, 1.042, 1.039 및 1.041의 값을 나타내었고 항온기에서 보관 시 1.041, 1.042, 1.041 및 1.042의 값을 나타내었다. 또한 시료 2도 냉장보관 시 1.042, 1.041, 1.043 및 1.040 값을 나타내었고 항온기에서 보관 시 1.042, 1.041, 1.042 및 1.040의 값을 나타내었다. 따라서 비중의 값에 큰 차이가 없는 것을 알 수 있었다.
| 보관 (일) |
위약 | 시료 1 | 시료 2 | |||
| 콜드룸 | 항온기(22℃) | 콜드룸 | 항온기(22℃) | 콜드룸 | 항온기(22℃) | |
| 0 | 1.042 | 1.042 | 1.041 | 1.041 | 1.042 | 1.042 |
| 14 | 1.041 | 1.041 | 1.042 | 1.042 | 1.041 | 1.041 |
| 28 | 1.040 | 1.039 | 1.039 | 1.041 | 1.043 | 1.042 |
| 42 | 1.041 | 1.039 | 1.041 | 1.042 | 1.040 | 1.040 |
(4)
WPC
음료의 밀도
본 발명에서 WPC는 설탕, 구연산, 향료, 색소를 첨가한 위약과 가수분해 된 WPC와 설탕, 구연산, 향료, 색소를 첨가한 시료 1 그리고 가수분해 된 WPC와 설탕, 구연산, 향료, 색소에 프로바이오틱을 첨가한 시료 2로 재조합하였다. 또한 4℃ 냉장보관과 22℃의 온도유지가 가능한 항온기에서 0 내지 42일 동안 보관한 후 각각 물에 희석하여 측정한 밀도 (bulk density)의 값은 표 7에 나타내었다.
그 결과, 42일 기간이 지남에 따라 밀도 값은 위약의 냉장보관 시 0.95, 0.96, 0.95 및 0.94를 나타내었고 항온기에서 보관 시 0.95, 0.95, 0.95 및 0.96의 각각 비슷한 값을 나타내었다. 또한 시료 1의 냉장보관 시 0.76, 0.76, 0.77 및 0.77의 값을 나타내었고 항온기에서 보관 시 0.76, 0.76, 0.77 및 0.75의 각각 비슷한 값을 나타내었다. 또한 시료 2도 냉장보관 시 0.77, 0.76, 0.76 및 0.77의 값을 나타내었고 항온기에서 보관 시 0.77, 0.76, 0.76 및 0.77의 각각 비슷한 값을 나타내었다. 따라서 밀도 값에는 큰 차이가 없는 것을 알 수 있었다. 위약에서 밀도 값이 시료 1 및 시료 2보다 높은 값을 나타낸 것은 WPCH의 가수분해 후 동결건조 시 부피가 증가했기 때문인 것으로 판단되었다.
| 보관 (일) |
위약 | 시료 1 | 시료 2 | |||
| 콜드룸 | 항온기(22℃) | 콜드룸 | 항온기(22℃) | 콜드룸 | 항온기(22℃) | |
| 0 | 0.95 | 0.95 | 0.76 | 0.76 | 0.77 | 0.77 |
| 4 | 0.96 | 0.95 | 0.76 | 0.76 | 0.77 | 0.76 |
| 28 | 0.95 | 0.95 | 0.77 | 0.77 | 0.78 | 0.76 |
| 42 | 0.94 | 0.96 | 0.77 | 0.75 | 0.77 | 0.77 |
실시예 6. 유청 단백질 가수분해물을 함유한 음료의 선호도 조사
본 발명에서는 5, 6, 7 및 8% 가수분해도로 가수분해된 WPC를 설탕, 구연산, 색소, 향료를 혼합하여 음료를 재조합하고 그 선호도를 다음과 같이 조사하였다.
그 결과, 가수분해도 6%로 가수분해된 WPC 가수분해물로부터 제조된 음료가 7 및 8%의 가수분해도를 가진 음료와 비교하여 선호도가 높게 나타났다. 6%보다 높게 가수분해할 때 관능검사의 모든 항목에서 낮은 점수를 나타냈다. 가수분해도가 5, 6, 7 및 8%로 가수분해된 WPC를 함유하는 음료는 모든 평가항목에서 7.79, 7.78, 7.52 및 7.20 점수를 나타내었다. 또한 평균 점수의 감소폭은 풍미와 감도에서 보다 유의하게 높게 나타났다. 가수분해도가 6 및 7%로 가수분해된 WPC로부터 제조된 음료수에서 풍미 (flavour)는 각각 7.78과 7.51로, 감도 (sweetness)는 각각 7.81, 7.25로 나타났다.
| 가수분해도 (%) |
감각 | |||
| 색 및 모양 | 풍미 | 감도 | 선호도 | |
| 5 | 7.78 | 7.75 | 7.83 | 7.79 |
| 6 | 7.76 | 7.78 | 7.81 | 7.78 |
| 7 | 7.61 | 7.51 | 7.25 | 7.52 |
| 8 | 7.67 | 7.13 | 7.19 | 7.20 |
| CD | 0.232 | 0.252 | 0.245 | 1.239 |
실시예 7. 유청 단백질 가수분해물을 함유하는 음료의 선호도에 미치는 설탕과 구연산의 효과 조사
본 발명의 음료의 선호도에 미치는 설탕과 구연산의 효과를 조사하기 위하여, 가수분해도 6%로 가수분해된 WPC에 설탕과 구연산의 함량을 변화시킨 음료를 제조하였다. 설탕의 함량을 10, 12, 14, 15 및 16%로 하고 구연산은 0.1, 0.25, 0.3% 함량으로 하여 제조한 음료의 점수는 표 9에 나타내었다.
그 결과 표 9에 나타난 바와 같이, 15% 이상의 설탕을 함유한 음료에서 점수가 유의하게 증가하였고 전체적인 선호도는 감소하였다. 구연산이 많이 첨가되면 설탕 요구량도 유의하게 변화하는 데, 음료수에서 구연산 함량이 증가함에 따라 각각의 점수는 0.25%까지 증가하였고 전체적인 선호도는 유의하게 감소하였다. 15% 설탕과 0.25% 구연산을 배합하여 제조한 음료는 다른 배합과 비교할 때 전체적인 선호도가 8.14로 높은 점수를 나타냈다.
| 설탕 (%) |
구연산 (%) | CD | ||
| 0.1 | 0.25 | 0.30 | ||
| 10 | 4.14 | 3.87 | 3.39 | 0.163 |
| 12 | 4.55 | 4.29 | 2.81 | |
| 14 | 5.01 | 4.53 | 4.07 | |
| 15 | 5.83 | 4.80 | 4.39 | |
| 16 | 6.08 | 5.04 | 4.66 | |
| CD | 0.189 | |||
실시예
8.
유청
단백질
가수분해물을
함유하는 음료의 침전물 형성에 대한 안정제의 효과 조사
본 발명의 음료의 침전물 형성에 대한 안정제의 효과를 조사하기 위하여, 단백질 함량을 0.50, 1.0, 1.5 및 2.0%로 변화시킨 가수분해된 WPC 음료에 크산틴 검 (xanthum gum)의 양을 달리하여 첨가하였다. 저장기간 동안 육안으로 관찰한 침전 결과는 표 10에 나타난 바와 같다. 구체적으로, 단백질 함량이 0.5 내지 2.0%로 증가했을 때 침전물은 뚜렷이 증가했다. 그러나 0.05 내지 2.0의 안정제를 첨가했을 때 침전물을 형성하는 정도가 감소하였고 음료의 단백질 함량이 0.05와 1.0%일 때는 침전물이 생기지 않았다. 단백질 함량 1%와 안정제의 함량이 0.15%로 제조된 음료는 다른 배합과 비교하여 조직 형성이 양호했고 침전이 형성되지 않았다.
| 안정제 (%) |
단백질 (%) | |||
| 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | |
| 침전 정도 | ||||
| 0.05 | ++ | ++ | ++++ | ++++ |
| 0.10 | + | + | +++ | +++ |
| 0.15 | - | - | ++ | ++ |
| 0.20 | - | - | + | + |
| ++++ 침전형성 높음; +++ 중간; ++ 낮음; + 적음; - 없음 | ||||
실시예 9. 분무건조된 유청 단백질 가수분해물을 함유하는 음료의 선호도에 미치는 단백질 함량의 효과 조사
본 발명의 음료에 분무건조된 WPC 가수분해물을 사용한 경우 선호도에 미치는 효과를 조사하기 위하여, 18% 단백질 함량인 WPC 가수분해물을 0.5, 1.0, 1.5, 2.0%의 단백질 함량으로 재조합한 후 설탕, 구연산, 색소 및 향료의 요구량의 농도로 혼합하였다. 여러 종류의 단백질 함량에서 실험한 결과, 1.0% 단백질 함량으로부터 제조된 음료는 더 높은 단백질 함량 (1.5 및 2.0%)을 함유하는 음료와 비교하여 더 나은 결과를 나타냈다. 단백질 함량이 1.0% 이상으로 증가할 때 전체적 선호도와 관련된 점수는 유의하게 감소하였다. 표 11에서 나타난 바와 같이, 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0% 단백질 함량으로 제조된 음료의 전체적 선호도에서 점수는 각각 7.74, 7.76, 7.58 및 7.41인 것으로 나타났다. 풍미와 감도 점수에서 감소 정도는 유의하게 높았다. 1.0%와 1.5%의 단백질 함량에서 풍미에 대한 점수는 각각 7.73 및 7.54이고, 감도 점수는 7.85와 7.69인 것으로 조사되었다.
| 단백질 (%) |
감각 | |||
| 색 및 모양 | 풍미 | 감도 | 선호도 | |
| 0.5 | 7.65 | 7.69 | 7.84 | 7.74 |
| 1.0 | 7.66 | 7.73 | 7.85 | 7.76 |
| 1.5 | 7.68 | 7.54 | 7.69 | 7.58 |
| 2.0 | 7.67 | 7.47 | 7.13 | 7.41 |
| CD | 0.158 | 0.147 | 0.144 | 0.153 |
실시예 10. 분무건조된 유청 단백질 가수분해물의 가공공정에 따른 물리화학적 특성 변화 조사
본 발명은 분무건조된 유청 단백질 가수분해물의 가공공정에 따른 물리화학적 특성 변화를 조사하기 위하여, 고형분 함량 25%(18% 단백질)로 재조합한 후 6%가수분해도를 가지도록 가수분해한 WPC를 설탕 (5, 10, 15, 20%)의 함량을 달리하여 고형분 함량이 30, 35, 40, 45%가 되도록 혼합하였다. 그 다음 여러 종류의 배출 (outlet) 온도에서 배출 속도 (flow rate)를 조절하며 건조하였다. 여러 종류의 고형분 함량 및 건조 온도 배합과 관련된 분무 건조된 제품의 이화학적 특성에 대해 조사한 실험 결과는 하기에 기술한 바와 같다.
(1) 분무건조된 WPC 가수분해물의 수분 함량에 대한 배출 공기 온도와 총고형분의 효과
총고형분과 배출 온도의 여러 종류의 배합에서 분무 건조된 WPC 가수분해물의 수분 함량에 대한 효과는 표 12에 나타낸 바와 같다. 구체적으로, 분무건조 시 배출 온도가 증가하면 분말의 수분 함량은 모든 고형분 함량에서 유의하게 감소하였다. 700℃의 배출 온도에서 수분 함량은 30, 35, 40 및 45%의 고형분 함량에서 각각 4.43, 4.84, 5.01 및 5.19인 것으로 나타났다. 750℃의 배출 온도에서 수분 함량은 상기 고형분 함량에서 각각 4.21, 4.38, 4.75 및 5.01인 것으로 나타났다.
| 배출 온도 (℃) |
총 고형분 (%) | |||
| 30 | 35 | 40 | 45 | |
| 수분 함량 (%) | ||||
| 700 | 4.43 | 4.84 | 5.01 | 5.19 |
| 750 | 4.21 | 4.38 | 4.75 | 5.01 |
| 800 | 4.02 | 4.16 | 4.58 | 4.87 |
| 850 | 3.80 | 3.92 | 4.14 | 4.69 |
| CD | 0.130 | |||
(2) 분무건조된 WPC 가수분해물의 밀도에 대한 배출 공기 온도와 총 고형분의 효과
표 13에서 나타난 바와 같이, 고형분 함량이 30%에서 45%로 증가하면 모든 배출 공기 온도에서 밀도 (bulk density)는 유의하게 증가하였다. 그러나 배출 온도가 70℃에서 85℃로 증가하면 모든 고형분 함량에서 밀도는 감소하였다. 75℃의 배출 온도에서 밀도는 30, 35, 40 및 45%의 총고형분 함량에서 각각 0.41, 0.44, 0.50, 0.54 g/㎖인 것으로 나타났다. 이로부터 단백질 농축물에서 총고형분 함량과 분무건조의 배출 공기온도가 분말의 밀도에서 명백히 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
| 배출 온도 (℃) |
총 고형분 (%) | |||
| 30 | 35 | 40 | 45 | |
| 밀도 (g/㎖) | ||||
| 70 | 0.45 | 0.48 | 0.53 | 0.58 |
| 75 | 0.41 | 0.44 | 0.50 | 0.54 |
| 80 | 0.35 | 0.39 | 0.44 | 0.45 |
| 85 | 0.30 | 0.34 | 0.37 | 0.39 |
| CD | 0.043 | |||
(3)
분무건조된
WPC
가수분해물의
불용성 지수에 대한 배출 공기 온도와 총 고형분의 효과
분무건조된 WPC 가수분해물의 불용성 지수는 단백질 농축물에서 건조 온도와 총고형분 함량에 영향을 받았고 그 결과는 표 14에 나타내었다. 이 결과에서 총고형분 함량이 30%에서 45%로 증가함에 따라 모든 배출 온도에서 불용성 지수가 유의하게 증가하는 것을 분명히 알 수 있었다. 이와 유사하게 배출 온도가 70℃에서 85℃로 증가하면 모든 총고형분 함량에서 불용성지수는 유의하게 증가하였다. 75℃에서 총고형분 함량이 30, 35, 40 및 45%로 건조되었을 때 불용성 지수는 0.67, 0.72, 0.78 및 0.88인 것으로 측정되었다. 85℃의 배출 공기 온도일 때 불용성 지수는 상기 총고형분에서 0.85, 0.89, 0.94 및 0.99인 것으로 조사되었다.
| 배출 온도 (℃) |
총 고형분 함량 (%) | |||
| 30 | 35 | 40 | 45 | |
| 불용성 지수 | ||||
| 70 | 0.64 | 0.68 | 0.75 | 0.84 |
| 75 | 0.67 | 0.72 | 0.78 | 0.88 |
| 80 | 0.75 | 0.81 | 0.87 | 0.95 |
| 85 | 0.85 | 0.89 | 0.94 | 0.99 |
| CD | 0.048 | |||
(4) 분무건조된 WPC 가수분해물의 HMF 함량에 대한 배출 공기 온도와 총 고형분의 효과
건조조건 변화가 HMF로 측정된 갈변화반응의 정도에 미치는 효과는 표 15에 나타내었다. 이 결과에서 배출 온도와 총고형분 모두의 갈변화 정도에 지대한 영향을 분명하게 미치는 것을 알 수 있었다. 총고형분 함량이 30%에서 35%로 증가하면서 모든 배출 온도에서 갈변화가 유의하게 증가하지 않았다. 그러나 35% 이상의 총고형분 함량에서 HMF 함량은 유의하게 증가하였다. 이와 유사하게 75℃이상의 배출 온도에서 갈변화 증가의 정도는 그다지 크지 않았다. 75℃ 이상에서 갈변화의 증가는 매우 유의하게 높은 것으로 나타났다. HMF 함량은 각각 총고형분 함량이 30, 35, 40 및 45%일 때 2.90, 2.92, 3.09 및 3.32 μmol/100 g인 것으로 측정되었다. 배출 온도가 80℃일 때 각각의 HMF 함량은 3.06, 3.12, 3.26 및 3.55 μ mol/100 g인 것으로 조사되었다.
| 배출 온도 (℃) |
총 고형분 함량 (%) | |||
| 30 | 35 | 40 | 45 | |
| HMF 함량 (μmol/100g) | ||||
| 70 | 2.84 | 2.87 | 3.02 | 3.26 |
| 75 | 2.90 | 2.92 | 3.09 | 3.32 |
| 80 | 3.06 | 3.12 | 3.26 | 3.55 |
| 85 | 3.24 | 3.37 | 3.52 | 3.79 |
| CD | 0.077 | |||
실시예 11. 프로바이오틱 스타터에 미치는 접종량의 효과 조사
본 발명에서는 프로바이오틱 스타터의 활성이 미치는 접종량의 효과를 조사하기 위하여, 멸균한 유청에 프로바이오틱 스타터(Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidium)를 첨가하여 37℃에서 배양하였다. 프로바이오틱의 활성은 pH와 산생성을 3시간 간격으로 측정하여 조사하였다.
먼저 락토바실러스 아시도필러스 균주의 활성에 미치는 접종량의 효과에 대한 결과는 표 16에 나타내었다.
| 배양 시간 (h) |
접종량 (%) | |||||
| 4 | 5 | 6 | ||||
| pH | 산도 | pH | 산도 | pH | 산도 | |
| 6 | 4.87 | 0.032 | 4.85 | 0.342 | 4.80 | 0.36 |
| 9 | 4.84 | 0.341 | 4.82 | 0.350 | 4.74 | 0.378 |
| 12 | 4.80 | 0.369 | 4.77 | 0.378 | 4.70 | 0.414 |
| 15 | 4.72 | 0.405 | 4.69 | 0.414 | 4.62 | 0.486 |
| 18 | 4.66 | 0.416 | 4.63 | 0.441 | 4.55 | 0.519 |
| 21 | 4.62 | 0.420 | 4.59 | 0.447 | 4.51 | 0.524 |
그 결과, pH와 산 생성으로 측정한 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus)의 활성은 접종량 4%에서 6시간에서 18시간 동안 배양했을 때 배양 기간이 증가하면서 pH는 4.87 내지 4.66 범위로 감소하였고 산도는 0.324 내지 0.416% LA 범위로 증가하였다. 그러나 배양 18시간 후에 pH의 감소 정도와 산도 증가 정도는 유의하게 차이가 나지 않았다. 이와 유사한 결과는 5%와 6%의 접종량에서도 나타났다. 접종량 5%, 6%와 모든 배양기간에서 4% 접종량과 비교했을 때 pH의 감소와 산도의 증가는 유의하지 않았다.
또한, pH와 산생성에 의해 측정한 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum)의 활성과 관련된 결과는 표 17에 나타내었다. 구체적으로, 4% 접종량에서 배양시간이 6시간에서 18시간으로 증가하면서 pH 는 4.95 내지 4.70 범위로 감소하였고 산도는 0.315 내지 0.409 % LA 범위로 증가하였다. 그러나 배양 18시간 후에 pH의 감소와 산도 증가는 유의하지 않았다. 이와 유사한 결과는 5%와 6%의 접종량에서도 나타났다. 비피도박테리움 비피덤 스타터를 5%와 6%로 접종했을 때 배양 기간 동안의 pH의 감소와 산도 증가에 대한 효과는 유의하지 않았다.
| 배양 시간 (h) |
접종량 (%) | |||||
| 4 | 5 | 6 | ||||
| pH | 산도 | pH | 산도 | pH | 산도 | |
| 6 | 4.95 | 0.315 | 4.92 | 0.321 | 4.90 | 0.323 |
| 9 | 4.91 | 0.327 | 4.89 | 0.334 | 4.86 | 0.336 |
| 12 | 4.85 | 0.365 | 4.83 | 0.371 | 4.81 | 0.397 |
| 15 | 4.78 | 0.398 | 4.76 | 0.406 | 4.73 | 0.425 |
| 18 | 4.70 | 0.409 | 4.68 | 0.413 | 4.65 | 0.427 |
| 21 | 4.68 | 0.414 | 4.66 | 0.417 | 4.62 | 0.432 |
실시예 12. 건조된 WPC 가수분해물에서 프로바이오틱 생존율에 미치는 건조기술과 스타터 함량 변화의 효과 조사
본 발명에서는 건조된 WPC 가수분해물에서 프로바이오틱 생존율에 미치는 건조기술과 스타터 함량 변화의 효과를 조사하기 위하여, 하기 표 18에 건조 유형과 접종량에 따른 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus)와 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidium)의 생존율을 나타내었다. 표 18에서 나타난 바와 같이, 접종량은 상기 유산균 균주들의 생존력에 유의한 영향을 미치지 않았다. 그러나 건조 유형은 상기 균주들의 생존율에 유의한 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 분무건조된 시료에서 락토바실러스 아시도필러스의 수치는 4.49 log cfu/g 인 것으로 측정된 반면에, 액체 베드건조 (fluid bed drying)에서는 거의 두 배의 수치인 8.64 log cfu/g 값을 나타내었다. 따라서, 분무 건조가 락토바실러스 아시도필러스 균주의 생존율에 부정적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 이와 유사하게 비피도박테리움 비피덤의 수치는 4.18 log cfu/g 인 것으로 측정된 반면, 액체베드 건조에서는 거의 두 배의 수치 8.22 log cfu/g를 나타내었다. 따라서, 분무건조가 비피도박테리움 비피덤의 생존율에 부정적인 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
| 배양율 (%) |
LA | BB | ||
| 분무건조 | 액체베드건조 | 분무건조 | 액제베드건조 | |
| 생존율 (log cfu/g) | ||||
| 4 | 4.49 | 8.64 | 4.18 | 8.22 |
| 5 | 4.47 | 8.83 | 4.32 | 8.49 |
| 6 | 4.72 | 8.91 | 4.38 | 8.65 |
| CD | 0.09 | 0.12 | 0.14 | 0.178 |
실시예 13. 프로바이오틱을 첨가한 음료의 관능적 특성 조사
본 발명에서는 프로바이오틱을 첨가한 음료의 관능적 특성을 조사하기 위하여, 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus)와 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidium) 스타터를 단백질 함량 1.0%에 첨가한 환원 음료의 관능적 특성을 조사하여 그 결과를 표 19에 나타내었다. 상기 유산균 군주들을 혼합해서 재조합한 음료에 주어진 관능 점수는 큰 차이가 없는 것으로 분명히 나타났다. 락토바실러스 아시도필러스와 비피도박테리움 비피덤 스타터를 각각 첨가한 음료의 전체적인 선호도 점수는 각각 7.82와 7.84인 것으로 조사되었다.
| 음료의 종류 | 색 및 모양 | 풍미 | 감도 | 전체 선호도 |
| LA | 7.82 | 7.79 | 7.92 | 7.82 |
| BB | 7.88 | 7.83 | 7.90 | 7.84 |
| CD | 0.12 | 0.09 | 0.14 | 0.07 |
실시예 14. 프로바이오틱을 첨가한 음료의 이화학적 특성 조사
본 발명에서는 프로바이오틱을 첨가한 음료의 이화학적 특성을 조사하기 위하여, 적정한 건조기술을 이용하여 건조된 WPC 가수분해물에 설탕, 구연산, 색소, 향료, 안정제, 스타터(LA, BB)를 혼합하고 액체 베드에서 건조하여 인스턴트 형태로 제조하였다 (도 1 참조). 상기 음료 제품의 이화학적에 특성에 관한 결과는 표 20에 나타내었다. 구체적으로, 상기 제품의 pH와 불용성지수, 밀도 (bulk density)의 값은 4.60, 0.28 ㎖ 및 0.73 g/㎖ 인 것으로 각각 나타내었다. 건조된 생산물의 WPNI (유청 단백질의 질소지수, whey protein nitrogen index)와 HMF는 55.23 ㎎N/100 g과 3.42 μmol/100 g 인 것으로 측정되었다. 일반성분 값은 단백질 7.14%, 유당 1.80%. 회분 2.60%, 설탕 85.21% 그리고 수분은 2,75% 인 것으로 조사되었다.
| 실험 | 물리적 특성 | 화학적 특성 | |||||||
| pH | 불용성 지수 | 밀도 | WPNI (㎎N/g) |
HMF (mol/100g) |
단백질 (%) |
유당 (%) |
수분 (%) |
회분 (%) |
|
| 1 | 4.62 | 0.28 | 0.71 | 54.75 | 3.39 | 7.10 | 1.75 | 2.74 | 2.58 |
| 2 | 4.58 | 0.26 | 0.73 | 55.46 | 3.41 | 7.16 | 1.82 | 2.72 | 2.62 |
| 3 | 4.60 | 0.29 | 0.75 | 55.19 | 3.43 | 7.13 | 1.81 | 2.76 | 2.63 |
| 평균 | 4.60 | 0.28 | 0.73 | 55.23 | 3.42 | 7.14 | 1.80 | 2.75 | 2.60 |
실시예 15. 프로바이오틱 스타터의 생존율에 대한 저장온도의 효과
본 발명에서는 프로바이오틱 스타터의 생존율에 대한 저장온도의 효과를 조사하기 위하여, 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus)와 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidium)의 생존율에 미치는 효과를 다음과 같이 측정하여 그 결과를 표 21에 나타내었다. 표 21에서 나타난 바와 같이, 냉장온도에서 LA와 BB를 첨가한 인스턴트 재조합 분말의 저장 시 LA와 BB의 생균 측정에서 유의한 감소는 없었다. 생균수는 저장 초기 8.96 log cfu/g이었고 90일후 균수는 8.16 log cfu/g로 변함없는 것으로 나타났다. 이와 유사하게 3개월 동안의 저장 전의 균수는 8.77이고 저장 3개월 후의 균수는 8.15인 것으로 나타나 불리한 영향은 없는 것을 알 수 있었다. 그러나 실온에서의 저장은 3개월 후 균수가 유의하게 감소하였고, 저장 초기에 8.96 와 8.77 log cfu/g의 생균수가 LA 와 BB에서 측정되었다. 이에 대하여 90일 후의 측정 때에는 생균수가 7.76 와 7.65 log cfu/g 로 나타났으나, 생균수는 수용 가능한 범위에서 존재하였다(107cfu/g).
| 저장 (일) |
LA | BB | ||
| 상온 (Log cfu/g) |
냉장온도 (Log cfu/g) |
상온 (Log cfu/g) |
냉장온도 (Log cfu/g) |
|
| 0 | 8.96 | 8.96 | 8.77 | 8.77 |
| 15 | 8.79 | 8.87 | 8.62 | 8.68 |
| 30 | 8.58 | 8.76 | 8.46 | 8.58 |
| 45 | 8.39 | 8.60 | 8.29 | 8.43 |
| 60 | 8.24 | 8.45 | 8.08 | 8.27 |
| 75 | 8.01 | 8.31 | 7.92 | 8.09 |
| 90 | 7.76 | 8.16 | 7.65 | 7.92 |
| CD | 0.26 | 0.23 | 0.28 | 0.23 |
실시예 16. 유청 단백질 가수분해물의 생리활성 펩타이드 분석
본 발명에서는 유청 단백질 가수분해물로부터 유래한 생리활성 펩타이드를 분석하기 위하여, 유청단백질의 주성분인 베타-락토글로불린 (β-lactoglobulin)과 알파-락토알부민 (α-lactalbumin)은 알카라제 (alcalase), 뉴트라제 (neutrase), 프로타맥스 (protamax) 및 플라보자임 (flavourzym)으로 3시간과 4시간 동안 각각 가수분해하였다. 이 때 WPCH80은 단백질 함량 80%의 가수분해물을, WPCH40은 단백질 함량 40%의 가수분해물을 의미하는 것으로 표기하였다.
| No. | 표기 (Description) |
효소 | 가수분해정도 (시간) |
| M1 | WPCH80 | Alcalase | 3 |
| M2 | WPCH80 | Flavourzyme | 3 |
| M3 | WPCH80 | Neutrase | 3 |
| M4 | WPCH80 | Protamex | 3 |
| M5 | WPCH80 | Alcalase | 4 |
| M6 | WPCH80 | Flavourzyme | 4 |
| M7 | WPCH80 | Neutrase | 4 |
| M8 | WPCH80 | Protamex | 4 |
| M11 | WPCH40 | Alcalase | 3 |
| M12 | WPCH40 | Neutrase | 3 |
그 결과, 질량 분석 (mass spectrometer; MS) 분석에 의하여 표 22에 나타난 바와 같이 생리활성 펩타이드의 존재를 확인하였다. 이때 M은 분자량을 의미하고 [M+H]+ 는 단순 하전 된, [M+H]2+ 는 이중으로 하전 된 분자이온을 나타낸다.
| 펩타이드 | M | [M+H]+ | [M+2H]2+ |
| YGLF | 498,25487 | 499,25566 | 250,62862 |
| YLLF | 554,31747 | 555,31826 | 278,65992 |
| LAMA | 404,21638 | 405,21717 | 203,609375 |
| LDAQSAPLR | 969,53141 | 970,5322 | 486,26689 |
| ALPMHIR | 836,47611 | 837,4769 | 419,73924 |
| YL | 294,16499 | 295,16578 | 148,58368 |
| VGINWLAHKAL | 1220,71001 | 1221,7108 | 611,85619 |
| YGLF: tyr-gly-leu-phe; YLLF: tyr-leu-leu-phe; LAMA: leu-ala-met-ala; LDAQSAPLR: leu-asp-ala-gln-ser-ala-pro-leu-arg; ALPMHIR: ala-leu-pro-met-his-ile-arg; YL: tyr-leu 이다. | |||
구체적으로, ESI/MS 측정에 의해 7개의 찾으려고 하는 펩타이드들 중에서 하기와 같은 5개의 생리활성 펩타이드들이 검출되었다. 특히 알카라제 처리된 시료에서(M1, M5, M11) 많은 펩타이드가 검출되었다. 시료 M1에서 발견된 펩타이드는 YGLF, YLLF, LAMA, LDAQSAPLR, YL이고, 시료 M5에서 발견된 펩타이드는 YGLF 이며, 시료 M11에서 발견된 펩타이드는 YGLF, YLLF, LAMA, LDAQSAPLR 인 것으로 조사되었다. 프로타맥스 (protamax)를 처리한 시료 M4와 M8에서도 한두 개의 펩타이드들이 검출되었다. 또한 시료 M4에서 발견된 펩타이드는 YGLF, YL, 시료 M8에서 발견된 펩타이드는 YGLF 이었다. 플라보자임 및 뉴트라제로 처리된 시료 (시료 M2, M3, M4, M7)에서는 찾으려는 펩타이드가 검출되지 않았다. 단지 시료 M12에서 5개 펩타이드들이 검출되었다. 뉴트라제로 처리한 시료 M12에서 발견된 펩타이드는 YGLF, YLLF, LAMA, LDAQSAPLR, YL 인데, 가수분해 시간과 생성된 펩타이드와의 관련성을 살펴보면 4시간 동안 분해한 시료에서 찾으려는 펩타이드가 3시간 동안 분해한 시료보다 적게 검출되었다. 따라서, 분해시간이 길어지면서 펩타이드가 분해시간이 짧은 경우보다 강하게 분해되는 것을 확인할 수 있었다. 실제로, 알카라제로 가수분해 한 시료 M1에서 3시간 가수분해 시 5개의 펩타이드가 검출된 반면에 4시간 가수분해된 시료 M5 에서는 찾으려는 펩타이드에서 한 개만 검출되었다. 전체의 스펙트럼은 복잡하므로 찾으려는 펩타이드들 중에서 몇 개는 숨어 있을 가능성도 배제할 수 없다 (도 2 참조).
실시예 17. 프로바이오틱 유산균의 선발 및 배양
본 발명에서는 프로바이오틱 유산균으로서 유용한 락토코커스 락티스 NK34 (Lactococcus lactis NK34) 균주를 선발하여 다음과 같이 배양하였다.
상기에서 선발한 락토코커스 락티스 NK34 균주 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD (Bacillus polyfermenticus SCD) 균주는 3 내지 4회에 걸친 계대배양으로 활성화하였고, 글리세롤 보존법에 따라 20% 글리세롤을 첨가하여 -70℃에서 보존하였으며, 사용하기 전 한 달에 1회씩 계대배양 (working culture)하였다.
또한, 상기 락토코커스 락티스 NK34 균주는 10 ㎖의 MRS 액제배지에 접종하여 온도 37℃에서 교반속도 50 rpm으로 12시간 동안 전배양한 다음, 다시 500 ㎖ 플라스크 (baffled flask; 작동부피 (working volume) 100 ㎖)에 접종하여 12시간 동안 본배양하였다. 내생포자의 경우에는 3일간 본배양한 후 온도 80℃에서 10분간 열처리하여 사용하였다. 이 때 균수를 측정하기 위하여, 배양액을 0.1% 펩톤수로 10배씩 연속적인 희석을 시키고 평판배지에 0.1 ㎖씩 분주하여 도말한 다음 최적 온도에서 배양한 후 콜로니형성단위 (colony forming unit)를 측정하여 총 균수를 계산하였다.
실시예 18. 프로바이오틱 유산균의 인공위액에 대한 내성 조사
본 발명의 프로바이오틱 유산균의 인공위액에 대한 내성을 조사하기 위하여, 고바야시 (Kobayashi) 등의 방법에 따라 인공위액을 5 N HCl 을 사용하여 pH 2.5 및 pH 4.0으로 조정한 액체 배지에 펩신 1% 첨가하여 사용하였다. 구체적으로, 영양세포의 인공위액에 대한 내성은 L. lactis NK34 균주를 12시간 동안 배양한 배양액 1 ㎖을 실험관 (test tube)의 인공위액 9 ㎖에 넣어 배양하면서 0, 0.5, 1, 1.5 및 2시간 간격으로 시료를 채취하고 MRS 아가 플레이트를 이용하여 총균수를 측정하여 조사하였다. 또한 내생포자의 인공위액에 대한 내성은 3일 배양된 배양액을 80℃에서 10분간 열처리하여 6,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 배양 상등액을 버리고 균체를 회수하여 상기와 동일한 방법으로 조사하였다. 이 때 대조군은 pH를 조절하지 않고, 펩신도 첨가하지 않은 액체배지를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 측정하였다.
상기 락토코커스 락티스 NK34 균주의 영양세포의 인공위액에 대한 내성을 확인한 결과, pH 2.5 및 pH 4.0으로 조정된 인공위액에서 2시간 경과 후 영양세포는 각각 77.76% 및 87.57%의 비교적 높은 생존율을 나타내어 생균제로서 가능성을 알 수 있었다 (도 3 참조).
실시예 19. 프로바이오틱 유산균의 인공담즙산에 대한 내성 조사
본 발명의 프로바이오틱 유산균의 인공담즙산에 대한 내성을 조사하기 위하여, 인공담즙산은 살균된 액체배지에 멸균한 0.3% 옥스갈 (oxgall; Difco)을 첨가하여 사용하였다. 인공담즙산 내성은 인공위액을 거친 배양액을 인공담즙산이 있는 시험관에 첨가하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 상기 실시예에서의 인공위액과 동일한 과정으로 총균수 및 총 아포균수를 측정하여 생존력을 조사하였다. 이 때 대조군은 옥스갈이 첨가되지 않은 액체배지를 사용하여 상기와 같은 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과, 인공 담즙산에 대한 내성은 인공담즙산이 포함되지 않은 대조군과 비교하였을 때 도 4에서 나타난 바와 같이 인공 담즙산이 포함된 배지와 거의 차이를 보이지 않은 것을 확인하였다. 따라서 인공위액을 통과한 유산균 NK34 균주가 인공담즙산에 대해서도 내성을 나타내는 것을 알 수 있으므로, 이 균주가 최종 목적 부위인 장에 도달하여도 생균제로서 충분히 역할을 수행할 것으로 판단되었다.
실시예 20. 프로바이오틱 유산균의 효소 생산성 조사
본 발명의 프로바이오틱 유산균의 효소 생산성을 조사하기 위하여, 락토코커스 락티스 NK34 균주의 배양액을 원심분리하고 균체만을 회수하여 멸균수로 2회 반복하여 세척한 후 멸균수에 현탁하여 106 CFU/㎖ 정도의 농도가 되도록 조정하였다. 이 현탁액을 API ZYM 키트 (bioMerieux Co., France)에 접종하여 어두운 곳에서 37℃의 조건으로 4시간 배양하였다. 표현 활성 증가와 용해를 돕기 위해 ZYM A, B 시약을 각각의 큐플에 한 방울씩 떨어뜨리고 밝은 곳에서 약 5분간 반응시킨 후 색깔의 변화를 관찰하여 효소 활성을 측정하였다.
상기 락토코커스 락티스 NK34 균주의 효소 생산성을 API ZYM 키트로 확인한 결과, 표 24에서 나타난 바와 같이 발암효소인 베타-글루쿠로니다제 (β-glucuronidase)가 생산되지 않는 것을 확인하였다. 또한, 예비적 발암물질을 발암물질로 변환시키는 베타-글루코시다제 (β-glucosidase) 활성 역시도 없는 것으로 확인되었다. 따라서, 이 결과로 프로바이오틱 생균으로 인해 발생할 수 있는 발암 위험성이 없는 것으로 판단되었다.
| 효소 | L. lactis NK34 |
| 대조군 | 01) |
| Alkaline phosphatase | 1 |
| Esterase(C4) | 1 |
| Esterase Lipase(C8) | 0 |
| Lipase(C14) | 1 |
| Leucine acrylamidase | 2 |
| Valine acrylamidase | 1 |
| Crystine acrylamidase | 2 |
| Trypsin | 2 |
| α-Chymotrypsin | 2 |
| Acid phosphatase | 1 |
| Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase | 1 |
| α-Galactosidase | 1 |
| β-Galactosidase | 3 |
| β-Glucuronidase | 0 |
| α-Glucosidase | 2 |
| β-Glucosidase | 0 |
| N-Acetyl-β-glucosaminidase | 0 |
| α-Mannosidase | 0 |
| α-Fucosidase | 0 |
| 1)0: 0 nmol, 1: 5 nmol, 2: 10 nmol, 3: 20 nmol, 4: 30 nmol, 5: ≥40 nmol | |
실시예 21. 프로바이오틱 유산균의 항생물질에 대한 내성 조사
본 발명의 프로바이오틱 유산균의 항생물질에 대한 내성을 조사하기 위하여, 페이퍼 디스크 (paper disc) 방법을 사용하였다. 구체적으로, 상기 락토코커스 락티스 NK34 균주는 최적 온도에서 12시간 배양하고, TS 소프트 아가 (0.75% 아가)에 배양액을 100 ㎕로 접종하여 아가 플레이트에 덮었다 (overlay). 이로부터 얻은 플레이트에 멸균된 핀셋으로 페이퍼 디스크를 올려 놓고, 이 페이퍼 디스크 위에 각 농도별로 항생물질을 10 ㎕씩 떨어뜨린 후 12시간 동안 배양하여 항생물질 내성을 측정하였다.
그 결과, 상기 락토코커스 락티스 NK34 균주는 록시트로마이신 (roxithromycin) 및 에리트로마이신 (erythromycin)을 처리한 경우 10 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 생육 저해를 받는 감수성을 나타내었다. 또한, 상기 균주는 스트렙토마이신 (streptomycin), 네오마이신 (neomycin), 클로로암페니콜 (chloramphenicol) 및 젠타마이신 (gentamycin)을 처리한 경우에 20 ㎍/㎖ 이상의 농도에서도 저해를 받지 않는 내성을 나타내었으며, 나이신 (nisin)을 처리한 경우는 100 ㎍/㎖의 농도에서도 저해를 받지 않는 내성을 나타내었다 (표 25참조).
| Antibiotics | (㎍/㎖) | L. lactis NK34 |
| Nisin | 0 | + |
| 25 | + | |
| 50 | + | |
| 100 | + | |
| Streptomycin | 0 | + |
| 5 | + | |
| 10 | + | |
| 20 | + | |
| Neomycin | 0 | + |
| 5 | + | |
| 10 | + | |
| 20 | + | |
| Roxithromycin | 0 | + |
| 5 | + | |
| 10 | - | |
| 20 | - | |
| Chloramphenicol | 0 | + |
| 5 | + | |
| 10 | + | |
| 20 | + | |
| Gentamycin | 0 | + |
| 5 | + | |
| 10 | + | |
| 20 | + | |
| Rifampicin | 0 | + |
| 5 | + | |
| 10 | + | |
| 20 | + | |
| Erythromycin |
0 | + |
| 5 | + | |
| 10 | - | |
| 20 | - | |
| +: growth, -: no growth | ||
실시예 22. 프로바이오틱 유산균의 항종양 활성 조사
본 발명의 프로바이오틱 유산균의 항종양 활성을 조사하기 위하여, 각 종양 세포주를 배지에 접종 농도의 세포 수를 접종하여 37℃, CO2 항온기 (incubator)에서 24시간 동안 배양한 후 시료를 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 세포 배양이 끝나기 4시간 전에 MTT(0.5 ㎎/㎖) 용액 50 ㎕를 첨가하고 4시간 추가 배양하여 포르마잔 (formazan) 형성을 유도시킨 다음 추가 배양이 끝난 후 원심분리 (1,000 rpm, 5분, 4℃)하여 상등액을 제거하였다. 그 다음 DMSO를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하여 블루 포르마잔 (blue formazan)을 용해시키고 플레이트 진탕기 (plate shake)에서 20분간 교반한 후 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
MTT 분석 시 결과는 [1-(처리한 세포의 OD/대조군 세포의 OD)]ㅧ100을 계산하여 % 저해율(% inhibition)로 나타내었으며, 저해율이 50% 이상인 경우에 종양세포 증식억제 효과가 있다고 판정하였다. 이 때 종양세포주 (tumor cell line)로는 인간 신장암세포 SW-156 (human kidney carcinoma), 인간 후두암세포 HEP-2 (human larynx carcinoma) 및 간암세포Hep-G2 (hepatocellular carcinoma)를 사용하였고, 배지로는 RPMI-1640에 10% FBS가 함유된 배지와 DMEM배지에 10% FBS가 함유된 배지를 사용하였다.
상기와 같이 MTT 분석으로 균주 배양액의 종양세포 생육 억제를 효과를 조사한 결과, 인간 신장암세포 SW-156는 배양상등액의 경우에 40.2%의 생육억제 효과를 나타내었으나, 다시 상등액을 75%로 에탄올로 침전시킨 후 D-PBS로 녹여 2배 농축하여 사용한 경우에는 79.8%로 높은 생육억제 효과를 나타내었다. 또한, 인간 후두암세포 HEP-2 및 인간 간암세포 Hep-G2는 배양 상등액에서는 50%이하로 생육억제 효과가 나타나지 않았으나, 에탄올 침전물에서는 약 55% 내외의 종양세포 생육억제 효과를 나타내었다 (표 26 참조).
|
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세포주 | ||
| SW-156 | Hep-G2 | HEP-2 | |
| 상등액 | 40.2±0.7 | 35.5±1.5 | 38.2±0.8 |
| 배양액 침전 | 79.8±2.8* | 50.2±1.4* | 58.1±1.0* |
| * : 민감도 i.e., % 억제도≥50 | |||
실시예 23. 프로바이오틱 유산균의 항산화 활성 조사
본 발명은 프로바이오틱 유산균의 항산화 활성을 조사하기 위하여, 락토코커스 락티스 NK34 균주는 10 ㎖의 MRS 액체배지에 접종하고 37℃에서 교반속도 50 rpm으로 12시간 동안 전배양한 다음, 다시 500 ㎖ 플라스크 (baffled flask; 작동부피 100 ㎖)에 접종하였다. 이들 세포는 12시간 동안 본배양한 다음 배양액을 12,000 rpm으로 4℃, 20분간 원심분리하여 상등액을 얻고, 여기에 100 mM 1,1-디페닐-2-피크릴 하이드라질 (DPPH; 1,1-diphenyl-2-picyryl hydrazyl) 용액 3 ㎖을 상등액 600 ㎕에 가하였다. 상기 반응액을 10초 동안 진탕하고 10분간 방치한 다음 528 ㎚에서 흡광도를 측정하여 수소 공여능을 계산하였다.
그 결과, 본 발명의 유산균 NK34 배양액을 증류수로 2 내지 10배 희석한 희석액의 항산화력을 DPPH법에 따라 전자 공여능을 측정하여 도 3에 나타내었다. 따라서 세포의 배양 상등액을 희석한 희석액에 존재하는 항산화물질이 45% 이상의 활성을 나타내는 것을 측정하여 상기 유산균이 천연 항산화제로서 사용될 수 있는 점을 확인하였다.
실시예 24. 프로바이오틱 유산균의 대량 생산
본 발명에서는 락토코커스 락티스 NK34 균주 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD (Bacillus polyfermenticus SCD) 균주를 선발하여 다음과 같이 대량 생산하였다.
(1) 균주의 보존
본 발명의 균주들은 3 내지 4회에 걸친 계대배양으로 활성화하였고, 글리세롤 보존법에 따라 20% 글리세롤을 첨가하여 -70℃에서 보존하였으며, 사용하기 전 한 달에 1회씩 계대배양 (working culture)하였다.
(2) 배지의 제조 및 배양 조건
본 발명에서 상기 세포들은 유청 단백질 (WPC)를 기본으로 WPC-35 배지를 사용하여 배양하였고, 그 사용량은 락토스 (lactose)의 함량을 기준으로 조절하였다. 락토스의 함량은 0.5, 1, 1.5 및 2%로 정하였고 pH는 7로 조절하여 121℃에서 15분간 멸균 (autoclave)하여 사용하였다.
또한, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주는 500 ㎖ 플라스크 (Erlenmeyer flask)의 100 ㎖ TSB 액체배지에 접종하여 150 rpm, 37℃에서 약 6시간 동안 전배양한 다음 각각의 성분이 조제되어 있는 500 ㎖ 플라스크 (작동부피 100 ㎖)에 2% 접종비로 접종하여, 배양온도 37℃, 교반속도 150 rpm, 초기 pH 7.0으로 24시간 동안 본 배양하였다.
그 결과, 배양 배지 WPC-40 중의 락토스 함량을 0.5, 1, 1.5 및 2%로 조절하였을 때 배양시간별 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생균수는 WPC의 함량이 증가할수록 더 빨리 자라는 경향을 나타내고, 이 점은 모든 배지에서 거의 비슷한 양상으로 나타났다. 또한 접종 후 12시간 동안 배양하였을 때 최대 생육곡선이 나타났으며 그 후로는 점차 감소하는 경향을 나타내었다. 기존에 사용한 TSB 배지와 비교하였을 때 최대 생육시간이 약간 길어졌고 최대 생균수도 약간 줄어드는 경향을 보이는 것을 확인하였다.
(3) 회분식 배양
본 발명의 유산균 균주의 생산을 극대화하기 위하여 다음과 같이 회분식 배양을 실시하였다. 우선, 접종용(seed) 균주로서 상기 락토코커스 락티스 NK34 균주 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 각각 500 ㎖ 플라스크 (baffled flask; 작동부피 150 ㎖)에 2%(v/v)의 접종비로 접종하고 배양온도 37℃, 교반속도 150 rpm에서 9시간 동안 진탕 항온기 (shaking incubator)에서 배양하였다. 또한 본 배양에서는 5 ℓ 발효조 (작동부피 3 ℓ)에 2%(v/v)의 접종비로 접종하여 배양온도 37℃, 교반속도 500 rpm에서 배양하였고, 30% 안티폼 LS-300를 첨가하여 과량의 거품을 방지하였다. 이 때 pH 는 7.0±0.1 범위로 조절하고 121℃에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 상기 균주들은 36시간 배양하여 시간별로 시료를 채취하여 분석하였다. 이 때 균수는 배양액을 0.1% 펩톤수로 10배씩 연속적인 희석을 시킨 다음, 평판배지에 0.1 ㎖씩 분주하여 도말한 후 최적온도에서 배양하고 콜로니형성단위(colony forming unit)를 측정하여 총 균수를 계산하여 측정하였다.
(4) 항산화 활성 측정
본 발명에서는 상기 유산균들의 항산화 활성을 DPPH법으로 다음과 같이 측정하였다. 우선 DPPH법은 토코페롤 (tocopherol), 아스콜베이트 (ascorbate), 플라보노이드 화합물, 방향족 아민류, 메일라드형 (maillard) 갈변 생성물질, 펩타이드 등의 항산화 활성을 나타내는 생리활성 물질들에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는 정도에 따라 전자공여능을 측정하여 항산화 효과를 조사하는 방법으로서 항산화제의 효능을 검색하는 데 일반적으로 사용되는 방법으로 알려져 있다.
구체적으로, DPPH 용액은 100 ㎖의 에탄올에 DPPH (1,1-diphenyl-2-picyryl hydrazyl, Sigma, USA) 6 ㎎을 녹인 후 증류수 100 ㎖를 혼합하여 제조하였다. 배양액을 4℃에서 12,000 rpm의 속도로 15분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 DPPH (1,1-diphenyl-2-picyrylhydrazyl, Sigma, USA)에 대한 수소 공여능 (electron donating activity, EDA)을 측정하였다. 즉, 100 mM DPPH 에탄올 용액 1 ㎖을 200 ㎕의 시료에 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 528 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 5 ℓ 발효조를 이용한 대량 배양에서는 pH를 7.0±0.1 범위로 조절한 WPC 배지에서는 배양시간에 따라 생균수와 항산화 효과가 증가하였다. pH를 조절하지 않은 배지에서는 배양시간에 따라 pH의 변화는 처음 3시간까지는 낮아졌으나, 그 후로는 계속 상승하여 pH 8.4까지 높아지는 것으로 나타났다. 또한 생균수와 항산화 효과는 pH를 조절한 배지보다 높게 나타나는 것을 관찰하였다.
실시예 25. 프로바이오틱 유산균의 식품 첨가 시 유통기한 설정
본 발명에서는 프로바이오틱 유산균을 식품에 첨가할 때 가능한 유통기한을 설정하기 위하여, 상기 유산균이 첨가된 WPH 인스턴트 건강음료믹스를 개발하였다. 여기에 사용된 프로바이오틱스는 락토코커스 락티스 NK34 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 두 가지 혼합균주를 사용하였다. 먼저 제품들의 유통기한을 알아보기 위하여 첨가된 프로바이오틱스의 생균수를 측정하였다. 참고로, 우리나라 식품공전에 명시된 식용 가능한 유산균의 수는 107 이상이 되어야 유산균 함유식품으로 인정되고 있으므로, 저장기간 중의 유산균의 생균수를 측정하여 유통기한을 설정하였다.
구체적으로, 제조된 음료믹스를 제조한 날로부터 일정한 간격으로 시료를 취하고 시료 1 g에 0.1% 멸균 펩톤수 9 ㎖를 첨가하여 완전히 녹인 다음, 0.1% 멸균 펩톤수를 이용하여 단계 희석하여 실험하였다. 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주는 포자상태로 제품에 첨가하여 80℃에서 10분간 처리하고 락토코커스 락티스 NK34는 모두 사멸시킨 다음 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 균수만을 측정하였고, 또한, 총균수에서 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 균수를 뺀 것을 락토코커스 락티스 NK34 균수로 표기하였다.
도 1은 본 발명의 프로바이오틱 유산균 및 유청 단백질 가수분해물을 함유하는 기능성 건강음료의 제조공정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 유청 단백질 가수분해물의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 락토코커스 락티스 NK34 (Lactococcus lactis NK34) 균주의 인공위액에서의 생존율을 나타낸 것이다.
도 4는 락토코커스 락티스 NK34 균주의 인공담즙산에서의 생존율을 나타낸 것이다.
도 5는 락토코커스 락티스 NK34 균주에 의해 DPPH 라디칼이 소실되는 항산화 효과를 나타낸 것이다.
Claims (9)
- 항산화 효과를 가지는 유청 단백질 가수분해물을 함유하는 기능성 음료에 있어서,가수분해도가 3 내지 4% 범위인 유청 단백질 가수분해물을 유효성분으로 하고, 프로바이오틱 유산균, 설탕, 구연산, 향료 및 색소를 더 첨가한 기능성 건강음료.
- 제 1항에 있어서,상기 유청 단백질 가수분해물은 유청 단백질 농축액을 뉴트라제 (neutrase), 트립신 (trypsin), 알칼라제 (alcalase) 및 프로타맥스 (protamax) 중에서 선택된 하나 이상의 프로테아제 효소로 가수분해도가 3 내지 4% 범위가 되도록 가수분해한 후 반응 상층액만을 분무건조하여 제조된 것을 특징으로 하는 기능성 건강음료.
- 삭제
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- 제 2항에 있어서,상기 유청 단백질 농축액은 단백질 함량 65 내지 85% 범위인 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 기능성 건강음료.
- 제 2항에 있어서,상기 유청 단백질 농축액은 단백질 함량 30 내지 40% 범위인 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 기능성 건강음료.
- 삭제
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