KR101414163B1

KR101414163B1 - 사카로미세스 세르바찌 ｍｙ7 및 락토바실러스 쿠르바투스 ｍｌ17 함유 스타터를 이용한 묵은지의 제조방법

Info

Publication number: KR101414163B1
Application number: KR1020130040535A
Authority: KR
Inventors: 신현경; 양은주; 김효주
Original assignee: 화원농업협동조합; 재단법인 전남생물산업진흥원
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2014-07-01

Abstract

본 발명은 사카로미세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) MY7 및 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) ML17를 포함하는 스타터를 이용한 묵은지의 제조방법을 제공함으로써, 묵은지의 풍미를 유사하게 재현하면서도 김치의 조직 연화가 거의 진행되지 않는 아삭한 묵은지를 안정적으로 제조할 수 있다.

Description

사카로미세스 세르바찌 ＭＹ7 및 락토바실러스 쿠르바투스 ＭＬ17 함유 스타터를 이용한 묵은지의 제조방법{Preparation Method for Korean Long-Term Ripened Kimchi Using Starter for Fermentation of a comprising Saccharomyces servazzii MY7 and Lactobacillus curvatus ML17}

본 발명은 스타터 균주를 이용한 김치의 제조방법, 특히 묵은지의 제조방법에 관한 것이다.

김치는 주식인 밥과 함께 한국의 식생활에 필수적인 부식으로 배추, 무 등의 여러 가지 채소류를 소금에 절인 다음 마늘, 고추 등의 향신료와 젓갈 등의 부재료를 첨가하여 숙성시킨 우리나라 고유의 전통 발효식품이다.

영양적인 측면에서도 식이섬유소, 비타민, 무기질 등의 공급원이며 항산화 물질이 풍부한 고추와 마늘 등을 부재료로 사용하여 항산화, 항비만, 동맥경화 억제효과, 항암효과 등의 건강 기능 효과가 보고되고 있으며, 유산균 발효에 의한 항균 및 프로바이오틱으로서의 효과, 항산화 활성 유도 및 면역 활성 증가에 관한 연구가 이루어지고 있다.

김치는 2001년 코덱스(Codex) 국제식품규격 채택이후 2006년 미국의 건강 잡지인 Health에서 세계 5대 건강식품으로 선정되는 등 이제는 우리나라 전통식품에서 더 나아가 국제적인 식품으로도 관심이 점차적으로 높아지고 있다.

전통적인 김치의 소비는 집에서 담가먹는 것이 일반적이었으나, 식품산업의 발달, 가족규모의 변화, 여성들의 사회참여 그리고 외식 및 단체급식의 증가 등 사회적인 현상과 더불어 외부로부터 구매소비도 늘어가고 있다.

가정식 김치에서 공장식 김치의 시장성이 크게 증대되어 산업화 생산을 기반으로 하는 시판 김치의 공급이 활발해지고 대기업이 김치 생산에 참여함으로써 시장이 크게 확대되고 김치 산업이 지속적으로 발전하고 있는 추세이다.

최근에는 소비자의 기호도가 다양해지고 웰빙 음식을 선호하는 추세에 따라 묵은지 및 이를 이용한 찜, 탕, 볶음 등의 다양한 형태의 요리로 접목되어 개발되고 있으며 이에 대한 소비자의 수요 또한 증가하고 있다.

묵은지는 양념이 많이 들어가지 않고 1년 이상 장기 숙성된 묵은 김치를 뜻하는 말로 독특한 풍미를 가지는 별미 김치이다. 그러나 숙성하는 기간이 너무 길어 증가하는 수요에 따른 공급이 원활하지 않고 장기 저장에 따른 비용 부담이 발생하며 김치 제조업체에서도 의도적으로 과하게 숙성된 김치를 상품화하고 있는 실정이다.

상기 김치의 장기 숙성에는 유산균과 효모가 관여하는 것으로 알려져 있고, 발효온도에 따라 유산균과 효모의 증식속도는 다르지만 숙성이 진행되면서 젖산균의 증식이 활발해지다가 pH가 낮아지면 젖산균은 점차 줄어들고 효모의 생육이 활발해 지는 것으로, 효모는 김치를 담근 직후에는 겨울철 온도(1~8℃)에서 140 CFU/ml이지만, 발효기간이 경과함에 따라 40-50일 후 10⁴CFU/ml 수분으로 증가하고, 유산균 수가 최고 수치를 이루다가 감소되는 시점부터 오히려 계속적으로 증가하고 있으며, 이러한 결과는 김치발효과정에 서 유산균에 의하여 유산을 비롯한 각종 유기산의 생성으로 pH가 낮아지면서 유산균은 점차 소멸되지만 효모는 오히려 생육에 적합한 조건을 제공하기 때문으로 알려져 있고, 특히 말기에 이르러 효모가 급증하는 것은 산막효모가 왕성하게 번식하기 때문이라고 알려져 있다[노완섭:한국산 침채류의 발효숙성에 관여하는 효모의 연구, 동국대 박사학의논문, 1980]. 상기 산막효모는 김치의 외관을 손상시키고 배추의 조직을 연화시키며 풍미저하의 원인으로 보고되고 있다[최국지: 김치에서 분리한 효모에 관한 연구, 효모의 분리동정, 한국미생물학회지, 16(1),1, 1978].

김치의 제조에 스타터 균주를 첨가하는 이유는 분리 및 동정된 스타터 균주가 김치 숙성과정에서 지배균으로 점유되어 김치의 미생물 조성과 이화학적 성질이 조절되어 품질과 맛이 균일한 김치를 안정적으로 제조할 수 있도록 하기 위한 것으로, 이와 관련하여 한국특허 제0519083호에서는 류코노스톡 메센터로이데스 K8P4(기탁번호 KCTC 10527BP)를 스타터로 사용하고 있고, 한국공개특허 제2009-0080797호에서는 락토바실러스 사케이 OPK 2-59(기탁번호 KFCC 11392P)를 스타터로 사용하여 감마-아미노부틸산(GABA) 함량이 높은 김치를 제조하는 기술이 개시되어 있다.

특히 품질과 맛이 균일한 묵은지 제조를 위한 스타터에 관한 것으로는, 한국공개특허 제2011-0055156호에는 락토바실러스 플란터럼 KCTC 3928을 이용하여 상온(16-18도)에서는 72시간 발효시킨 후 중온(10-15도)에서 5-7일 후발효 시킨 다음 저온(4-5도)에서 숙성시켜 짧은 시간에 6개월 숙성 묵은지와 유사한 조직을 가진 김치를 제조하는 기술이 개시되어 있다.

그러나 묵은지의 제조를 위한 김치의 숙성 과정에 상호 복합적으로 영향을 주는 유산균과 효모를 각각 분리 및 동정하여 이들 혼합 균주를 스타터로 활용하는 기술은 개시된 바 없고, 특히 속성 발효를 통해 묵은지의 풍미를 유사하게 재현하면서도 김치의 후기 숙성과정에서의 김치의 조직 연화를 가져오는 산막 효모의 증식을 억제할 수 있는 기술에 대해서는 개시된 바 없다.

본 발명은 묵은지의 풍미를 유사하게 재현하면서도 김치의 조직 연화가 거의 진행되지 않는 아삭한 묵은지를 제조하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 과제해결을 위하여, 사카로미세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) MY7 [기탁번호: KCCM 11307P] 및 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) ML17 [기탁번호: KCCM 11306P], 또는 상기 균주들을 포함하는 스타터를 소금에 절인 김치용 채소 및 양념과 혼합하여 김치를 제조하는 단계; 및 상기 김치를 발효시키는 단계;를 포함하는 묵은지의 제조방법를 제공한다.

본 발명의 묵은지의 제조방법에서, 상기 김치 g 중량당 상기 사카로미세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) MY7는 1×10⁴ 내지 1×10⁶CFU, 상기 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) ML17는 1×10⁶ 내지 1×10⁸CFU 첨가하여 혼합하는 것이 바람직하다.

본 발명의 묵은지의 제조방법에서, 상기 사카로미세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) MY7와 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) ML17의 균수의 비는 1:50 내지 1:500인 것 바람직하다.

본 발명의 묵은지의 제조방법에서, 상기 김치를 발효시키는 단계는 8 ℃ 내지 15 ℃에서 1차 발효시킨 후, -3℃ 내지 2 ℃에서 2차 발효시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 묵은지의 제조방법에서, 상기 1차 및 2차 발효기간 동안 김치에 존재하는 효모 균총중 상기 사카로미세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) MY7의 점유율이 90% 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 묵은지의 제조방법에서, 상기 1차 발효는 pH 4.5 내지 4.2 이하 또는 산도 0.5 내지 0.6 %의 조건을 충족할 때까지 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 묵은지의 제조방법에서, 상기 1차 발효의 기간은 5 내지 10 일인 것이 바람직하다.

본 발명의 묵은지의 제조방법에서, 상기 2차 발효는 pH 4 이하 또는 산도 1 % 이상의 조건을 충족할 때까지 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 묵은지의 제조방법에서, 상기 2차 발효의 기간은 20 내지 100 일인 것이 바람직하다.

본 발명은 유산균과 효모 혼합 균주 스타터를 이용하고, 발효온도와 기간을 조절하여 2단계로 김치를 발효시킴으로써 묵은지의 풍미를 유사하게 재현하면서도 김치의 조직 연화가 거의 진행되지 않는 아삭한 묵은지를 안정적으로 제조할 수 있다.

도 1은 실험예 3에서 본 발명의 ML17 유산균의 그람염색 후 현미경 관찰한 사진이다.
도 2는 실험예 3에서 본 발명의 MY7 효모의 현미경 관찰한 사진이다.
도 3은 실험예 4에서 용혈성 테스트 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 실험예 5에서 ML17 유산균의 pH 내구성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험예 5에서 MY7 효모의 pH 내구성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 실험예 5에서 ML17 유산균의 염 내구성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실험예 5에서 MY7 효모의 염 내구성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실험예 5에서 락토바실러스 쿠르바투스 ML17을 MRS 배지(pH 2.5), 인공위액(pepsin 1,000 UN/ml, pH 2.5), 인공담즙(0.3% oxgall)으로 처리한 후 생존율을 확인하여 그 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는는 실험예 6에서 ML17 유산균이 김치의 이상발효를 일으키거나 식품유해균인 미생물에 대한 항균활성을 나타낸 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험예 1: 묵은지 제조용 스타터 제조를 위한 단일 균주의 선정

묵은지 제조용 스타터 균주 선별을 위하여, 묵은지에서 4 종의 유산균(ML7, ML11, ML13 및 ML17)과 1 종의 효모(MY7)를 분리하였다. 또한 상기 묵은지에서 분리한 균주 이외에 김치 적숙기의 주요 발효균주인 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)와 발효 후기의 주요균주인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 한국생명공학연구원 생명자원센터에서 1종씩 분양받았다. 분양받은 균주는 Leu. mesenteroides KCTC 13374와 Lb. plantarum subsp. plantarum KCTC 3093이었다.

스타터 평가용 묵은지의 제조는, 배추 포기김치를 3 내지 5 cm로 절단한 후 김치 중량 기준으로 g당 유산균은 10⁷ CFU를, 효모는 10⁵ CFU를 묵은지용 양념에 첨가하여 버무린 다음 10℃에서 7일 동안 1차 발효한 후 0℃에서 28일 동안 2차 발효하였다.

스타터 균주 선별을 위한 관능평가는 전남식품산업연구센터 직원 12명이 묵은지 맛(mukeunji flavor), 군덕내(off-flavor), 신맛(sourness), 탄산미(carbonated flavor), 감칠맛(savory taste)과 종합 기호도(overall acceptability)에 대하여 5점 척도법으로 평가하여 표 1에 나타내었다. 양성대조군으로 시판중인 1년 숙성 묵은지(이맑은 묵은지)를 구입하여 사용하였고, 음성대조군으로 스타터 균주를 첨가하지 않고 1차 및 2차 발효한 김치를 사용하였다.

구분		묵은지맛	군덕내	신맛	탄산미	감칠맛	종합기호도
양성대조군		4.50±0.52^a	2.50±1.09^abc	3.25±0.62^abc	3.17±0.72^b	3.67±0.98^ab	4.42±0.51^a
음성대조군		3.58±1.16^abcd	1.83±1.03^ab	3.67±1.23^ab	2.83±1.4^b	2.92±1.31^bcd	3.08±1.0^b
유 산 균	ML7	3.67±0.98^abc	1.83±1.34^ab	2.92±0.79^bcde	3.08±0.9^b	3.17±0.94^bc	3.00±0.85^bc
	ML11	3.00±0.95^cde	2.921.24^bc	2.58±0.67^bcde	2.17±0.94^b	2.33±0.78^cd	2.08±0.67^cd
	ML13	3.25±0.87^cde	3.17±1.4^a	2.58±1.44^bcde	2.67±1.5^b	2.75±1.29^bcd	2.67±1.15^bc
	ML17	3.42±1.08^cd	2.50±1.38^abc	3.17±1.27^bcd	3.00±0.95^b	2.83±1.03^bcd	2.92±0.9^bc
	KCTC 13093	2.42±1.0^e	1.92±1.38^ab	2.92±1.08^bcde	2.58±0.51^b	2.25±0.97^cd	2.08±1.08^cd
	KCTC 13374	3.33±0.89^cde	2.50±1.38^abc	3.08±0.9^bcde	3.00±1.28^b	3.25±1.14^bc	3.08±1.0^b
효모	MY7	50±1.38^bcd	83±1.53^bc	75±1.22^bcde	00±1.41^b	58±1.0^cd	75±1.06^bc

분리된 4종의 유산균과 1종의 효모는 물론 분양받은 류코노스톡 메센테로이데스KCTC 13374와 락토바실러스 플란타룸 KCTC 3093 어느 것도 단독으로는 양성대조군을 뛰어넘는 묵은지 맛이나, 종합기호도를 나타내는 균주를 확인할 수 없었다.

실험예 2: 묵은지 제조용 스타터 제조를 위한 혼합 균주의 선정

실험예 1에서 표 1의 균주들을 단독으로 스타터로 사용하였을 때 양성대조군에 비해 더 나은 묵은지 맛이나, 종합기호도를 갖는 묵은지를 제조할 수 없었으나, 상기 유산균과 효모를 혼합 사용했을 때 스타터로서 상승효과를 나타내는 지를 확인하기 위하여 실험예 1에서 분리한 MY7 효모와 함께 각각의 유산균을 혼합 사용하여 김치를 제조하였다.

구분	묵은지맛	군덕내	신맛	탄산미	감칠맛	종합기호도
양성대조군	4.50±0.52^a	2.50±1.09^abc	3.25±0.62^abc	3.17±0.72^b	3.67±0.98^ab	4.42±0.51^a
음성대조군	3.58±1.16^abcd	1.83±1.03^ab	3.67±1.23^ab	2.83±1.4^b	2.92±1.31^bcd	3.08±1.0^b
ML7 + MY7	2.83±1.34^cde	2.75±1.14^bc	2.25±1.42^cde	2.92±1.0^b	2.58±0.9^cd	2.50±0.8^bcd
ML11 + MY7	2.67±1.23^cde	2.42±1.16^abc	3.00±1.21^bcde	3.00±0.74^b	2.58±0.9^cd	2.42±0.9^bcd
ML13 + MY7	2.58±1.08^de	3.17±1.27^a	2.08±1.24^de	2.75±1.36^b	1.92±1.0^d	1.75±1.06^d
ML17 + MY7	4.42±0.67^ab	1.42±0.9^a	4.17±0.94^a	4.50±0.52^a	4.25±0.87^a	4.58±0.51^a
KCTC 13093 + MY7	2.83±0.94^cde	2.25±1.48^abc	2.67±1.44^bcde	2.75±1.14^b	2.67±1.3^cd	2.42±1.24^bcd
KCTC 13374 + MY7	3.50±1.24^bcd	2.75±1.42^bc	2.00±1.13^e	2.75±1.29^b	2.92±1.24^bcd	2.83±1.34^bc

ML17 유산균과 MY7 효모 혼합균주 스타터 김치가 묵은지 맛을 제외한 모든 항목에서 가장 높은 점수를 나타내었다. 묵은지 맛은 4.42점으로 4.5점을 나타낸 1년 숙성 묵은지보다 약간 낮은 점수였으나 통계적으로 유의적 차이는 없었다.

군덕내는 강도평가로서 대체로 3점(보통)이하의 점수를 보였으며, 신맛은 ML17 유산균과 MY7 효모 혼합균주 스타터 김치가 4.17점으로 가장 좋았으며 대조구(3.67점)와 1년 숙성 묵은지(3.25점)도 유의적으로 좋게 평가되었다.

탄산미의 경우 ML17 유산균과 MY7 효모 혼합균주 스타터 김치가 4.5점으로 아주 높은 점수를 나타냈으며 다른 실험구들의 경우 유의적으로 낮은 점수를 나타냈으며, 그 실험구들 간에는 유의적 차이가 없었다.

감칠맛과 종합 기호도 역시 ML17 유산균과 MY7 효모 혼합균주 스타터 김치가 4.25점, 4.58점으로 가장 높은 점수를 나타났다. 그 다음으로 1년 숙성 묵은지가 높았으며(3.67점, 4.42점) 이들 간의 유의적 차이는 없었다.

김치유래 공시균주 첨가 김치는 효모와 함께 첨가된 경우 묵은지 맛 점수가 좀 더 높아졌으며 Leu. mesenteroides KCTC 13093보다는 김치 발효 후기에 주로 분리되는 균주인 Lb. plantarum KCTC 13374첨가 김치에서 좀 더 높은 점수를 받았으나, 최고점을 받은 ML17 유산균과 MY7 효모 혼합균주 스타터 김치와는 유의적 차이를 나타내었다.

관능 평가 결과를 종합해 볼 때, 유산균 또는 효모의 단독 사용에서는 10℃에서 7일 동안 1차 발효한 후 0℃에서 28일 동안 2차 발효라는 짧은 기간동안 양성대조군과 같은 1년 숙성 묵은지의 풍미를 유사하게 재현할 수 없었으나, 본 발명에서 분리한 ML17 유산균과 MY7 효모를 스타터로 복합 사용함으로써, 1년 숙성 묵은지의 풍미를 재현할 수 있음을 알게 되어 ML17 유산균과 MY7 효모를 묵은지 제조용 스타터의 혼합종균으로 선정하였다.

실험예 3: 묵은지 제조용 스타터 균주의 동정

1) 형태학적 관찰

묵은지 제조용 스타터 제조를 위한 균주의 동정을 위해 ML17 유산균과 MY7 효모를 각각 1차적으로 형태학적 특성을 관찰하여 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.

ML17 유산규은 둥글고 매끈하며 흰색의 집락을 형성하는 gram 양성의 간균으로 확인되었으며, MY7 효모는 매끈하고 둥근 아이보리색 집락을 나타내었으며 세포의 형태는 ellipsoide 형태를 나타내었다.

2) 유산균의 당대사능 확인

ML17 유산균의 경우 API 50 CHL system(BioMerieux, Marcy, IEtoile, France)을 이용하여 당 대사능을 조사하여 표 3에 나타내었다.

당 종류	대사능	당 종류	대사능
Control	-	Esculine	+
Glycerol	-	Salicine	+
Erythritol	-	Cellobiose	+
D-Arabinose	-	Maltose	+
L-Arabinose	+	Lactose	-
Ribose	+	Melibiose	+
D-Xylose	+	Sucrose	+
L-Xylose	-	Trehalose	+
Adonitol	-	Inuline	-
β-Methyl-xyloside	-	Melezitose	-
Galactose	+	Raffinose	+
D-Glucose	+	Startch	-
D-Fructose	+	Glycogen	-
D-Mannose	+	Xylitol	-
L-Sorbose	-	β-Gentiobiose	+
Rhamnose	-	D-Turanose	+
Dulcitol	-	D-Lyxose	-
Inositol	-	D-Tagatose	-
Manitol	-	D-Fucose	-
Sorbitol	-	L-Fucose	-
α-Methyl-D-mannoside	-	D-Arabitol	-
α-Methyl-D-Glucoside	+	L-Arabitol	-
N-Acetyl glucosamine	+	Gluconate	-
Amygdaline	+	2-Keto-Gluconate	+
Arbutine	-	5-Keto-Gluconate	-

표 3에 나타낸 것과 같이, ML17 유산균은 총 49종의 당류 중 L-arabinose, ribose, D-xylose, galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, α-methyl-D-glucose, N-acetyl glucosamine, amygdaline, esculie, salicine, cellobiose, maltose, melibiose, sucrose, trehalose, raffinose, β-gentiobiose, D-turanose, 2-keto-gluconate 등 22종의 당을 이용하는 것으로 나타났다.

3) 분자생물학적 동정

최종적인 동정을 위하여 ML17 유산균은 16S rRNA 염기서열을, MY7 효모는 18S(partial), ITS, 5.8S, 28S(partial)을 포함하는 rRNA의 염기서열을 결정하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 blastn program을 이용하여 분석한 후 GenBank에 등록된 표준군주(type strain)와의 상동성을 비교하였다.

ML17 유산균의 16S rRNA 염기서열은 서열번호 1에 나타내었고, MY7 효모의 18S rRNA 염기서열은 서열번호 2에 나타내었다.

이를 GenBank에 등록된 다른 균주들과 염기서열을 비교한 결과 ML17 유산균은 표준균주인 Lactobacillus curvatus NBRC 15884와 99%, MY7 효모는 Saccharomyces servazzii NRRL Y-12661와 99%의 상동성을 나타내어, 유산균 ML17은 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) ML17로 명명하여 한국미생물보존센터에 2012년 10월 12일 기탁하고, 기탁번호 KCCM 11306P를 부여받았고, 효모 MY7은 사카로미세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) MY7로 명명하고 한국미생물보존센터에 2012년 10월 12일 기탁하여 기탁번호 KCCM 11307P를 부여받았다.

실험예 4: ML17 유산균 및 MY7 효모의 안전성

1) 용혈성 시험

상기 실험예 3에서 동정된 락토바실러스 쿠르바투스 ML17 및 사카로미세스 세르바찌 MY7가 인체에 대한 용혈 독성이 없음을 확인하기 위하여, horse blood agar 배양법으로 용혈성 여부를 시험하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 대조군으로는 바실러스 세레우스 KCCM 11204를 이용하였다.

대조군으로 사용한 바실러스 세레우스는 균체 주위에 적혈구가 파괴되어 생기는 투명환을 생성하여 용혈반응을 나타내었으나, ML17 유산균과 MY7 효모는 용혈반응을 나타내지 않음을 확인하였다.

2) 효소활성 시험

상기 실험예 3에서 동정된 락토바실러스 쿠르바투스 ML17 및 사카로미세스 세르바찌 MY7의 효소활성을 API ZYM kit를 사용하여 조사하여 표 4에 나타내었다.

Enzyme	ML17	MY7
Control	-¹⁾	-
Alkaline phosphate	-	+
Esterase(C4)	-	-
Esterase lipase(C8)	-	-
Lipase(C14)	-	-
Leucine arylamidase	+	+
Valine arylamidase	+	-
Crystine arylamidase	-	-
Trypsin	-	-
α-Chymotrypsin	-	-
Acid phosphatase	-	-
Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase	-	-
α-Galactosidase	-	-
β-Galactosidase	-	-
β-Glucuronidase	-	-
α-Glucosidase	-	-
β-Glucosidase	-	-
N-Acetyl-β-glucosaminidase	-	-
α-Mannosidase	-	-
α-Fucosidase	-	-

¹⁾효소활성은 비색법에 의해 측정되었다. 0은 음성 반응, 5는 최대 반응, 1 내지 4는 중간 반응을 나타내고, 3 이상을 +로 나타내었다.

락토바실러스 쿠르바투스 ML17 및 사카로미세스 세르바찌 MY7 모두 벤조피렌 등의 물질이 체내 유입시 발암물질로 전환하는 효소인 β-glucuronidase에 대한 활성이 없는 것으로 나타났다.

실험예 5: ML17 유산균 및 MY7 효모의 내산성, 내염성 및 장내생존성

1) 내산성

실험예 3에서 동정된 락토바실러스 쿠르바투스 ML17 및 사카로미세스 세르바찌 MY7 균주를 pH가 3, 4, 5, 7, 9로 조정된 배지에 현탁하여 4℃에서 24시간 처리한 후 생균수를 측정하여 pH처리전(initial)과 pH처리후(treatment)의 생균수를 도 4 및 도 5에 각각 나타내었다.

두 균주 모두 모든 pH 처리구간에서 초기균수를 유지하여 pH에 대한 내구성이 있음을 확인하였다.

2) 내염성

실험예 3에서 동정된 락토바실러스 쿠르바투스 ML17 및 사카로미세스 세르바찌 MY7 균주를 NaCl이 2, 5, 8, 10, 15% 함유된 배지에 ML17 유산균 또는 MY7 효모를 현탁하여 4℃에서 24시간 처리한 후 생균수를 측정하여 염 처리전(initial)과 염 처리후(treatment)의 생균수를 도 6 및 도 7에 각각 나타내었다.

두 균주 모두 모든 NaCl 농도구간에서 초기균수(10⁷ CFU/ml 이상)를 유지하여 염에 대한 내구성이 있음을 확인하였다.

3) 장내생존성

구강을 통하여 섭취된 유산균이 장에 도달하기 위하여 강산성의 위액과 십이지장에서 분비되는 담즙에 대한 내성을 갖추어야하므로, 실험예 3에서 동정된 스타터 균주 중 락토바실러스 쿠르바투스 ML17의 식품용 프로바이오틱 생균으로서의 가능성을 조사하기 위하여 장내생존성 평가를 시행하였다. 락토바실러스 쿠르바투스 ML17을 MRS 배지(pH 2.5), 인공위액(pepsin 1,000 UN/ml, pH 2.5), 인공담즙(0.3% oxgall)으로 처리한 후 생존율을 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.

ML17 유산균은 초기 생균수 9.1 log CFU/ml에서 pH 2.5인 MRS 배지와 인공위액 처리 후 각각 7.2와 7.3 log CFU/ml로 감소하였으며, 인공담즙 처리 후에는 7.6 log CFU/ml를 나타내었다. 그러나 인공위액 2시간 처리 후 인공담즙을 처리한 경우 생균수는 8.2 log CFU/ml로 상승하였다. ML17 유산균은 인공위액과 인공담즙 처리에서 생균수가 7.0 log CFU/ml 이상을 유지하므로 프로바이오틱으로서의 활용가능성이 있을 것으로 보인다.

실험예 6: ML17 유산균의 항균활성

1) 생균에 대한 항균활성

김치는 살균이 되지 않은 원부재료에서 이입되는 다양한 복합균으로 인하여 발효제어가 되지 않으므로 일정한 맛과 품질을 유지하기 어렵고, 김치의 스타터로 이용되기 위해서는 발효 초기에 오염된 잡균을 제어하면서 발효기간동안 높은 점유율을 유지하며 김치의 맛과 품질을 일정하게 유지할 수 있어야하므로, 본 발명의 실험예 3에서 동정한 ML17 유산균이 김치의 이상발효를 일으키거나 식품유해균인 미생물에 대해 항균활성을 나타내는지 dual culture overlay assay 방법으로 확인하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.

본 발명의 실험예 3에서 동정한 ML17 유산균은 Micrococcus luteus, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Esherichia coli O157, Salmonella enterica 등의 유해 균주에 대한 높은 항균활성을 나타냄을 확인하였다.

2) ML17 유산균이 생산하는 항균물질의 pH 안정성

ML17 유산균이 생산하는 항균물질이 김치가 발효되는 산성조건에서 불안정할 경우 스타터로 활용되었을 때 잡균의 증식을 억제하는 항균활성을 충분히 발휘하기 어렵다는 점에서 ML17 유산균이 생산하는 항균물질의 내산성을 측정하였다.

ML17 유산균의 24시간 배양액을 제균한 후 5배 농축하고, pH에 따른 항균활성을 측정하여 표 5에 나타내었다.

구분	항균활성(Au/ml)
대조군	1600
pH6.0	100
pH5.0	400
pH4.0	1600
pH3.0	3200

ML17 유산균이 생산하는 항균물질은 중성 조건에서보다 오히려 산성 조건으로 갈수록 항균활성이 증대됨을 확인하였고, 따라서 김치의 발효과정에서 산성화될수록 그 항균활성이 높아질 것으로 기대되었다.

실시예 1:

배추는 해남 월동 배추를 2등분하여 천일염 염수 16 ~ 17%에서 14 ~ 16시간 절인 후 세척 및 탈수하여 김치 제조에 사용하였다. 재료의 배합 비율은 절임 배추 77.8%, 찹쌀풀 6.64%, 고춧가루 3%, 무 5%, 멸치액젓 1%, 새우젓 1%, 마늘 1.4%, 대파 0.8%, 양파 0.8%, 홍갓 0.5%, 생강 0.22%, 설탕 0.3%, 소금 0.14%, 참깨 0.1%, 표고버섯 0.01%로 제조하였다(본 발명의 명세서에서 특별히 달리 언급하지 않은 경우 %는 중량%를 의미한다).

묵은지 제조용 스타터를 위한 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) ML17과 사카로미세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) MY7의 배양액은 원심분리(10,000 rpm, 15 min, 4℃) 후 멸균수로 2회 세척하여 묵은지 양념에 혼합하였으며, 접종량은 김치 중량 기준으로 g당 유산균 ML17은 10⁷ CFU를, 효모 MY7은 10⁵ CFU가 되도록 첨가하였다(ML17 및 MY7의 균수 비는 100:1). 스타터를 첨가하여 제조된 김치(starter kimchi)는 1 kg씩 파우치팩에 담아 10℃에서 7일간 1차 발효시킨 후, -1℃에서 90일까지 2차 발효시켜 실시예 1의 묵은지를 제조하였다.

상기 실시예 1과 동일하게 김치를 제조하되, 스타터를 첨가하지 않은 김치(control kimchi)를 음성대조군으로 하였다.

비교예 1:

실시예 1과 동일하게 김치를 제조하되, 스타터의 접종량은 김치 중량 기준으로 g당 유산균 ML17은 10⁷ CFU를, 효모 MY7은 10⁷ CFU가 되도록 첨가하였다(ML17 및 MY7의 균수 비는 1:1).

비교예 2:

실시예 1과 동일하게 김치를 제조하되, 스타터의 접종량은 김치 중량 기준으로 g당 유산균 ML17은 10⁵ CFU를, 효모 MY7은 10⁷ CFU가 되도록 첨가하였다(ML17 및 MY7의 균수 비는 1:100).

비교예 3:

실시예 1과 동일하게 김치를 제조하되, 2차 발효 없이 10℃에서 30일까지 발효시켜 비교예 3의 묵은지를 제조하였다.

비교예 4:

실시예 1과 동일하게 김치를 제조하되, 2차 발효 없이 20℃에서 14일까지 발효시켜 비교예 4의 묵은지를 제조하였다.

비교예 5:

실시예 1과 동일하게 김치를 제조하되, 2차 발효 없이 -1℃에서 180일까지 발효시켜 비교예 5의 묵은지를 제조하였다.

비교예 6:

실시예 1과 동일하게 김치를 제조하되, 10℃에서 14일간 1차 발효시킨 후, -1℃에서 30일까지 2차 발효시켜 비교예 6의 묵은지를 제조하였다.

실험예 7: 발효단계 및 기간에 따른 pH 및 산도

실시예 1 및 비교예 1 내지 7의 스타터 균주를 첨가하고 버무린 후, 각각의 발효조건에 따라 보관하면서 pH 및 산도를 측정하여 각각 표 6 및 표 7에 나타내었다.

pH는 김치를 믹서기(Braun MX2050, Linaset A.S, Czech Republic)로 마쇄하여 거즈로 여과한 김치여액을 pH meter(Mettler-toledo GmbH 8603, Schwerzenbach, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 총산은 AOAC법에 따라 김치여액 10 mL을 0.1 N NaOH로 pH 8.3이 될 때까지 적정한 다음 소비된 NaOH 부피를 젖산량으로 환산하여 계산하였다.

구분	0일	7일	14일	21일	30일	60일	90일	120일	180일
음성대조군	5.89	5.07	4.45	4.35	4.37	4.25	4.13	NT	NT
실시예1	5.76	4.42	4.26	4.21	4.13	4.04	3.94	NT	NT
비교예1	5.79	4.55	4.39	4.33	4.26	4.14	4.06	NT	NT
비교예2	5.82	5.14	4.62	4.53	4.45	4.32	4.15	NT	NT
비교예3	5.78	4.42	4.02	3.84	3.71	NT	NT	NT	NT
비교예4	5.76	4.10	3.75	NT	NT	NT	NT	NT	NT
비교예5	5.66	5.32	5.19	5.08	4.92	4.53	4.38	4.22	4.11
비교예6	5.78	4.40	4.02	3.94	3.88	NT	NT	NT	NT
양성대조군	1년 숙성 3.96

NT는 "Not Tested"의 약어로 사용함

구분	0일	7일	14일	21일	30일	60일	90일	120일	180일
음성대조군	0.23	0.41	0.62	0.66	0.69	0.79	0.87	NT	NT
실시예1	0.27	0.56	0.76	0.77	0.88	0.92	1.18	NT	NT
비교예1	0.27	0.52	0.67	0.68	0.75	0.84	0.98	NT	NT
비교예2	0.28	0.38	0.58	0.60	0.63	0.70	0.85	NT	NT
비교예3	0.28	0.55	0.97	1.15	1.38	NT	NT	NT	NT
비교예4	0.28	1.02	1.56	NT	NT	NT	NT	NT	NT
비교예5	0.28	0.32	0.37	0.44	0.48	0.58	0.66	0.73	0.83
비교예6	0.26	0.54	0.95	1.10	1.24	NT	NT	NT	NT
양성대조군	1년 숙성 1.25

김치의 숙성에 따라 pH는 저하되고 산도는 증가하는 경향을 나타내었으나 음성대조군 김치에 비하여 실시예 1의 pH가 더 빨리 저하되어 발효 90일 동안 낮은 pH를 유지하였다.

음성대조군 김치의 경우 제조당일 pH 5.89에서 1차 발효 종료 시점인 발효 7일에 pH 5.07, 발효 14일에는 pH 4.45를 나타내며 이 기간 동안 급격히 감소하였다가 이후 완만하게 감소하여 발효 90일에는 pH 4.13을 나타내었다.

실시예 1의 김치의 경우 제조당일 pH 5.76에서 1차 발효 종료 시점인 발효 7일에 pH 4.42로 급격히 감소하였다가 이후 완만하게 감소하여 발효 90일에는 pH 3.94를 나타내었다.

비교예 1의 김치는 ML17 유산균과 MY7 효모의 접종량을 동일하게 한 것으로 제조당일 pH 5.79에서 1차 발효 종료 시점인 7일째에 pH 4.55로 급격히 감소하였다가, 이후 완만하게 감소하여 발효 90일에는 pH 4.06을 나타내었고, 비교예 2의 김치는 ML17 유산균에 비해 MY7 효모의 접종량을 100배가 되도록 한 것으로 제조당일 pH 5.82에서 1차 발효 종료 시점이 7일째에 pH 5.14로 실시예 1보다 낮은 폭으로 감소하였다가 발효 14일째에 pH 4.62를 나타내었고, 이후 완만하게 감소하여 발효 90일에는 pH 4.15를 나타내었다.

비교예 3 내지 5는 1차 및 2차 발효 온도를 구별하지 않고 각각 10 ℃에서 30일, 20 ℃에서 14일, 및 -1 ℃에서 180일 동안 1년 숙성 묵은지와 유사하게 pH 4 이하 및 산도 1 %이 될 때까지 발효시킨 것으로, 비교예 3은 21일째에 pH 4 이하가 되었고, 비교예 4는 14일째에 pH 4 이하가 되었으며, 비교예 5는 180일 발효 후에도 pH가 4.11이었다.

비교예 6은 10 ℃에서 14일간 1차 발효시킨 후, -1 ℃에서 30일째까지 2차 발효시킨 것으로, 제조당일 pH 5.78에서, 7일째에 pH 4.40, 1차 발효 종료 시점인 14일째에 pH 4.02 로 급격히 감소하였다가, 이후 완만하게 감소하여 발효 21일째에는 pH 3.94, 발효 30일째에는 pH 3.88을 나타내었다.

산도의 경우 pH 결과와 비슷하게 나타났으며, 음성대조군 김치에 비하여 실시예 1의 김치의 경우 가 더 높은 산도를 유지하였다. 음성대조군 김치의 경우 제조당일 산도 0.23%에서 발효 7일에 0.41%, 발효 14일에 0.62%로 급격하게 증가하였으며 이후 완만하게 증가하여 발효 90일에는 0.87%를 나타내었다. 실시예 1의 김치의 경우 제조당일 산도 0.27%에서 발효 7일에 0.56%, 발효 14일에 0.76%를 나타내며 급격하게 증가하였으며 이후 점차 증가하여 발효 90일에는 1.18%를 나타내었다.

비교예 1의 김치는 제조당일 산도 0.27%에서 발효 7일째에 0.52%, 발효 14일에 0.67%를 나타내었으며 이후 점차 증가하여 발효 90일째에 0.98%를 나타내었고, 비교예 2의 김치는 제조당일 0.28%에서 7일째에 0.38%로 증가하였다가 발효 14일째에 0.58%를 나타내었고, 이후 점차 증가하여 발효 90일째에 0.85%를 나타내었다.

비교예 3 내지 5는 1차 및 2차 발효 온도를 구별하지 않고 각각 10, 20 및 -1 ℃에서 발효시킨 것으로, 비교예 3은 21일째에 1.15 %, 30일째에 1.38 %가 되었고, 비교예 4는 14일째에 1.56 %가 되었으며, 비교예 5는 180일 발효 후에도 0.83 %로서 산도 1 % 이상이었다.

비교예 6은 제조당일 0.28%에서, 1차 발효 종료 시점인 14일째에 0.95 %로 급격히 감소하였다가, 이후 완만하게 감소하여 발효 21일째에는 1.1 %, 발효 30일째에는 1.24 %를 나타내었다.

pH 및 산도 측정 결과 실시예 1 김치가 음성대조군 김치보다 같은 기간 발효가 더 빨리 진행되는 것으로 나타났으며 발효 90일에 실시예 1 김치의 pH와 산도 결과는 1년 숙성 묵은지(이맑은 묵은지, 양성대조군)의 결과(pH 3.96, 산도 1.25%)와도 유사한 수준이었다. 이와 같은 결과는 스타터의 첨가에 따라 김치의 발효가 촉진되었기 때문이며 김치 제조 후 10℃에서 1차 발효과정을 거치면서 김치의 적숙기인 pH 4.2 내지 4.5, 산도 0.5 내지 0.6%까지 이르는 시간을 앞당기면서 단기간에 묵은지와 같은 숙성이 이루어진 것으로 보인다.

한편 비교예 1 및 2의 경우에는 실시예 1과 동일 발효 종료시점인 발효 90일째에 양성대조군 김치와 유사한 pH 및 산도에 도달하지 못하였고, 비교예 3 및 4의 경우에는 양성대조군 김치와 유사한 pH 및 산도를 달성하는데 각각 21일 및 14일 밖에 걸리지 않았고, 비교예 5의 -1 ℃에서 숙성시킨 경우는 180일 발효에서도 양성대조군 김치와 유사한 pH 및 산도에 도달하지 못하였으며, 비교예 6에서 10 ℃에서 1차 발효기간을 14일까지 연장한 경우 30일째에 양성대조군 김치와 유사한 pH 및 산도를 달성할 수 있었다.

실험예 9: 관능검사

상기 실시예 1의 ML17 유산균과 MY7 효모 혼합균주 스타터 김치(ML17+MY7, 90일 발효, starter kimchi), 스타터를 첨가하지 않은 김치(음성대조군, 90일 발효, control kimchi), 시판중인 1년 숙성 묵은지(이맑은 묵은지, 양성대조군, 1 year fermented kimchi) 및 비교예 1 및 2의 김치(90일 발효), 비교예 3의 김치(21일 발효), 비교예 4의 김치(14일 발효), 비교예 5의 김치(180일 발효), 비교예 6의 김치(30일 발효)의 관능검사 결과를 표 8에 나타내었다.

관능평가는 미리 훈련된 전남식품산업연구센터 연구원과 해남화원농협 김치가공공장 직원 20명이 시행하였으며, 평가 항목으로는 외관(appearance), 군덕내(off-flavor), 묵은지 맛(mukeunji flavor), 신맛(sourness), 탄산미(carbonated flavor), 감칠맛(savory taste), 질감(texture), 종합 기호도(overall acceptability)에 대하여 평가자의 기호도를 5점 척도법으로 평가하였다. 각 항목에 대한 점수는 군덕내의 경우 1점(매우 약함), 3점(보통), 5점(매우 강함)으로, 그 외 항목들은 1점(매우 나쁨), 3점(보통), 5점(매우 좋음)으로 평가하였다.

구분	묵은지맛	군덕내	신맛	탄산미	감칠맛	종합기호도
음성대조군	3.58±1.16^bc	1.83±1.03^ab	3.67±1.23^ab	2.83±1.40^bc	2.92±1.31^bcd	3.08±1.30^bc
실시예1	4.42±0.67^a	1.42±0.9^a	4.17±0.94^a	4.50±0.52^a	4.25±0.87^a	4.58±0.51^a
비교예1	3.65±1.34^bc	2.35±1.04^bcd	3.25±1.42^bc	3.92±1.31^ab	3.73±0.94^bc	3.20±0.8^b
비교예2	3.88±1.38^b	1.55±1.5^a	2.75±1.31^cd	2.62±1.41^c	2.82±1.56^cd	2.15±1.11^c
비교예3	3.58±1.22^bc	2.75±1.15^cd	4.28±1.24^a	3.32±1.08^b	1.88±1.14^d	2.85±1.16^bc
비교예4	2.65±1.18^c	3.17±1.27^d	3.72±1.34^ab	2.83±1.17^bc	2.32±1.05^cd	2.45±1.24^bc
비교예5	2.33±1.24^c	2.25±1.48^bc	2.56±1.43^d	2.88±1.15^bc	2.88±1.3^cd	2.19±1.07^bc
비교예6	3.11±1.05^bc	2.15±1.32^bc	4.20±1.08^a	2.75±1.01^bc	2.92±1.25^cd	2.82±1.24^bc
양성대조군	4.50±0.52^a	2.50±1.09^bc	3.25±0.62^bc	3.17±0.72^bc	3.67±0.98^bc	4.42±0.51^a

표 8에 따르면 모든 항목에서 실시예 1의 김치가 모든 면에서 음성대조군이나 비교예 1 내지 6의 김치에 비해 높은 점수를 나타냈다.

묵은지맛은 양성대조군의 김치가 양성대조군에서 4.50으로 가장 높았으나 실시예1의 4.42와 유의적인 차이는 없었다. 그러나 스타터를 첨가하지 않은 음성대조군의 김치, 스타터를 사용했더라도 ML17 및 MY7의 비율이나 1차 및 2차 발효 여부 및 온도를 달리한 비교예 1 내지 6에서는 묵은지맛이 실시예 1에 비해 현저히 낮음을 알 수 있었다.

군덕내에 있어서는 실시예 1에서 가장 낮은 1.42를 나타내었고, 다음으로 음성대조군이 1.83 이었으며, 비교예 1 내지 6이나 양성대조군은 모두 2 이상의 높은 값을 나타내었다. 묵은지 제조용 스타터 선정을 위한 관능 평가 결과와 마찬가지로 본 발명의 ML17 유산균과 MY7 효모 혼합균주 스타터 김치는 발효 90일 시점에서도 효모에 의한 이취발생이 없는 것으로 평가되었다. 음성대조군 김치의 경우 양성대조군 김치보다도 높은 평균점수를 나타냈는데 이는 김치 발효 후기의 산막효모가 출현하면서 군덕내와 같은 이취를 형성하는 것으로 생각되어지며, 본 발명의 ML17 유산균과 MY7 효모 혼합균주 스타터 김치의 경우 스타터로 첨가한 사카로미세스 세르바찌 MY7이 김치 내 우점 효모로 존재하면서 산막효모로 인한 부패현상을 억제하고 방향물질을 생성하여 고유한 묵은지의 발효 향미를 형성하는 것으로 여겨진다.

신맛에 있어서는 실시예 1에서 4.17, 비교예 3에서 4.28 및 비교예 6에서 4.20으로 양성대조군에 비해 현저히 높은 값을 나타내었고, 음성대조군은 양성대조군과 유사한 3.67, 나머지 비교예 1, 2, 4 및 5는 양성대조군에 비해 낮은 값을 나타내었다. 신맛의 경우 본 발명의 ML17 유산균과 MY7 효모 혼합균주 스타터 김치가 음성대조군 김치보다 더 높은 산도를 나타냈음에도 더 높은 기호도를 나타낸 것은 생성된 유기산에 의한 결과로 생각된다. 유기산의 경우 종류에 따라 각각 다른 신맛을 나타내지만 단순한 신맛에 그치지 않고 다른 미각을 동반함으로써 독특한 맛을 내게 한다.

묵은지의 경쾌한 신맛의 강도를 높이는 탄산미는 실시예 1에서 4.50, 비교예 1에서 3.92로 양성대조군에 비해 높은 값을 나타내었고, 음성대조군이나 비교예 2 내지 6은 낮은 값을 나타내었다.

감칠맛은 실시예 1에서 4.25, 비교예 1에서 3.73으로 양성대조군에 비해 높은 값을 나타내었고, 음성대조군이나 비교예 2 내지 6은 낮은 값을 나타내었다.

이들을 종합한 전체 기호도에 있어서는, 실시예 1의 김치가 1년 숙성 묵은지(양성대조군)에 비해서 오히려 높은 값을 나타내었고, 음성대조군이나 비교예 1 내지 6의 김치는 양성대조군에 비해 낮은 값을 나타내었다. 이들을 종합할 때 비교예 1, 3, 4 및 6의 김치는 신맛은 1년 숙성 묵은지(양성대조군)에 비해 높은 값을 나타내었으나, 군덕내를 양성대조군에 비해 줄이지 못하고, 신맛만 강할 뿐 묵은지맛의 강도는 낮다는 문제가 있었고, 비교예 2 및 5는 묵은지맛은 물론 신맛이나 탄산미도 약하여 기호성이 양성대조군에 비해 현저히 낮음을 알 수 있었다.

실험예 10: 스타터 첨가 유무에 따른 김치의 유기산 함량

김치의 상큼한 신맛은 김치가 숙성됨에 따라 생성되는 유기산의 함량에 큰 영향을 받으며 김치의 발효는 단순한 젖산의 생성이 아닌 다른 유기산이 복합적으로 생성되는 발효로서 유기산의 종류와 함량은 김치의 기호도에 상당한 영향을 미치므로, 상기 실시예 1의 김치(ML17+MY7, 90일 발효), 스타터를 첨가하지 않은 김치(음성대조군, 90일 발효), 시판중인 1년 숙성 묵은지(이맑은 묵은지, 양성대조군)의 유기산 함량(mg%)을 측정하여 표 9에 나타내었다.

유기산은 김치여액에 증류수를 1 mL를 가하여 1시간 방치한 후 원심분리기(Micro 17TR, Hanil science industrial Co., Ltd, Inchun, Korea)를 이용하여 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상등액을 0.45 um membrane filter(Adventec, Toyo Roshi, Japan)로 여과한 후 10배 희석하여 HPLC(ICS-3000, Dionex Co., Sunnyvale, USA)로 분석하였다. 표준물질은 oxalic acid, malic acid, succinic acid, acetic acid, lactic acid(Sigma chemical Co., St, Louis, MO, USA)를 사용하였다. column은 Shiseido C18(Capcellpak 4.6 × 250 mm, 5 um, Shiseido, Japan)을 사용하였고, solvent는 0.02% potassium phosphate buffer(pH 2.8, Sigma chemical Co.)를 사용하였으며 flow rate는 0.2 mL/min이었다. UV 조건은 210 nm, injection volume은 20 ㎕였다.

구분	Lactic acid	Acetic acid	Oxalic acid	Malic acid	Succinic acid
음성대조군	612.719^b	778.727^b	924.368^b	-	-
실시예1	815.128^a	561.761^a	694.949^a	-	-
비교예1	788.245^a	578.267^a	855.624^ab	-	-
비교예2	639.442^b	742.124^b	875.326^ab	-	-
비교예3	628.452^b	812.174^b	982.425^b	-	-
비교예4	645.119^b	795.699^b	956.258^b	-	-
비교예5	426.743^c	985.626^c	1224.428^c	-	-
비교예6	716.441^ab	679.727^ab	951.631^b	-	-
양성대조군	825.260^a	563.858^a	902.686^b	-	-

김치의 유기산 분석결과 실시예 1의 김치(90일 발효)와 1년 숙성 묵은지(양성대조군)은 김치의 신맛에 영향을 주는 젖산 함량이 815.128 mg%와 825.260 mg%로서, 스타터를 첨가하지 않은 음성대조군(90일 발효) 612.719 mg%에 비해 현저히 높은 함량의 젖산 함량을 나타내었다. 또한 비교예 1과 비교예 6의 김치는 실시예 1과 유사한 젖산 함량을 나타내었으나, 비교예 2 내지 5는 젖산 함량이 유의적으로 낮고, 특히 비교예 5에서는 젖산 함량이 현저히 낮다는 것을 알 수 있었다.

또한 아세트산 함량에 있어서, 실시예 1의 김치(90일 발효)와 1년 숙성 묵은지(양성대조군)은 아세트산 함량이 561.761 mg%와 563.858 mg%로서, 스타터를 첨가하지 않은 음성대조군(90일 발효) 778.727 mg%에 비해 현저히 낮은 함량의 아세트산 함량을 나타내었다. 또한 비교예 1의 김치는 실시예 1과 유사한 아세트산 함량을 나타내었으나, 비교예 2 내지 6는 아세트산 함량이 유의적으로 높고, 특히 비교예 5에서는 아세트산 함량이 현저히 높다는 것을 알 수 있었다.

그러나 떫고 쓴 맛을 나타내는 옥살산의 함량에 있어서는, 1년 숙성 묵은지(양성대조군)와 스타터를 첨가하지 않은 음성대조군(90일 발효)은 옥살산 함량이 902.686 mg%와 924.368 mg%이지만, 실시예 1의 김치(90일 발효)에서만 694.949 mg%로서 현저히 낮은 함량을 나타내며 묵은지의 떫고 쓴 이미을 경감시키는 것으로 확인되었다. 또한 비교예 1 내지 6의 김치는 모두 양성대조군 또는 음성대조군의 김치와 유사하게 높은 옥살산 함량을 나타내었다.

한편 말산과 숙신산의 경우에는 발효가 진행되면서 모든 시료에서 감소된 것을 알 수 있었다.

실험예 11: 발효단계 및 기간에 따른 미생물 균총의 변화

본 발명의 ML17 유산균과 MY7 효모 혼합균주 스타터 김치의 유기산 조성 및 함량이나 관능특성에 스타터 혼합균주가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 미생물 균총의 변화를 확인하여 표 10에 나타내었다.

총균수는 PCA(Plate count agar, Merck, Darmstadt, Germany)배지, 유산균수는 MRS 고체배지(Becton, Dickinson and company, Sparks, USA), 효모는 PDA(Potato dextrose agar, Merck)배지를 사용하였다. 김치는 마쇄하여 멸균거즈로 여과한 김치여액을 0.9% saline solution으로 10배씩 연속 희석하여 각각의 평판배지에 100 uL씩 도말한 후 총균은 37℃에서 2일간, 유산균은 30℃에서 2일간, 효모는 25℃에서 2일간 배양하였다.

구분	log CFU/ml	0일	7일	30일	60일	90일
음성대조군	총균수	5.3 ± 0.2	8.4 ± 0.3	9.2 ± 0.1	8.5 ± 0.2	8.4 ± 0.2
	유산균수	5.2 ± 0.3	8.3 ± 0.4	8.9 ± 0.3	8.3 ± 0.1	7.8 ± 0.2
	효모수	1.5 ± 0.4	2.8 ± 0.3	3.9 ± 0.3	4.1 ± 0.1	3.7 ± 0.3
실시예1	총균수	6.8 ± 0.3	8.8 ± 0.2	9.2 ± 0.2	7.3 ± 0.3	7.0 ± 0.1
	유산균수	6.5 ± 0.3	8.6 ± 0.1	9.1 ± 0.3	7.2 ± 0.2	6.8 ± 0.1
	효모수	4.2 ± 0.1	6.2 ± 0.2	5.3 ± 0.1	5.8 ± 0.1	5.5 ± 0.2

총균수 변화는 음성대조군 김치의 겨우 초기 5.3 log CFU/mL에서 발효 30일에 9.2 log CFU/mL로 최대 균수를 나타내었으며 이 후 서서히 감소하였다. 실시예 1의 김치는 초기 6.8 log CFU/mL에서 시작하여 음성대조군 김치와 유사하게 발효 30일에 9.2 log CFU/mL로 최대 균수를 나타내었으나 이후 음성대조군 김치에 비하여 더 낮은 균수를 보이며 발효 90일에는 7.0 log CFU/mL까지 감소하였다.

유산균수는 음성대조군 김치의 경우 초기 5.2 log CFU/mL에서 발효 30일에 8.9 log CFU/mL로 최대 균수를 나타내었으며 이 후 서서히 감소하여 발효 90일에 7.8 log CFU/mL를 나타내었다. 실시예 1의 김치는 초기 6.5 log CFU/mL에서 시작하여 control 김치와 유사하게 발효 30일에 9.1 log CFU/mL로 최대 균수를 나타내었으나 발효 90일에 6.8 log CFU/mL까지 감소하였다. 음성대조군 김치의 효모수는 초기 1.5 log CFU/mL에서 발효 60일에 4.1 log CFU/mL까지 증가하였으며, 발효 90일에는 3.7 log CFU/mL를 나타내었다.

실시예 1의 김치의 효모수는 초기 4.2 log CFU/mL에서 시작하여 1차 발효 후 6.2 log CFU/mL까지 증가하였다가 이 후 약간 감소하여 발효 90일까지 5.0 log CFU/mL 이상의 수치를 유지하였다. 이는 초기 많은 양의 효모를 스타터로 첨가하였기 때문이며, 이러한 효모의 수적증가는 산도의 증가로 인해 산에 약한 Streptococcus와 Leuconostoc 속의 사멸과 더불어 유산균수의 감소를 가져오는 요인으로 보이며 김치의 지나친 산패현상을 지연시키는 것으로 여겨진다.

실시예 1의 김치의 스타터로 첨가한 락토바실러스 쿠르바투스 ML17과 사카로미세스 세르바찌 MY7의 점유율 확인을 위해 1차적으로 집락의 특이적 형태를 관찰하고 광학현미경(Olympus BX41TF, Olympus Co., Tokyo, Japan)을 통한 형태학적 관찰로 선별한 후 16S rRNA 및 18S rRNA sequencing을 통하여 최종 확인하여 그 결과를 표 11에 나타내었다.

구분	0일	7일	30일	60일	90일
ML17점유율(%)	96.1	92.3	93.9	78.0	75.3
MY7점유율(%)	99.8	98.7	96.3	93.3	99.8

실시예 1의 김치에서 락토바실러스 쿠르바투스 ML17의 점유율은 초기 96.1%에서 발효가 진행될수록 서서히 감소하였으나 발효 90일 후에도 75.3%의 높은 점유율을 나타내었다. 이는 락토바실러스 쿠르바투스 ML17이 김치내 환경에서 생육하면서 항균물질을 대사물로 생성하여 종균이외의 다른 균주들의 생육을 억제시키면서 발효후기까지 상당한 점유율을 나타내는 것이라 생각된다. 사카로미세스 세르바찌 MY7의 경우 전체 발효기간 동안 90% 이상의 점유율을 유지하며 다른 효모의 생육은 거의 발생하지 않았다.

실험예 12: 발효기간에 따른 김치의 연부 확인

발효기간에 따른 김치의 연부 확인을 위한 경도 측정은 Rheometer(Sun rheometer compac-100Ⅱ, Sun Scientific Co., Ltd, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하여 표 6에 나타내었다. 시료는 실험예 2에서 선택한 유산균 ML17과 효모 MY7를 김치 중량 기준으로 g당 각각 10⁷ CFU 및 10⁵ CFU 스타터로서 첨가한 것과, 스타터 균주를 전혀 첨가하지 않은 음성대조군을 버무린 직후부터 10℃에서 7일 동안 1차 발효한 후 -1℃에서 83일 동안 2차 발효하여, 발효가 진행되는 90일 동안 경도를 측정하였다. 다만 시판중인 1년 숙성 묵은지(이맑은 묵은지)은 양성대조군으로 1년 숙성된 시판제품의 경도를 측정하였다.

시료는 배추상단 5 cm 밑 부분 겉잎에서 5∼6장씩을 크기 3 × 3 × 0.5 cm로 준비하고 adaptor(No. 4, 3 mm)를 이용하여 경도를 측정하였다. 측정 조건은 Fixed depth 10 mm, Distance 200%, Table speed 60 mm/min, Road cell max weight 2 kg으로 하였다.

구분	0일	7일	30일	60일	90일
양성대조군	1년 숙성 6756±213^a
음성대조군	9856±148^b	9207±320^c	8904±202^cd	8747±223^d	8512±201^d
실시예1	9917±187^b	9474±133^bc	9307±331^c	8940±239^cd	8707±450^d

김치에서 물성의 변화는 소금으로 인한 탈수작용으로 인해 배추조직에 함유된 효소들이 활성화 되면서 세포벽 다당류와 단백질 등의 거대분자를 분해시켜 초래되며 이와 더불어 발효후기에 나타나는 효모가 분비하는 팩틴분해효소(pectinesterase, polygalacturonase)에 의해 세포벽과 펙틴 물질이 분해되어 김치조직이 연화하는 연부현상이 발생하는 것으로 알려져 있다. 그러나 본 실험에서는 효모를 첨가한 실시예 1의 김치의 경우 음성대조군 김치와 차이가 없었으며, 발효기간이 경과함에 따른 경도의 감소 변화는 음성대조군 김치가 실시예 1의 김치보다 더 빠른 속도로 감소하는 경향을 나타내었다.

이와 같은 결과는 실시예 1의 김치의 경우 실험예 2에서 나타낸 것과 같이 충분히 강한 묵은지 풍미를 나타내지만, 1년 숙성한 양성대조군 김치와 비교했을 때 김치가 충분히 숙성된 후에도 조직이 물러지지 않아 아삭한 조직감을 갖는 묵은지가 될 수 있음을 의미하는 결과이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11306P

20121012

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11307P

20121012

<110> Jeonnam Bioindustry Foundation HWA WON AGRICULTURAL COOPERATIVE ASSOCIATION <120> Preparation Method for Korean Long-Term Ripened Kimchi Using Starter for Fermentation of a comprising Saccharomyces servazzii MY7 and Lactobacillus curvatus ML17 <130> HPC4042 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1371 <212> DNA <213> Lactobacillus curvatus <400> 1 tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gaacgcactc tcgttagatt 60 gaagaagctt gcttctgatt gataacattt gagtgagtgg cggacgggtg agtaacacgt 120 gggtaacctg ccctaaagtg ggggataaca tttggaaaca gatgctaata ccgcataaaa 180 cctagcaccg catggtgcaa ggttgaaaga tggtttcggc tatcacttta ggatggaccc 240 gcggtgcatt agttagttgg tgaggtaaag gctcaccaag accgtgatgc atagccgacc 300 tgagagggta atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 360 agtagggaat cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa 420 ggttttcgga tcgtaaaact ctgttgttgg agaagaacgt atttgatagt aactgatcag 480 gtagtgacgg tatccaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 540 cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttctta 600 agtctgatgt gaaagccttc ggctcaaccg aagaagtgca tcggaaactg ggaaacttga 660 gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga 720 acaccagtgg cgaaggcggc tgtctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg 780 tagcaaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg ctaggtgttg 840 gagggtttcc gcccttcagt gccgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg 900 accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 960 tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctttga ccactctaga 1020 gatagagctt tcccttcggg gacaaagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 1080 tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttattactag ttgccagcat 1140 ttagttgggc actctagtga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggacgacgtc 1200 aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggatg gtacaacgag 1260 tcgcgagacc gcgaggttta gctaatctct taaaaccatt ctcagttcgg attgtaggct 1320 gcaactcgcc tacatgaagc cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg c 1371 <210> 2 <211> 723 <212> DNA <213> Saccharomyces servazzii <400> 2 tgcggaagga tcattataga aatataattt ttcgatgctt tgcgaggaga cactatactg 60 ctggaccagc gcttaattgc gcggtttggt gggtctctgt agctcagtag cactattaca 120 cacagtggag atttttataa ttctttgcat gcttctttgg gctgcttcgg cggcccagga 180 gtgacaaaca caaacaattt tgtaatttta tgaactagtc aaaaccagaa ttccaggaag 240 atttatcttt ttgtaatatt aaaacaaata ttaaaacttt caacaacgga tctcttggtt 300 ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gatacgtaat gtgaattgca gaattccgtg 360 aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc cctctggtat tccagggggc atgcctgttt 420 gagcgtcatt tccttctcaa acagcaatgt ttggttgtga gtgatactct ttcggagtta 480 gcttgaaatt gctggccgat ggctgttgtg gttgagtgtc tcccttcggg gagagcgctt 540 gctgcgttaa gggacgtcct gctggacatc ttcgtattag gttctaccaa cttcgaagac 600 ggttagcggg gagttctgca gtgagtgtag tgcttttact acgttgcacc atggcgaaca 660 gtgttctttt aagtttgacc tcaaatcagg taggattacc cgctgaactt aagcatatca 720 ata 723

Claims

기탁번호 KCCM 11307P로 기탁된 사카로미세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) MY7 및 기탁번호 KCCM 11306P로 기탁된 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) ML17, 또는 상기 균주들을 포함하는 스타터를 소금에 절인 김치용 채소 및 양념과 혼합하여 김치를 제조하는 단계; 및
상기 김치를 발효시키는 단계;를 포함하는 묵은지의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 김치 g 중량당 상기 사카로미세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) MY7는 1×10⁴ 내지 1×10⁶CFU, 상기 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) ML17는 1×10⁶ 내지 1×10⁸CFU 첨가하여 혼합하는 것을 특징으로 하는 묵은지의 제조방법.
제 2 항에 있어서, 상기 사카로미세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) MY7와 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) ML17의 균수의 비는 1:50 내지 1:500인 것을 특징으로 하는 묵은지의 제조방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 김치를 발효시키는 단계는 8 ℃ 내지 15 ℃에서 1차 발효시킨 후, -3℃ 내지 2 ℃에서 2차 발효시키는 것을 특징으로 하는 묵은지의 제조방법.
제 4 항 있어서, 상기 1차 및 2차 발효기간 동안 김치에 존재하는 효모 균총중 상기 사카로미세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) MY7의 점유율이 90% 이상인 것을 특징으로 하는 묵은지의 제조방법.
제 4 항에 있어서, 상기 1차 발효는 pH 4.5 내지 4.2 이하 또는 산도 0.5 내지 0.6 %의 조건을 충족할 때까지 수행하는 것을 특징으로 하는 묵은지의 제조방법.
제 6 항에 있어서, 상기 1차 발효의 기간은 5 내지 10 일인 것을 특징으로 하는 묵은지의 제조방법.
제 4 항에 있어서, 상기 2차 발효는 pH 4 이하 또는 산도 1 % 이상의 조건을 충족할 때까지 수행하는 것을 특징으로 하는 묵은지의 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 2차 발효의 기간은 20 내지 100 일인 것을 특징으로 하는 묵은지의 제조방법.