KR20150032379A - Ｇａｂａ 생산능이 우수한 락토바실러스 브레비스 4-12 균주 및 이를 함유한 김치의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 GABA 생산능이 우수한 신규한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주 및 이를 함유한 김치의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 김치로부터 분리·동정된 GABA 생산능이 우수한 락토바실러스 브레비스 4-12(KFCC11547P) 균주 및 상기 균주를 함유하여 락토바실러스 균주가 가지는 GABA 생산능을 최적으로 이용한 김치의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주(KFCC11547P)를 이용하여 다량의 GABA가 함유된 기능성이 향상된 김치 및 건강기능식품을 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 GABA 생산능이 우수한 신규한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주 및 이를 함유한 김치의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 김치로부터 분리·동정된 GABA 생산능이 우수한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12(KFCC11547P) 균주 및 상기 균주를 함유하여 락토바실러스 균주가 가지는 GABA 생산능을 최적으로 이용한 김치의 제조방법에 관한 것이다.
김치는 우리나라의 대표적 발효식품 중 하나로서 여러 발효생성물과 재료성분인 식이성분, 비타민, 카로틴, 젖산, 젖산균, 아세틸콜린, 덱스트란(dextran), 아세테이트(acetate) 등이 풍부하여 인체 내에서 면역증강, 항산화, 항균, 항콜레스테롤, 발암 및 변이 물질의 생성을 방지하는 기능을 갖는 기능성 식품으로 알려져 있다. 특히 김치의 주재료인 채소에 풍부한 식이섬유는 변비를 예방하며, 김치가 발효와 함께 증가되는 풍부한 젖산균은 장내의 유해 미생물의 생육을 억제하여 유익균이 우위를 차지하도록 장내 균총을 개선하는 프로바이오틱(probiotic) 효과를 갖는다. 실제로 김치를 하루에 300g/day 쯤 먹으면 안 먹은 사람에 비하여 대장에 젖산균이 100배가량 증가하므로 김치는 장을 튼튼히 하고, 정장 작용, 면역력 증가 등 여러가지 생리적 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
김치에는 락토바실러스(Lactobacillus) 속(genera), 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 바이셀라(Weissella) 속 등의 주요 균주가 있고 이들 균주가 김치발효에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 김치 속의 풍부한 이들 젖산균들은 락테이트(lactate), 감마아미노부티르산(γ-amino butyric acid, 이하 GABA), 박테리오신(bacteriocin) 등 다양한 물질들을 생산하여 식품의 보존, 산미와 향미의 부여, 식중독균의 억제 효과 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) 등의 균주는 한국 김치의 맛을 결정하는 우점종으로 알려져 있다. 또한 김치 젖산균 생성물질들은 체내 지질개선, 면역증강, 항 AI(avian influenza) 효능 등의 효과가 있어 의약품이나 화장품의 중간물질로도 이용되고 있다.
특히 젖산균 중 우리나라 김치 발효 후기에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 락토바실러스 브레비스는 내산성과 내담즙성이 강한 것이 특징이며 생육 적정 온도는 30℃이며, 아라비노스, 자일로스, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 말토스 등을 이상발효(heterofermentation)를 하여 젖산을 만들며, 이 중에서도 아라비노스를 잘 이용한다. 젖산 외에도 아세트산, 에탄올, 탄산가스 등을 생성하며 주로 변패한 맥주, 유제품, 양배추 초절임, 김치, 사람이나 동물의 장관 등으로부터 분리된다.
감마아미노부티르산(GABA)은 억제성 신경전달물질로서 뇌 혈류개선, 산소공급 증가, 뇌세포 대사기능을 촉진시켜 신경안정작용, 스트레스 해소, 기억력 증진, 혈압강하작용, 우울증 완화, 중풍과 치매 예방, 불면, 비만, 갱년기장애, 결장암, 대장암 세포의 전이 및 증식 억제 효과 등 매우 다양한 생리기능을 갖는 것으로 알려져 이러한 효능을 목적으로 한 제품 개발이 시도되고 있다. 최근에는 의약품으로 등록되어 뇌졸중 또는 뇌동맥 후유증에 의한 두통, 이명 및 의욕저하 등의 치료에 사용되고 있다.
GABA는 각종 야채, 과일, 쌀, 콩 등에 널리 분포되어 있으며, 이들 식품을 통해 보충할 경우 필요량은 하루 500-3000mg이며, 하루에 GABA 80mg으로 혈압강하가 가능하다고 알려져 있으나(강태진과 오석흥, BioWave, 9권 14호, 2007년), 식품에는 그 함량이 낮아 생리작용을 적절히 나타내지 못한다. 최근 일본에서는 GABA 함량을 높인 녹차, 쌀배아, 발아현미 등이 판매되면서 식품업계와 소비자의 관심이 고조되고 있다.
한편, 미생물에서의 GABA의 생성은 미생물이 글루탐산을 흡수하여 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD)에 의해 글루탐산이 비가역적으로 탈탄산화되어 생성된 후 세포 밖으로 배출되는 것으로 알려져 있다. 젖산균이 많이 함유되어 있는 김치의 경우 100g 당 약 8mg의 GABA가 함유된 것으로 알려져 있으며 가공 방법에 따라 100g 당 60mg까지 함유하도록 할 수 있으나(조승용외 4인, Food Science and Biotechnology 20권 2호, pp 403-408, 2011년 4월), 김치를 통해 하루 500-3000mg의 필요량을 충족하기에는 여전히 그 생성량이 부족하다고 할 수 있다.
따라서, 우리나라의 대표적 음식인 김치로부터 유래한 식물성 유산균 중에서 생리활성기능이 매우 우수한 소재인 GABA를 고농도로 생성할 수 있는 미생물을 분리 동정하여 이를 김치 등 발효식품의 제조에 첨가물로서 이용한다면 부족한 GABA를 손쉽게 보충할 수 있으며, 그 응용 여부에 따라 무한한 시장성을 확보할 수 있을 것이다. 최근, 기능성 물질의 생성능을 가진 젖산균을 탐색하고 분리하는 연구들이 진행되고 있으나 아직까지 GABA 생성능이 있는 젖산균을 동정·분리하여 김치 제조에 적용시 인체의 생리활성에 충분한 양의 GABA를 생산할 수 있는지 여부 또는 스타터로서 적절히 작용하는지에 관한 연구는 부족한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 가바 생성능을 보유한 식물성 유산균을 김치 스타터로서 이용하기 위해 예의 노력한 결과, 김치 유래의 가바 생성능이 우수한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 KFCC11547P를 분리 동정하는데 성공하였으며, 이를 김치 제조에 적용시 고농도의 GABA를 생산하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 감마아미노부티르산을 생산하는 능력이 있는 신균주인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주(수탁번호: KFCC11547P)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 감마아미노부티르산을 생산하는 능력이 있는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주(KFCC11547P)를 첨가하는 단계를 포함하는 김치의 제조방법 및 이에 따라 제조된 김치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 감마아미노부티르산을 생산하는 능력이 있는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주(KFCC11547P) 또는 이의 배양액을 포함하는 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 감마아미노부티르산을 생산하는 능력이 있는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주(수탁번호: KFCC11547P)를 제공하는 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 감마아미노부티르산을 생산하는 능력이 있는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주(KFCC11547P)를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주(KFCC11547P)는 김치 제조시 김치 부재료에 접종하여 첨가할 수 있으며, 상기 균주의 배양액을 첨가할 수도 있다. 접종균을 종균 배양하는 배지로는 MRS 브로스 배지가 적당하며 30-37℃에서 24-48시간 배양하면 원하는 균의 활성을 얻을 수 있다.
상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주(KFCC11547P)를 김치의 제조시 스타터(starter)로서 첨가할 수 있다. 상기 용어 "스타터"란 발효공학에서 사용하는 용어로서, 각종 발효제품 제조시 원재료의 젖산발효를 일으키기 위하여 사용되는 젖산균의 종균 및 이의 배양물을 말하는 것으로서, 본 발명에서도 김치의 제조시 젖산 발효를 일으키기 위해 첨가되는 종균 또는 이의 배양물을 가리킨다. 또한, 본 발명에서 사용하는 용어 "스타터 김치"란 상기 발효를 위해 첨가되는 종균 또는 이의 배양물을 첨가한 김치를 의미한다.
본 발명의 김치 제조방법은 대량으로 생산되는 김치를 제조하는 방법으로서 유용하다. 일 예로서 본 발명의 제조방법은 100~120kg의 대량으로 제조시 사용할 수 있으나 반드시 이에 제한되지 않는다. GABA를 생산하는 김치를 대량으로 생산하기 위해서는 미생물의 대량 배양이 필요하다. 나아가 MRS 배지가 젖산균의 배양에 연구용으로 흔히 사용되고 있으나 값이 비싼 단점이 있으므로 김치의 대량 생산을 위해서는 이를 대체할만한 보다 경제적인 배지가 필요하다.
이에 본 발명자는 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 대상으로 MRS 배지, 기본 배지에 MSG 또는 설탕을 포함한 배지에 대해 연구한 결과, 시판 식품첨가물을 이용하여 배지를 제조하는 방법을 개발하였다. 구체적으로, 기본배지에 트립톤, 설탕, yeast extract, 제1인산칼륨, 제2인산칼륨, MgSO47H2O, 수산화암모늄, 구연산을 400:300:300:10:40:4:15:5의 비율로 혼합한 식품첨가물 5.38%(w/v)을 첨가하여 만든 배지에서 배양된 균주의 생육 정도가 MRS 배지에 뒤지지 않는 것으로 나타나 경제적인 최적 배지로 사용될 수 있음을 확인하였다.
상기 대량으로 제조되는 김치는 15℃에서 3-5일 동안 발효시켜서 제조할 수 있으나, 원하는 적숙기 상태의 김치에 따라 온도 및 시간을 조절할 수 있으며 반드시 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 판매용으로 대량으로 제조되는 김치의 경우에는 15℃에서 5일까지 발효한 후에 1℃의 김치냉장고에 보관하면서 30일 이내에 유통한다면 가바의 함량이 적어도 0.05 내지 0.09 범위로 함유된 김치를 제조판매할 수 있을 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 김치의 제조시, MSG(monosodium glutamate)를 배추 100g 당 1 %의 비율로 김치 부재료에 첨가할 수 있다. 유산균인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)는 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase)를 이용하여 김치의 원료가 되는 배추나 부원료인 다양한 양념 채소에 함유되어 있는 글루탐산(glutamate) 및/또는 김치 부재료에 첨가해주는 상기 MSG를 가바로 전환시킬 수 있는 능력을 가지고 있다. 따라서, 상기 MSG를 많이 첨가할수록 가바 생성량은 증가할 것이나, MSG가 너무 많이 추가되면 가바로 전환되지 않고 잔류하게 되어 상품성이 오히려 떨어질 수 있으므로 적절한 양으로 추가될 필요가 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 기술한 김치의 제조방법에 따라 제조한 김치를 제공한다. 상기에서 김치는 일 예로서 배추, 무, 갓 또는 열무를 주재료로 하는 김치인 배추김치, 무김치(일명 깍두기), 갓김치 또는 열무김치를 나타내지만 반드시 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 감마아미노부티르산을 생산하는 능력이 있는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주(KFCC11547P) 또는 이의 배양액을 포함하는 건강기능식품 또는 음료를 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 또는 음료는 본 발명의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주(KFCC11547P) 또는 이의 배양액을 포함함으로써 상기 균주가 발효하여 생성되는 시트르산 및 유산 등을 함유하여 제품의 풍미 및 산미를 향상시키고 신경안정, 혈압강하, 스트레스 해소, 치매 예방 등 여러가지 이로운 생리활성을 나타내는 GABA가 다량 포함되므로 기능성을 갖출 수 있다.
본 발명은 감마아미노부티르산을 생산하는 능력이 우수한 신균주인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주(KFCC11547P)를 제공하며, 상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12 균주(KFCC11547P)를 이용하여 다량의 GABA가 함유된 기능성이 향상된 김치 및 건강기능식품을 제조할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 분리한 젖산균을 동정하기 위한 블라스트 서치 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 분리한 젖산균을 동정하기 위한 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
도 3은 분리한 젖산균의 전자현미경 사진이다.
도 4는 MRS 배지 배양시 배양온도에 따른 젖산균의 생균수 변화를 측정한 결과이다.
도 5는 MRS배지 중 10℃와 15℃에서 각 시간별로 GABA 생성량을 TLC를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 15℃ 배양액에서의 배양시간에 따른 GABA 생산 함량을 (in MRS broth) HPLC로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 제조방법에 따라 제조한 김치를 15℃에 저장하면서 발효기간 동안 GABA 함량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 발효기간에 따른 MSG첨가 스타터 김치의 GABA 함량 변화를 HPLC로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 김치에 스타터로 첨가한 후 김치 부재료 중 MSG의 첨가여부에 따른 GABA 생성량의 변화를 비교한 결과이다.
도 10은 스타터 김치 제조를 위한 균 배양시 MRS 배지에 MSG 첨가 유무에 따른 김치에서의 GABA 생성량 변화를 비교한 결과이다.
도 11은 종래 MRS 배지와 본 발명의 최적 배지에서의 스타터 미생물인 락토바실러스 브레비스 4-12 균주의 생육정도(흡광도)를 나타낸 것이다.
도 12는 최적 배지에서의 스타터 미생물인 락토바실러스 브레비스 4-12 균주의 생육 정도(흡광도)를 나타낸 것이다.
도 13은 최적 배지에서의 스타터 미생물인 락토바실러스 브레비스 4-12 균주의 생육 정도(생균수)를 나타낸 것이다.
도 14는 37℃에서 락토바실러스 브레비스 4-12 균주의 생육 정도(생균수)를 나타낸 것이다.
도 15는 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 스타터로서 첨가하여 제조한 대량 생산 김치의 젖산균 수를 조사한 결과이다.
도 16은 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 스타터로서 첨가하여 제조한 대량 생산 김치의 pH를 조사한 결과이다.
도 17은 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 스타터로서 첨가하여 제조한 대량 생산 김치의 산도를 조사한 결과이다.
도 18은 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 스타터로서 첨가하여 제조한 대량 생산 김치의 염도를 조사한 결과이다.
도 19는 스타터를 첨가한 대량 생산 김치의 GABA 생성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 스터터를 첨가한 대량 생산 김치의 GABA 함량을 측정한 결과를 나타
낸 것이다.
도 21은 스타터를 첨가한 대량 생산 김치에 대한 관능검사 결과이다.
도 2는 분리한 젖산균을 동정하기 위한 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
도 3은 분리한 젖산균의 전자현미경 사진이다.
도 4는 MRS 배지 배양시 배양온도에 따른 젖산균의 생균수 변화를 측정한 결과이다.
도 5는 MRS배지 중 10℃와 15℃에서 각 시간별로 GABA 생성량을 TLC를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 15℃ 배양액에서의 배양시간에 따른 GABA 생산 함량을 (in MRS broth) HPLC로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 제조방법에 따라 제조한 김치를 15℃에 저장하면서 발효기간 동안 GABA 함량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 발효기간에 따른 MSG첨가 스타터 김치의 GABA 함량 변화를 HPLC로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 김치에 스타터로 첨가한 후 김치 부재료 중 MSG의 첨가여부에 따른 GABA 생성량의 변화를 비교한 결과이다.
도 10은 스타터 김치 제조를 위한 균 배양시 MRS 배지에 MSG 첨가 유무에 따른 김치에서의 GABA 생성량 변화를 비교한 결과이다.
도 11은 종래 MRS 배지와 본 발명의 최적 배지에서의 스타터 미생물인 락토바실러스 브레비스 4-12 균주의 생육정도(흡광도)를 나타낸 것이다.
도 12는 최적 배지에서의 스타터 미생물인 락토바실러스 브레비스 4-12 균주의 생육 정도(흡광도)를 나타낸 것이다.
도 13은 최적 배지에서의 스타터 미생물인 락토바실러스 브레비스 4-12 균주의 생육 정도(생균수)를 나타낸 것이다.
도 14는 37℃에서 락토바실러스 브레비스 4-12 균주의 생육 정도(생균수)를 나타낸 것이다.
도 15는 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 스타터로서 첨가하여 제조한 대량 생산 김치의 젖산균 수를 조사한 결과이다.
도 16은 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 스타터로서 첨가하여 제조한 대량 생산 김치의 pH를 조사한 결과이다.
도 17은 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 스타터로서 첨가하여 제조한 대량 생산 김치의 산도를 조사한 결과이다.
도 18은 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 스타터로서 첨가하여 제조한 대량 생산 김치의 염도를 조사한 결과이다.
도 19는 스타터를 첨가한 대량 생산 김치의 GABA 생성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 스터터를 첨가한 대량 생산 김치의 GABA 함량을 측정한 결과를 나타
낸 것이다.
도 21은 스타터를 첨가한 대량 생산 김치에 대한 관능검사 결과이다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 김치로부터 균주의 분리 및 16S
rDNA
염기서열분석에 의한 균주의 동정
(1) 김치로부터
GABA
생성능이
있는 젖산균 균주의 분리
재료는 광주 지역의 맛집과 김치 생산업체들에서 적숙기 상태의 김치를 수거하여 선택배지에서 유산균을 선발하였으며, 그 밖의 시약들은 일급 시약을 사용하였다.
김치액 1㎖을 채취하여 0.85% 멸균 식염수에 단계적으로 희석한 후 1㎖씩 spreading culture 방법으로 배지에 접종하여 30℃에서 72 시간 평판 배양한 후 균수를 측정하였다. 실험에 사용된 배지는 젖산균수의 경우 MRS (Lactobacilli MRS agar, Difco) 배지에 BCP(Bromocresol purple)지시약을 25ppm으로 넣어 사용하였다. 젖산균수의 측정은 Lactobacillus선별용으로 Pediococcus의 생육을 억제하기 위하여 acetic acid와 sodium acetate를 첨가한 modified-Lactobacillus selection (m-LBS) 배지로 30℃에서 3일간 평판 배양하여 모양과 색, 성장 속도를 고려하여 시료별로 10-15개의 colony를 선별 수집하였다. 이 중 glutamate decarboxlylase가 mono-sodium glutamate(MSG)를 이용하여 gamma-aminobutyric acid(GABA)를 만드는 전환능력을 보이는 균주를 선발하였다.
(2) 16S
rDNA
염기서열분석에 의한 균주의 동정
배양된 미생물을 순수분리한 후 MRS plate상태로 냉장택배를 이용하여 Solgent회사(대전)에 의뢰하여 primer로서 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')(서열번호 1)와 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')(서열번호 2)의 universal primer set 및 중간부분 primer를 합성사용하여 전기영동하고 chromas pro 프로그램을 이용하여 16S rDNA 서열을 완전 해독하였다. 그 결과는 서열번호 3과 같으며, 이 서열정보를 이용하여 종전 결과보고서의 동정자료와 함께 Genbank의 BLAST 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nhi.gov)(도 1)으로 다중비교하고 계통수(도 2)를 이용하여 최종적으로 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 종류로 확인되었다. 따라서, 이를 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus
brevis) 4-12로 명명하고, 2013년 2월 5일자로 한국미생물보존센터에 기탁번호 KFCC11547P로 기탁하였다.
실시예
2: 전자현미경(
SEM
) 사진의 촬영
JEOL JSM-7500F+EDS(Oxford) 모델의 전자현미경을 사용하였다. 젖산균을 MRS배지에 배양한 후 균체를 수확하여 기기의 사용방법에 따라 백금(Pt)코팅을 하여 미생물 균체의 표면을 주사전자현미경으로 관찰하였다. 분리한 젖산균의 전자현미경 사진은 도 3와 같으며 길이는 약 1.6-2.0㎛ 정도로 전형적인 Lactobacillus
sp. 모양을 나타냈다.
실시예
3: 저온
생육여부
확인
락토바실러스 브레비스의 김치 스타터(starter)로서의 적용가능한지 여부를 판단하기 위해 저온에서의 생육여부를 확인하였다. L.
brevis를 각각 5℃, 10℃, 15℃의 온도에서 MRS broth에 배양하면서 생균수를 측정한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보듯이, 저온생육 온도 조건 중 15℃에서 균이 가장 잘 자라는 것을 알 수 있었다.
실시예
4:
GABA
생산 확인
(1) 배지에서
GABA
의 생산 확인
젖산균 속 glutamate decarboxlylase가 mono-sodium glutamate(MSG)를 이용하여 gamma-aminobutyric acid(GABA)를 만드는 전환 능력을 보기 위해 TLC를 수행하였다. 락토바실러스 브레비스를 1% MSG가 첨가된 MRS 배지에 배양하여 12,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액 2ul를 취해 TLC plate에 spoting 한 후 2~3시간 전개시켰다. TLC 전개용매로는 n-butanol:acetic acid:water=5:3:2 혼합용액을 사용하였다. 표준물질로는 시판중인 Sigma-Aldrich사의 gamma-aminobutyric acid(GABA)를 사용하였다.
MRS배지 중 10℃와 15℃에서 각 시간별 GABA 생성량을 TLC를 이용하여 확인한 결과는 도 5와 같다. TLC 결과를 보면 10℃에서는 거의 GABA를 생성하지 못하는 것을 알 수 있었고, 배양 6일째에 GABA spot이 생기는 것을 확인할 수 있었다. 15℃에서는 배양 2일째 GABA spot을 확인할 수 있었고, 배양 3일째에 대부분의 MSG가 GABA로 전환된 것을 알 수 있었다.
15℃ 배양액의 각 시간에 따른 GABA 함량은 HPLC(LC-20AD, Shimadzu)로 분석하였고 그 결과는 도 6와 같다. 도 6에서 보듯이, MRS 배지에서 다량의 GABA를 생산(100g 당 약 2000mg, 즉 2g)함을 확인할 수 있었다.
(2) 김치에서
GABA
의 생산 확인
Lactobacillus brevis 4-12는 MRS 배지에서는 다량의 GABA를 생산(100g 당 약 2000mg, 즉 2g)하였으나, 김치 중에서는 그 생산량이 배지에서보다는 적었다(100g 당 약 130mg). 이것은 각종 살아 있는 미생물이 섞여 있는 김치의 특수한 조건 때문일 수도 있고 김치 발효온도가 15℃ 이하로 비교적 낮기 때문인 것으로 생각된다. 그런데 김치에는 보통 100g 당 8mg이 들어 있는 것으로 알려진 것과 비교하면 상당히 많은 양의 GABA가 생성된 것을 알 수 있다.
실시예
5: 스타터를 첨가한 김치의 제조 및
GABA
함량 분석
(1) 스타터를 첨가한 김치의 제조
L. brevis를 MRS broth에 배양하여 37℃에서 24-48 h 배양한 후 12,000 rpm에서 5 min 원심분리하여 균을 회수한다. 상등액은 버리고 가라앉은 균을 0.85 % NaCl로 2번 washing하여 김치 부재료에 접종하였다. 상기 접종은 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 김치 1g당 10의 7승이 되도록 부재료 양념에 첨가하여 수행하였다. 배추 1kg에 대해 10%의 소금을 이용하여 18시간 절였다. 준비된 부재료와 절임배추를 잘 혼합하여 김치를 제조하였다. 김치 부재료의 배합비는 하기 표 1과 같으며 MSG 첨가군에는 배추 100g 당 1 % 비율로 부재료에 첨가하였다.
[표 1] 김치 배합비
(2) 김치 중
GABA
함량의 분석
상기와 같은 방법으로 제조한 김치를 15℃에 저장하면서 발효기간 동안 GABA 함량을 측정하였고, 발효 5일째 냉장에 보관하면서 GABA 함량 변화를 측정하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.
TLC 결과를 보면 발효 4일째부터 0.1%정도의 GABA spot이 생성되는 것을 알 수 있고, 발효기간에 따른 MSG첨가 스타터 김치의 GABA 함량 변화를 HPLC로 확인한 결과는 도 8과 같다. 김치를 15℃에서 발효시키면서 GABA 생성량의 변화를 관찰한 결과, 발효기간이 경과함에 따라 지속적으로 GABA 함량이 증가하는 것을 알 수 있었다. 적숙기인 발효 5일째에는 GABA 함량이 0.1% 정도인 것으로 확인되었고, 냉장 보관 후에도 GABA 함량이 증가하여 0.13%(김치 100g당 130mg GABA)에 이르렀다.
(3)
MSG
첨가 유무에 따른 김치 중
GABA
생성량의 비교
또한, MSG 첨가 유무에 따른 김치 중 GABA 생성량을 조사하였다. L.
brevis를 김치에 스타터로 첨가 후 김치 부재료 중 MSG의 첨가 여부에 따라 GABA 생성량의 변화를 비교한 결과는 도 9와 같다.
도 9에서 보듯이, L.
brevis를 스타터로 사용하여 접종한 후 MSG를 첨가하였을 때 MSG를 첨가하지 않은 김치보다 GABA 생성량이 더 높은 것을 알 수 있었다. 또한 스타터를 첨가하지 않고 MSG도 첨가하지 않은 Control 김치의 경우에는 발효기간 동안 가장 낮은 GABA 함량을 보였다.
(4) 균주의 배양 조건에 따른 김치 중
GABA
생성량의 비교
배양 조건에 따른 GABA 생성량의 영향을 알아보기 위해, 스타터 김치 제조를 위한 균주의 배양시 MRS broth에 MSG를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우를 나누어 김치에서의 GABA 생성량 변화를 조사하였으며, 그 결과는 도 10과 같다. 도 10에서 보듯이, 균주 배양시 MRS broth에 MSG를 넣은 경우에 넣지 않은 경우보다 김치에서 GABA 생성량이 더 많은 것을 알 수 있었다.
실시예
6:
락토바실러스
브레비스
4-12 균주(
KFCC11547P
)를 스타터로 첨가하여
GABA
를 함유한 김치를 대량으로 생산하는 방법 연구
(1) 대량 생산 김치용 최적 배지
GABA를 생산하는 김치를 대량으로 생산하기 위해서는 미생물의 대량 배양이 필요하다. MRS 배지가 젖산균의 배양에 연구용으로 흔히 사용되고 있으나 값이 비싼 단점이 있으므로 김치의 대량 생산을 위해서는 이를 대체할만한 보다 경제적인 배지가 필요하다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 대상으로 MRS 배지, 기본 배지에 MSG 또는 설탕을 포함한 배지에 대해 연구한 결과, 시판 식품첨가물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 배지를 제조시 배양된 균주의 생육 정도가 MRS 배지에 뒤지지 않는 것으로 나타나 경제적인 최적 배지로 사용될 수 있음을 확인하였다:
최적 배지의 조성: 기본배지에 식품첨가물 5.38%(w/v)을 첨가하였으며, 상기 식품첨가물은 트립톤, 설탕, yeast extract, 제1인산칼륨, 제2인산칼륨, MgSO47H2O, 수산화암모늄, 구연산을 400:300:300:10:40:4:15:5의 비율로 혼합한 것임.
균주의 생육 정도는 최적 배지의 배양액의 660nm에서의 흡광도와 희석법에 의한 생균수를 측정하여 조사하였으며 이에 대한 결과를 도 11 내지 도 14에 나타내었다. 원래 배지의 착색정도 때문에 흡광도에 있어서 차이가 나지만 생육 28시간 때 생균수가 두 종류 모두 1ml당 10억 정도로 유사하였다. 한편, MRS 배지와 본 발명의 최적 배지의 원가를 1000ml 기준으로 계산시 본 발명의 최적 배지가 89.2% 정도 저렴한 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 최적 배지를 대량 김치생산을 위한 스타터 균주의 배지로 적합하게 사용될 수 있음을 확인하였으며 비용효율적인 면에서도 MRS 배지보다 더 경제적인 것으로 판단되었다.
한편, 도 12 및 도 13에서 보듯이, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 4-12 균주는 30℃가 생육온도로서 적당하나, 김치의 발효온도로 자주 사용하는 15℃에서 생육시키는 경우를 고려할 때 적어도 4일간 이 온도를 유지하는 것이 미생물의 생육 즉 발효에 필수적인 것으로 판단되었다.
(2) 스타터를 사용한 대량 생산 김치의 제조
본 발명의 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 대량 생산 김치의 제조에도 적용가능한지 알아보기 위해, 120kg 규모로 김치를 제조하였다. 김치는 시판 김치회사인 (주)운림가의 생산 시설을 이용하여 제조하였으며 재료 또한 시판 제품을 구입하여 사용하였다. 부재료의 조성은 하기 표 2와 같으며, 절임배추와 부재료 양념의 비율은 7:3으로 하여 김치 120Kg을 제조하였다, 전체 배추김치의 1%(w/w) 비율로 MSG를 첨가하고, 스타터로서 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 상기 최적 배지에서 배양하여 37℃에서 24-48h 배양한 후 12,000 rpm에서 5 min 원심분리하여 균을 회수하고, 상등액은 버리고 가라앉은 균을 0.85 % NaCl로 2번 washing하여 김치 부재료에 접종하였다. 상기 접종은 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 김치 1g당 10의 7승이 되도록 부재료 양념에 첨가하여 수행하였다.
제조된 김치는 15℃에서 5일간 발효시킨 다음 냉장실도 이동하여 보관하였다. 제조된 김치를 발효시키면서 매일 시료를 채취하여 미생물의 생육, pH, 적정산도, 염도를 지속적 또는 간헐적으로 측정하였으며 GABA의 생성량도 측정하였다. 이 김치를 5일간 발효시킨 후에는 냉장실(1℃)에 옮겨 보관하였다. 균주 생육은 생균수 측정법을 이용하여 조사하였다.
[표 2] 대량 생산 김치 제조를 위한 부재료의 조성
실시예
7: 대량 생산 김치의 이화학적 분석 및
GABA
함량 분석
상기 실시예 6에서 제조한 대량 생산 김치에 대한 발효기간 동안의 미생물학적 및 이화학적 변화를 다음과 같이 조사하였습니다.
(1)
젖산균수
GABA 생산 스타터로서 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 첨가한 김치의 경우, 발효 시작점에서 1g 당 100만 정도로 스타터 무첨가 김치의 균주 수보다 약 10여배를 나타내었다. 발효가 진행됨에 따라 젖산균은 증가하였고 그 수는 스타터 첨가 여부와 상관없이 발효 1일 이후에 급격하게 증가하였다. 전반적으로 발효 2일의 경우를 제외하고 스타터 첨가 김치 중의 젖산균의 수가 많은 것을 알 수 있었다.
(2)
pH
발효 진행의 정도를 나타내는 pH는 초기 6.0 정도에서 발효 5일에는 적숙기로 판단하는 pH 4.2 정도까지 지속적으로 감소하였다. 미생물의 증가가 최대치에 이른 발효 2일에서 3일까지는 급격하게 감소한 것을 알 수 있다. pH는 스타터를 첨가한 김치의 경우 더 낮게 나타났으며 이는 스타터로 첨가해준 미생물의 영향이라고 생각되었다.
(3) 산도
대량 생산 김치의 산도도 pH의 변화와 일치하여 스타터를 첨가한 김치가 지속적으로 더 높은 값을 나타내었으며 발효 5일째는 가장 높은 젖산 함량을 나타냈다. 이러한 결과는 GABA 생성 균주인 락토바실러스 브레비스 4-12 가 발효를 촉진하는 역할을 한 것으로 생각되었다.
(4) 염도
대량 생산 김치의 염도는 1.1-1.4%이었으며 스타터를 첨가한 김치의 염도가 조금 높은 것으로 측정되었으나 전반적으로 저염 김치에 해당하였다.
(5)
GABA
함량의 비교 분석
락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 스타터로 첨가한 대량 생산 김치와 대조구(control)의 발효 기간에 따른 GABA 생성 여부를 TLC를 이용해 확인하였고, 김치중의 GABA의 함량은 발효가 진행됨에 따라 도 19처럼 변하는 것을 알 수 있었다. 스타터를 첨가한 대량 생산 김치의 GABA 함량을 측정한 결과는 도 20에 나타내었다. 구체적으로는 발효 3일에 0.07%로서 대조구 김치의 0.04%보다 높은 것으로 나타났다.
(6) 스타터 대량김치의 관능평가
상기와 같이 GABA 생성능이 우수한 것으로 확인된 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 스타터로 첨가한 대량 생산 김치에 대해 관능적 특성을 평가하였다. 관능평가는 9점 평가법을 이용하여 짠맛, 신맛, 시원한 맛(깔끔한 신맛, 청량감), 구수한 맛, 아삭한 정도 및 전체적인 기호도를 평가하고 통계처리하였다.
그 결과, 도 21과 같이 전체적 기호도, 아삭한 정도에 대해서는 스타터를 첨가하지 않은 대조구 김치와 유의적 차이는 없었으나 구수한 맛은 스타터를 첨가한 대량 생산 김치가 가장 높았다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 4-12 균주를 스타터로 첨가한 대량 생산 김치는 신맛과 짠맛이 덜하고 아삭한 정도가 높으며 전체적 기호도가 우수한 것으로 평가되었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
<110> Kwang-Ju Prestige Kimchi agency Assosiation.,Inc
<120> Lactobacillus brevis 4-12 having GABA production capacity and
methods for preparing Kimchi comprising the same
<130> DP3311
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer (27F)
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer (1492R)
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1448
<212> DNA
<213> Lactobacillus brevis 4-12
<400> 3
ttagacggct gactcccgaa ggttatctca ccggctttgg gtgttacaaa ctctcatggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120
tactagcgat tccaacttca tgtaggcgag ttgcagccta caatccgaac tgagaacggc 180
tttaagagat tagcttagcc tcacgacttc gcgactcgtt gtaccgtcca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300
tgtcaccggc agtctcacca gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactgata ataagggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420
cctgtcattc tgtccccgaa agggaacgtc ttatctctaa gattggcaga agatgtcaag 480
acctggtaag gttcttcgcg tagcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540
cccccgtcaa ttcctttgag tttcaacctt gcggtcgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600
tgcgttagct gcagcactga agggcggaaa ccctccaaca cttagcactc atcgtttacg 660
gcatggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctacccat gctttcgagc ctcagcgtca 720
gttacagact agacagccgc cttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcattccac 780
cgctacacat ggagttccac tgtcctcttc tgcactcaag tctcccagtt tccgatgcac 840
ttctccggtt aagccgaagg ctttcacatc agacttaaaa aaccgcctgc gctcgcttta 900
cgcccaataa atccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960
ttagccgtgg ctttctggtt aaataccgtc aacccttgaa cagttactct caaaggtgtt 1020
cttctttaac aacagagttt tacgagccga aacccttctt cactcacgcg gcattgctcc 1080
atcagacttt cgtccattgt ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtttgggcc 1140
gtgtctcagt cccaatgtgg ccgattaccc tctcaggtcg gctacgtatc atcgtcttgg 1200
tgggccttta cctcaccaac taactaatac gccgcgggat catccagaag tgatagccga 1260
agccaccttt caaacaaaat ccatgcggat tttgttgtta tacggtatta gcacctgttt 1320
ccaagtgtta tcccctgctt ctgggcagat ttcccacgtg ttactcacca gttcgccact 1380
cgcttcattg ttgaaatcag tgcaagcacg tcattcaacg gaagctcgtt cgactgcatg 1440
tatagcag 1448
Claims (10)
- 감마아미노부티르산을 생산하는 능력이 있는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 4-12 균주(수탁번호: KFCC11547P).
- 감마아미노부티르산을 생산하는 능력이 있는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 4-12 균주(KFCC11547P)를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 4-12 균주(KFCC11547P)를 MRS 배지에서 30-37℃에서 24-48시간 동안 배양하여 얻은 배양액을 김치 부재료에 접종하여 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 4-12 균주(KFCC11547P)를 스타터(starter)로서 첨가하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
- 제4항에 있어서, 상기 김치는 100~120kg의 대량으로 제조되는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
- 제4항에 있어서, MSG(monosodium glutamate)를 배추 100g 당 1 %의 비율로 김치 부재료에 첨가하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 대량으로 제조되는 김치는 15℃에서 3-5일 동안 발효시켜서 제조한 것인 김치의 제조방법.
- 제5항에 있어서, 대량 제조시 상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 4-12 균주(KFCC11547P)는, 기본배지에 트립톤, 설탕, 이스트 추출액, 제1인산칼륨, 제2인산칼륨, MgSO47H2O, 수산화암모늄, 구연산을 400:300:300:10:40:4:15:5의 비율로 혼합한 식품첨가물 5.38%(w/v)를 첨가한 배지에서 배양한 것인 김치의 제조방법.
- 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조한 김치.
- 감마아미노부티르산을 생산하는 능력이 있는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 4-12 균주(KFCC11547P) 또는 이의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
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| KR1020130111249A KR20150032379A (ko) | 2013-09-16 | 2013-09-16 | Ｇａｂａ 생산능이 우수한 락토바실러스 브레비스 4-12 균주 및 이를 함유한 김치의 제조방법 |
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|---|---|---|---|---|
| CN114601010A (zh) * | 2022-04-07 | 2022-06-10 | 广西壮族自治区农业科学院 | 百香果果脯及其制备方法 |
| CN114806976A (zh) * | 2022-06-20 | 2022-07-29 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种短乳杆菌及其抑菌物质制备方法 |
| KR102483081B1 (ko) * | 2022-07-25 | 2023-01-02 | 김미진 | 균주 및 균주 제조 방법 |
| KR102560141B1 (ko) * | 2022-12-26 | 2023-07-25 | 김미진 | 가바(gaba) 함유 발효물의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 가바 함유 발효물 |
-
2013
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