KR20190063795A

KR20190063795A - 락토바실러스 플란타룸 mifi-sy3 균주를 이용한 아로니아 발효액의 제조방법

Info

Publication number: KR20190063795A
Application number: KR1020170162836A
Authority: KR
Inventors: 오근수; 문광현; 이정호; 정도연; 정성엽; 김대근; 김욱; 정경옥; 임소연
Original assignee: 재단법인 순창군건강장수연구소
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2017-11-30
Publication date: 2019-06-10
Also published as: KR102032703B1

Abstract

본 발명은 (a) 건조한 후 분쇄한 아로니아 분말에 물을 첨가한 후 추출하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 추출한 아로니아 추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종한 후 발효시키는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 아로니아 발효액의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 아로니아 발효액, 상기 아로니아 발효액을 유효성분으로 함유하는 가공식품 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 아로니아 발효용 미생물 제제에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 플란타룸 MIFI-SY3 균주를 이용한 아로니아 발효액의 제조방법{Method for producing aronia fermentation product using Lactobacillus plantarum MIFI-SY3 strain}

아로니아(Aronia, Chokeberry)는 북미가 원산지인 관목으로서, 장미과에 속한다. 아로니아는 작고 신맛이 나는 열매가 열리는데, 늦여름에 열매가 익고 곧바로 떨어지며 잎은 부드럽고 윤이 나며 연한 녹색이다.

아로니아 열매(Aronia berry, Black Chokeberry)는 다량의 당류(20%)와 안토시아닌(antocyanins), 폴리페놀(polyphenol), 비타민 B1, B2, 판토텐산, 플라보노이드(flavonoid) 등을 함유하고 있다. 특히, 안토시아닌과 폴리페놀은 인체 내에서 혈액 순환에 도움을 주고, 미세혈관의 투과성, 혈관의 탄력성, 혈압의 정상화 등에 도움을 주며, 특히 눈의 미세혈관에 긍정적인 효과를 제공하여 시력 증진 효과를 나타낸다고 알려져 있어, 최근 웰빙식품으로 떠오르고 있다.

이처럼 아로니아 열매의 구성 성분들이 인체에 유용한 효과를 나타내는 것으로 알려지면서 아로니아 열매를 가공하여 식품으로 활용하고자 하는 연구가 많이 진행되고 있다. 아로니아는 재배하기 쉬운 장점으로 인해 우리나라에서 재배 면적이 급속도로 증가하고 있으나, 가정이나 회사에서 아로니아 과일 전부를 이용하여 손쉽게 식품을 제조할 수 있는 가공 방법이 거의 없다. 또한 아로니아는 과피가 두껍고 신맛과 떫은맛이 강하여 생과를 그대로 이용하기 어려운 문제점이 있다. 따라서 아로니아 과일에 함유된 기능성 성분을 전부 이용할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하다.

유산균은 다양한 식품의 발효에 관여하여 독특한 풍미를 부여할 뿐 아니라, 항균성 물질을 생산하여 식품의 저장성 및 안정성을 증대시킨다. 이러한 유산균이 생산하는 항균성 물질로는 젖산 등의 유기산 이외에 과산화수소, 디아세틸, 박테리오신 등이 알려져 있다.

보편적으로 많이 알려진 유산균은 치즈 등과 같은 발효된 유지방 식품에서 분리되거나 건강한 사람 또는 동물 등의 분변에서 분리된 것들로서, 동물 유래 유산균들이 대부분을 차지하고 있다. 한편, 오래전부터 아시아권의 나라에서는 서양과 다르게 식물성의 채소, 콩류를 통해서 발효된 식품을 즐겨왔으며, 최근 동물 유래 유산균에 비해 열악한 환경에서 생육을 하는 식물성 유산균에 대한 관심이 점점 높아지고 있다. 일본에서 처음 시작된 식물성 유산균에 관한 연구는 내산성이 강하고 장에서 활발하게 성장하여 장내 세균총을 활성화시키는 균종을 분리하는데 초점이 맞춰져 왔으며, 분리된 균주를 식품, 의약품 등의 다양한 분야에서 산업화하기 시작하면서 관련 연구가 더욱 각광을 받고 있다.

한국공개특허 제2017-0085830호에는 유산균을 이용한 항산화 기능성이 향상된 아로니아 발효음료 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1792919호에는 젖산균을 이용한 고농도 GABA 함유 아로니아 발효물의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 MIFI-SY3 균주를 이용한 아로니아 발효액의 제조방법과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 유해 미생물에 대한 항균 활성, 효소 활성, 항생제 내성, 내산성 및 내담즙성을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3 균주를 분리하고, 상기 균주를 이용하여 제조조건을 최적화하여 품질 및 기호도가 우수한 아로니아 발효액의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 건조한 후 분쇄한 아로니아 분말에 물을 첨가한 후 추출하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 추출한 아로니아 추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종한 후 발효시키는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 아로니아 발효액의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 아로니아 발효액을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아로니아 발효액을 유효성분으로 함유하는 가공식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3 균주(KCCM12178P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 아로니아 발효용 미생물 제제를 제공한다.

본 발명의 아로니아 발효액은 유해 미생물에 대한 항균 활성, 효소 활성, 항생제 내성, 내산성 및 내담즙성을 갖는 특정 락토바실러스 플란타룸 균주를 사용하기 때문에 고품질의 아로니아 발효액을 제조할 수 있으며, 기호도가 우수하여 음용이 용이하게 첨가물이 없으므로 장기간 복용하여도 문제가 없어, 상기 아로니아 발효액을 이용하여 다양한 가공식품에 적용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3의 16S rRNA 염기서열을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 MIFI-SY3의 계통수(phyrogenetic tree)이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 건조한 후 분쇄한 아로니아 분말에 물을 첨가한 후 추출하는 단계; 및

(b) 상기 (a)단계의 추출한 아로니아 추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종한 후 발효시키는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 아로니아 발효액의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 아로니아 발효액의 제조방법에서, 상기 (a)단계는 바람직하게는 건조한 후 분쇄한 아로니아 분말 1~3 g에 물 80~120 mL를 첨가한 후 90~110℃에서 1.5~2.5시간 동안 추출할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 건조한 후 분쇄한 아로니아 분말 2 g에 물 100 mL를 첨가한 후 100℃에서 2시간 동안 추출할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 아로니아를 추출하는 것이 추출물 내 폴리페놀, 플라보노이드 등과 같은 기능성 성분과 항산화 활성을 더욱 증진시킬 수 있었다.

또한, 본 발명의 아로니아 발효액의 제조방법에서, 상기 (b)단계의 발효는 바람직하게는 30~37℃에서 1~4일 동안 발효시킬 수 있다. 상기와 같은 발효 과정을 통해 발효액 내 탄닌 함량은 감소하고, 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항고혈압 활성과 같은 기능성은 더욱 높일 수 있었다.

또한, 본 발명의 아로니아 발효액의 제조방법에서, 상기 균주는 유해 미생물에 대한 항균 활성, 효소 활성, 항생제 내성, 내산성 및 내담즙성을 갖는 청국장에서 분리한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3 균주를 선발한 것으로, 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2017년 11월 28일자로 기탁하였다(KCCM12178P).

상기 항균 활성은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 및 잔토모나스 시트리(Xanthomonas citri)에 대한 항균 활성을 의미하고, 상기 효소 활성은 류신 아릴아미다제(leucine arylamidase), 발린 아릴아미다제(valine arylamidase), 애시드 포스파타아제(Acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라아제(Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), α-글루코시다아제(α-glucosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase)에 대한 효소 활성을 의미하며, 상기 항생제 내성은 아미카신(Amikacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 콜리스틴(Colistin), 세프티오퍼(Ceftiofur), 젠타마이신(Gentamicin), 린코마이신(Lincomycin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 카나마이신(Kanamycin), 네오마이신(Neomycin), 노르플록사신(Norfloxacin) 및 스트렙토마이신(Streptomycin)에 대한 내성을 의미한다. 또한, 상기 내산성은 pH 3에 대한 내산성이며, 내담즙성은 1~4% 담즙산에 대한 내담즙성일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 아로니아 발효액의 제조방법은, 보다 구체적으로는

(a) 건조한 후 분쇄한 아로니아 분말 1~3 g에 물 80~120 mL를 첨가한 후 90~110℃에서 1.5~2.5시간 동안 추출하는 단계; 및

(b) 상기 (a)단계의 추출한 아로니아 추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3 균주(KCCM12178P)를 접종한 후 30~37℃에서 1~4일 동안 발효시키는 단계를 포함할 수 있으며,

더욱 구체적으로는

(a) 건조한 후 분쇄한 아로니아 분말 2 g에 물 100 mL를 첨가한 후 100℃에서 2시간 동안 추출하는 단계; 및

(b) 상기 (a)단계의 추출한 아로니아 추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3 균주(KCCM12178P)를 접종한 후 30~37℃에서 1~4일 동안 발효시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 아로니아 발효액을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 아로니아 발효액을 이용한 가공식품을 제공한다.

본 발명의 아로니아 발효액을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 아로니아 발효액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합 양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 발효액은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양의로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 구체적인 예로, 상기 아로니아 발효액을 이용하여 농산물, 축산물 또는 수산물의 특성을 살려 변형시키는 동시에 저장성을 좋게 한 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예를 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품, 국수 등을 포함한다. 과자는 비스킷, 파이, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼(곡물푸레이크 등의 식사대용품류 포함) 등을 포함한다. 음료는 탄산음료, 기능성 이온음료, 쥬스(예를 들어, 사과, 배,포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주,양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예를 들어, 참치, 고등어, 공치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파인애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지, 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 밀봉포장생면 등의 국수를 포함한다. 이 외에도 상기 발효액은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.

또한, 상기 아로니아 발효액을 이용하여 기능성 식품, 건강식품 또는 건강보조식품을 제조할 수 있다. 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품은 영양 기능 외에도 생리활성 성분을 포함하여 생체조절 기능을 제공하는 식품을 의미하고, 본 발명의 아로니아 발효액은 항산화 효과 및 알파-글루코시데이즈 저해 활성을 가지므로 기능성 식품, 건강식품 또는 건강보조식품 등의 제조에 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3 균주(KCCM12178P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 아로니아 발효용 미생물 제제를 제공한다.

본 발명에 따른 아로니아 발효용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 아로니아 발효액

(a) 동결 건조한 후 분쇄한 아로니아 분말 2 g에 증류수 100 mL를 첨가한 후 100℃에서 2시간 동안 추출하고, 0.45 ㎛ PVDF 필터장치를 이용하여 여과한 후 상등액만 분리하였다.

(b) 상기 (a)단계의 분리한 상등액이 첨가된 기본 배지에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3 균주(KCCM12178P) 10%(v/v)를 접종한 후 30~37℃ 및 150 rpm에서 1~4일 동안 발효하였다.

실시예 1: 청국장으로부터 유산균의 분리

유산균 분리를 위하여 다양한 종류의 청국장을 수집하여 냉장 보관하면서 24시간 이내에 0.85% 생리식염수에 10배수로 단계적으로 희석한 후 0.1 ml씩 MRS-BCP(Difco) 고체 배지에 도말하여 배양한 후 노란색의 집락을 선택하여 유산균을 순수 분리하였다. 각종 청국장으로부터 분리한 유산균은 MRS 고체 배지에서 배양하여 20% 글리세롤 용액에 현탁시킨 후 -80℃ 냉동고에 보관하였다.

실시예 2. 분리 유산균의 병원성 미생물에 대한 억제 활성 측정

선별된 유산균을 18시간 이상 MRS 배지에서 배양한 다음 원심분리(15,000 rpm, 25분, 4℃)하고 멤브레인 필터(0.2 ㎛, Dismic, Advantec)로 여과한 후 멸균하여, 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액을 아세톤을 이용하여 부분 정제하여 10배로 농축하여 사용하였다. 100 ㎖의 NB 연한천(0.8%, w/v)에 병원성 미생물을 섞어서 혼합하였다. 혼합한 배지 용액을 25 ㎖씩 분주하여 완전히 굳힌 후, 살균된 팁을 이용하여 직경 5 ㎜의 구멍을 내고, 분리 균주의 농축한 배양 상등액 100 ㎕를 접종하였다. 4℃에서 2~3시간 정도 방치하여 상등액이 확산되게 한 후 감수성 균주의 생육 최적 온도에서 18시간 이상 배양하여 저해환 생성 여부를 확인하였다. 저해환은 지름(mm)과 AU(activity unit)로 표시하였고, 농축 배양 상등액을 순차적으로 2배씩 멸균증류수로 희석하여 저해환을 형성하는 최대 희석배수의 역수를 취하고, 이 값에 1 ㎖에 대한 환산계수를 곱하여 AU/㎖로 나타내었다.

그 결과 모든 유해 미생물에 억제활성을 나타내는 유산균 1종을 선발하였다. 선발된 유산균에 의한 유해 미생물의 생장 억제환을 지름(mm)과 AU/ml로 표 1에 나타내었다.

분리 유산균의 병원성 미생물에 대한 억제 활성 측정

미생물	감수성 균주(Indicator species)	항균력(Antimicrobial activity)
미생물	감수성 균주(Indicator species)	활성 단위 (AU/㎖)	저해환 지름 (㎜)
그람 양성 세균	바실러스 세레우스 (Bacillus cereus KCTC 3624)	320	400
	바실러스 세레우스 (Bacillus cereus KCTC 1013)	160	320
	바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium KCTC1098)	320	420
	바실러스 스패리쿠스 (Bacillus sphaericus KCTC 1184)	40	210
	엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium KCTC 3095)	160	350
	리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes KCTC 3710)	160	240
	리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes KCTC 3444)	160	220
	스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus R209 KCTC 1928)	320	340
	스타필로코커스 속 (Staphylococcus sp.)	320	340
그람 음성 세균	에스케리키아 콜리 (Escherichia coli CFT073 ATCC 700928)	160	350
	에스케리키아 콜리 (Escherichia coli)	160	320
	살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica TV 119 KCTC 1925)	320	440
	살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica SL 1102 KCTC 1926)	320	480
	시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri KCTC 2517)	320	430
효모	캔디다 알비칸스 (Candida albicans KCTC 1940)	20	90
효모	캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis KCTC 7212)	20	90
식물 병원성 세균	잔토모나스 시트리 (Xanthomonas citri KCTC 2499)	320	380

실시예 3: 분리 유산균의 동정

상기 실시예 2의 결과 선정된 분리 균주의 동정은 Bergey's Manual of Determinative bacteriology의 방법에 따라 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였다. 최적 생육 온도, 그람 염색, 운동성, 카탈라아제 실험(catalase test), CO₂생성 유무를 확인하였다. 최종적으로 16S rRNA 유전자를 증폭하여 분리 균주를 동정하여 분리하였으며, 프라이머로는 27F 프라이머('AGAGTTTGATCMTGGCTCAG' : 서열번호 2)와 1492R 프라이머('TACGGYT ACCTTGTT ACGACTT' : 서열번호 3)를 사용하였고, PCR 조건은 초기변성 5분, 그리고 94℃에서 45초간 변성, 55℃에서 60초간 결합 및 72℃에서 60초간 합성의 사이클을 35회 하였다. 16S rRNA 염기서열(서열번호 1) 확인은 ㈜마크로젠에 의뢰하여 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었으며, 분리 균주의 계통수는 MEGA 6.0 프로그램 속의 neighbor-joining method에 기초해서 작성하여 도 2에 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 MIFI-SY3 균주는 16S rRNA 유전자 DNA서열 분석에서 락토바실러스 플란타룸 BDLP0001 균주와 가장 높은 유사도를 보였으며, 다른 락토바실러스 속들의 16S rRNA 유전자와도 대부분 98% 이상의 높은 유사도를 보였다. 계통수 분석의 결과도 본 발명의 MIFI-SY3 균주가 락토바실러스 플란타룸 BDLP0001 균주와 가장 가까운 근연 균주임을 확인하였다(도 2). 또한 본 발명자들은 동정한 균주가 기존에 존재하지 않는 신규한 균주임을 확인함으로써, 2017년 11월 28일 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12178P를 부여받았다.

이하 본 발명에서는 상기 동정한 신균주를 “락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3”로 명명하였다.

실시예 4: 락토바실러스 플란타룸 MIFI -SY3 균주의 특성 조사

1) 내산성 확인

선별한 유산균을 30℃에서 24시간 배양한 후 9,000 rpm에서 25분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 분리 균주를 pH 3.0으로 조정한 MRS 액체 배지에 균주를 1.4×10⁸ CFU/ml 정도가 되도록 접종하여 90분간 배양하면서 30분마다 생균수를 측정하였다. 그 결과, 락토바실러스 플란타룸 MIFI-SY3 균주는 pH 3의 조건에서 생존하여 내산성이 있음을 확인할 수 있었다.

내산성 확인

pH	0분	30분	60분	90분
3.0	1.4ⅹ10⁸ CFU/ml	1.1ⅹ10⁸ CFU/ml	1.0ⅹ10⁷ CFU/ml	1.2ⅹ10⁶ CFU/ml

2) 내담즙성 확인

분리 균주의 내담즙성 시험은 옥스갈(oxgall) 함량이 1~4%로 각각 포함되게 MRS 배지를 제조하여 인공 담즙액으로 사용하였다. 분리한 유산균을 30℃에서 24시간 배양 후 9,000 rpm에서 25분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수한 균체를 0.01M의 PBS(phosphate buffer saline)로 2회 세척하여 상등액과 동량으로 1~4%의 옥스갈(oxgall)이 포함되어 있는 MRS 배지를 첨가하여 30℃에서 3시간 배양한 후 0.85% 완충식염수(saline buffer)로 단계적으로 희석하여 MRS 한천 배지에 도말하여 생육하는 유산균의 집락 수를 측정하여 생존율을 산출하였다.

그 결과 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 MIFI-SY3 균주는 옥스갈 1~4% 농도에서 생존함을 확인하여 내담즙성을 소유한 것으로 판단되었다.

내담즙성 확인

옥스갈(Oxgall, %)	락토바실러스 플란타룸 MFI-SY3
0	1.4 ⅹ10⁹
1	5.0 ⅹ10⁸
2	3.0 ⅹ10⁸
3	2.2 ⅹ10⁸
4	1.5 ⅹ10⁷

3) 항생제 감수성 확인

항생제 감수성 검사는 원반확산법을 이용하였다, 먼저 균액을 0.85% 생리식염수에 맥팔랜드 스탠다드(#0.5 McFarland Standard) 농도로 맞추었다. MRS 고체 배지 전면에 멸균된 면봉으로 균 배양액을 균등하게 도말한 후 5분간 방치하여 건조하였다. 건조한 배지 위에 멸균한 핀셋을 이용하여 항생제 감수성 검사용 원판을 집어 배지 위에 얹고 완전히 밀착시켰다. 이때 원판과 원판 또는 배지의 가장자리와의 거리는 최소한 15 mm 이상의 간격을 유지하였으며, 배지의 뚜껑을 밑으로 가게 하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 원판 주위의 분리 균주의 증식억제대의 직경을 자로 측정한 후 판정하였다. 본 실험에 사용한 항생제의 약제명과 용량 및 그 실험 결과를 표 4에 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 MIFI-SY3 균주는 아미카신(Amikacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 콜리스틴(Colistin), 세프티오퍼(Ceftiofur), 젠타마이신(Gentamicin), 린코마이신(Lincomycin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 카나마이신(Kanamycin), 네오마이신(Neomycin), 노르플록사신(Norfloxacin) 및 스트렙토마이신(Streptomycin)에 대한 내성을 확인하였다.

항생제 감수성 확인

항생제	코드	디스크 역가	지름(mm)
아미카신(Amikacin)	AN-30	30 ㎍	R¹ ⁾
아목시실린/클라불란산 (Amoxicillin/Clavulanic Acid)	AMC-30	20 ㎍/10 ㎍	27-28
암피실린(Ampicillin)	AM-10	10 ㎍	25-26
세팔로신(Cephalothin)	CF-30	30 ㎍	16-17
시프로플록사신(Ciprofloxacin)	CIP-5	5 ㎍	R
콜리스틴(Colistin)	CL-10	10 ㎍	R
독시사이클린(Doxycycline)	D-30	30 ㎍	21-22
에리스로마이신(Erythromycin)	E-15	15 ㎍	21-22
세프티오퍼(Ceftiofur)	EFT-30	30 ㎍	R
젠타마이신(Gentamicin)	GM-10	10 ㎍	R
린코마이신(Lincomycin)	L-2	2 ㎍	R
린코마이신/스펙티노마이신 (Lincomycin/Spectinomycin)	LS109	109 ㎍	R
카나마이신(Kanamycin)	K-30	30 ㎍	R
네오마이신(Neomycin)	N-30	30 ㎍	R
노르플록사신(Norfloxacin)	NOR-10	10 ㎍	R
페니실린(Penicillin)	P-10	10 U	11-12
스트렙토마이신(Streptomycin)	S-10	10 ㎍	R
테트라사이클린(Tetracycline)	TE-30	30 ㎍	17-18
트리메토프림/설파메톡사졸 (Trimethoprim/Sulfamethoxazole)	SXT	1.25 ㎍/23.75 ㎍	15-16

¹⁾ R: 저항성(Resistance)

4) 당 이용성 확인

당 이용성을 확인하기 위하여 락토바실러스 플란타룸 MIFI-SY3 균주를 API 50 CHL 키트(바이오메리오사)를 사용하여 확인하였으며 그 결과는 표 5에 나타내었다.

그 결과, 당 이용성은 L-아라비노스(L-Arabinose), D-리보스(D-Ribose), D-갈락토스(D-Galactose), D-글루코스(D-Glucose), D-프락토스(D-Fructose), D-만노스(D-Mannose), D-만니톨(D-Mannitol), D- 소르비톨(D-Sorbitol), N-아세틸-글루코사민(N-Acetyl-Glucosamine), 아미그달린(Amygdalin) 및 알부틴(Arbutin) 등을 탄소원으로 이용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

당 이용성 확인

API 50 CHL
Control	-¹⁾	Esculine	+
Glycerol	-	Salicine	+
Erythritol	-	D-Cellobiose	+
D-Arabinose	-	D-Maltose	+
L-Arabinose	+	D-Lactose	+
D-Ribose	+	D-Melibiose	+
D-Xylose	-	D-Saccharose	+
L-Xylose	-	D-Trehalose	+
D-Adonitol	-	Inuline	+
Methyl-β-D-Xylopyranside	-	D-Melezitose	+
D-Galactose	+	D-Raffinose	+
D-Glucose	+	Amidon(Starch)	-
D-Fructose	+	Glycogene	-
D-Mannose	+	Xylitol	-
L-Sorbose	-	Gentiobiose	+
L-Rhamnose	-	D-Turanose	+
Dulcitol	-	D-Lyxose	-
Inositol	-	D-Tagatose	-
D-Mannitol	+	D-Frucose	-
D-Sorbitol	+	L-Frucose	-
Methyl-α, D-Mannopyranside	-	D-Arabitol	-
Methyl-α, D-Glucoside	-	L-Arabitol	-
N-Acetyl-Glucosamine	+	Gluconate	+
Amygdalin	+	2-keto-Gluconate	-
Arbutin	+	5-keto-Gluconate	-

¹⁾ +: 활성, -: 비활성

5) 효소 생성능 확인

락토바실러스 플란타룸 MIFI-SY3의 효소 생성 여부를 확인하기 위하여, API 20 ZYM 키트(바이오메리오사)를 이용하여 19개 효소에 대한 생산성을 확인하였으며, 그 결과는 표 6에 나타내었다. 하기 표 6과 같이 MIFI-SY3 균주는 류신 아릴아미다제(leucine arylamidase), 발린 아릴아미다제(valine arylamidase) 등을 생산하였고, α와 β-글루코시다제 활성도 지님을 확인하였다.

효소 활성 분석 결과

효소	결과
Control	-¹⁾
Alkaline phosphatase	-
Esterase (C4)	-
Esterase Lipase (C8)	-
Lipase (C14)	-
Leucine arylamidase	+
Valine arylamidase	+
Crystine arylamidase	-
Trypsin	-
α-chymotrypsin	-
Acid phospatase	+
Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase	+
α-galactosidase	+
β-galactosidase	+
β-glucuronidase	-
α-glucosidase	+
β-glucosidase	+
N-acetyl-β-glucosaminidase	+
α-mannosidase	-
α-fucosidase	-

¹⁾ +: 활성, -: 비활성

실시예 5: 락토바실러스 플란타룸 MIFI -SY3 균주가 생산하는 항균성 물질의 특성 조사

먼저 MRS 액체 배지에서 균주를 24시간 동안 배양한 후 원심분리하여 얻은 배양 상등액을 아세톤으로 1:3의 비율로 혼합하여 -80℃에서 30분간 방치 후 원심분리하여, 활성 있는 부분을 배양 상등액의 10배가 되도록 하여 증류수에 녹였다. 이렇게 준비된 항균성 시료에 대해 본 발명이 속하는 분야에서 상용화된 활성측정법인 웰 확산 분석(well diffusion assay)법을 이용하여 항균 범위, pH 안정성, 열 안정성 및 효소 처리가 항균활성에 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 다음 표 7에 각각 나타내었다. 그 결과, 락토바실러스 플란타룸 MIFI-SY3 균주가 생산하는 항균성 물질이 열 안정성, 용매 안정성, pH 안정성 및 효소 안정성이 있는 것을 확인하였다.

항균성 물질의 특성 조사

처리		잔류 활성 단위(AU/ml)
Control		320
열 처리	80℃, 30분	320
	80℃, 60분	320
	100℃, 30분	320
	100℃, 60분	320
	121℃, 30분	320
	121℃, 60분	-
용매	메탄올(Methanol)	320
	클로로포름(Chloroform)	320
	아세토나이트릴(Acetonitrile)	320
	에탄올(Ethanol)	320
	아세톤(Acetone)	320
	이소프로판올(Isopropanol)	320
pH	3~4	320
	5~6	320
	7~8	320
	9	320
효소	효소 무처리	+
	프로테이나아제 K(Proteinase K)	+
	트립신(Trypsin)	+
	키모트립신(Chymotrypsin)	+
	펩신(Pepsin)	+
	α-아밀라아제(α-Amylase)	+
	서브틸리신 A(Subtilisin A)	+
	프로테아제(Protease)	+

실시예 6. 아로니아 추출물의 추출조건 확립

동결건조한 후 분쇄한 아로니아 분말 2 g에 증류수 100 mL를 첨가한 후, 추출온도를 달리하여 2시간 동안 추출하고, 여과한 후 분리한 상등액을 동결건조하였다. 동결건조한 상등액을 단계적으로 희석하여 DPPH 라디칼 소거능, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 다른 추출 온도에 비해 100℃에서 추출한 아로니아 추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 우수하고, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높은 것으로 확인되었다.

또한, 100℃에서 추출시간을 달리하여 추출하고, 여과한 후 분리한 상등액을 동결건조하였다. 동결건조한 상등액을 단계적으로 희석하여 DPPH 라디칼 소거능, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 다른 추출 시간으로 추출한 아로니아 추출물에 비해 2시간 추출한 아로니아 추출물이 DPPH 라디칼 소거능이 우수하고, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높은 것으로 확인되었다(표 9).

추출시간에 따른 아로니아 추출물의 품질 특성

품질 특성	추출 시간	시료 농도(㎎/㎖)
품질 특성	추출 시간	6.3	3.1	1.6	0.8	0.4	0.2
DPPH 라디칼 소거능(%)	2	80.05	72.0	50.05	27.75	14.2	7.4
	3	76.3	53.3	30.9	8.8	12.2	8.4
	4	71.0	45.3	23.1	11.2	4.6	0
	5	71.5	46.7	24.9	12.7	5.7	1.4
	6	72.1	38.0	23.9	12.5	5.9	2.0
폴리페놀 함량(㎍ GAE/㎖)	2	489.8	266.5	133.3	74.1	35.5	15.9
	3	279.7	143.9	77.0	41.5	21.4	10.8
	4	268.0	142.8	73.3	36.8	18.2	10.3
	5	286.5	150.1	79.8	39.9	22.4	10.7
	6	273.7	148.9	78.4	39.0	20.3	10.1
플라보노이드 함량(㎍ RE/㎖)	2	249.3	118.2	59.9	41.4	26.9	16.3
	3	96.3	49.4	26.0	28.3	6.6	4.1
	4	117.7	57.4	39.7	18.0	11.3	5.9
	5	108.8	48.0	30.2	11.6	4.5	3.1
	6	111.0	44.4	20.1	17.3	7.5	4.8

추가적으로, 추출시간에 따른 안토시아닌 함량을 측정한 결과, 2시간 추출 시 가장 높은 함량을 나타냄을 확인할 수 있었다(표 10).

추출시간에 따른 아로니아 추출물의 안토시아닌 함량

추출시간	2	3	4	5	6
안토시아닌 함량 (cyanidin-3-glucoside equivalents, mg/L)	12.3	7.1	4.9	3.8	3.3

실시예 7. 아로니아 추출물의 발효조건 확립

선별한 균주를 5 ml의 MRS 액체 배지에 전배양(12시간, 30℃, 150 rpm)한 후 100 ml의 MRS 액체 배지에 본 배양(24시간, 30℃, 150 rpm)한 후 원심분리 및 세척을 통하여 배지 성분은 제거 후 셀만을 회수하여 발효 종균으로 사용하였으며, 아로니아 동결건조 분말 2 g에 증류수 100 ml를 가한 후 121℃에서 20분간 멸균 후, 각 균주를 최종 부피 대비 10%의 비율로 접종하여 혼합한 후 생물전환효소의 최적 반응온도(37℃) 및 균주의 생육 최적 온도(30℃)에서 4일간 배양하면서 1일 단위로 샘플을 회수하여, 총균수, 항산화, 항당뇨 활성 및 항고혈압 활성을 분석하였다.

균주를 10% 접종하여 발효시킨 결과, 대조군(비발효)과 비교하여 DPPH 라디칼 소거능과 같은 항산화 활성은 발효전과 비교하여 6~7% 활성이 증가하였으며, 항당뇨 활성은 4~8% 증가하는 것으로 확인되었다. 항고협압과 관련된 ACE 활성을 분석한 결과 발효 전과 비교하여 4~5%로 활성이 증가하는 것으로 확인되었다.

아로니아에는 다양한 폴리페놀 화합물(polyphenolic compound)과 에피갈로카테킨(epigallocatechin, EGC), 카테킨(catechin), 에피카테킨(epicatechin, EC), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate, ECG) 등 다양한 폴리페놀 화합물이 포함되어 있다. 탄닌 성분의 일부인 위 성분들은 식품 가공 시 침전 및 혼탁물 형성 등 떫은맛으로 식품가공 공정의 장애물이 되며 단백질과 결합하여 단백질의 소화를 억제시키고 비타민 B12와 결합하여 장내 흡수를 저해한다. 균주를 10% 접종하여 발효시킨 결과 대조군(비발효)과 비교하여 탄닌 함량이 발효 후 약 9% 감소함을 확인하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12178P

20171128

<110> Sunchang Research Institute of health and Longevity <120> Method for producing aronia fermentation product using Lactobacillus plantarum MIFI-SY3 strain <130> PN17501 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1526 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum MIFI-SY3 <400> 1 ggaactcagg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgaacgaact 60 ctggtattga ttggtgcttg catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt 120 aacacgtggg aaacctgccc agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg 180 cataacaact tggaccgcat ggtccgagtt tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga 240 tggtcccgcg gcgtattagc tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta 300 gccgacctga gagggtaatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg 360 aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag 420 tgaagaaggg tttcggctcg taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac 480 tgttcaggta ttgacggtat ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 540 ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg 600 ttttttaagt ctgatgtgaa agccttcggc tcaaccgaag aagtgcatcg gaaactggga 660 aacttgagtg cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata 720 tggaagaaca ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa 780 gtatgggtag caaacaggat tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta 840 agtgttggag ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg 900 gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 960 catgtggttt aattcgaagc tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat actatgcaaa 1020 tctaagagat tagacgttcc cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1080 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg 1140 ccagcattaa gttgggcact ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1200 tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta 1260 caacgagttg cgaactcgcg agagtaagct aatctcttaa agccattctc agttcggatt 1320 gtaggctgca actcgcctac atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1380 cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca 1440 cccaaagtcg gtggggtaac cttttaggaa ccagccgcct aaggtgggac agatgattag 1500 ggtgaagtcg tacaaagggt aaccaa 1526 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims

(a) 건조한 후 분쇄한 아로니아 분말에 물을 첨가한 후 추출하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계의 추출한 아로니아 추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종한 후 발효시키는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 아로니아 발효액의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3 균주(KCCM12178P)인 것을 특징으로 하는 아로니아 발효액의 제조방법.
제2항에 있어서,
(a) 건조한 후 분쇄한 아로니아 분말 1~3 g에 물 80~120 mL를 첨가한 후 90~110℃에서 1.5~2.5시간 동안 추출하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계의 추출한 아로니아 추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3 균주(KCCM12178P)를 접종한 후 30~37℃에서 1~4일 동안 발효시키는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 아로니아 발효액의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 아로니아 발효액.
제5항의 아로니아 발효액을 유효성분으로 함유하는 가공식품.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MIFI-SY3 균주(KCCM12178P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 아로니아 발효용 미생물 제제.