KR102259263B1

KR102259263B1 - 아로니아 발효액으로부터 분리된 위커하모마이세스 아노말루스 균주 및 이를 이용하여 아로니아 탄닌을 저감처리하는 방법

Info

Publication number: KR102259263B1
Application number: KR1020200079578A
Authority: KR
Inventors: 송지영; 박희전; 변보영; 정소희; 김지명
Original assignee: 재단법인 베리앤바이오식품연구소
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2021-05-31

Abstract

본 발명은 아로니아 발효액으로부터 분리된 위커하모마이세스 아노말루스 균주와, 상기 분리된 위커하모마이세스 아노말루스 균주를 이용하여 아로니아의 탄닌을 저감시켜 떫은 맛의 저감화하는 방법에 관한 것이다.

Description

아로니아 발효액으로부터 분리된 위커하모마이세스 아노말루스 균주 및 이를 이용하여 아로니아 탄닌을 저감처리하는 방법{Decreasing methods of tannins in Aronia extract using Wickerhamomyces anomalus from Aronia fermentation composition}

아로니아는 블루베리와 비슷한 모양의 보라색 열매로 안토시아닌 함량이 베리류 중 매우 높은 편이며 중세 유럽 왕들이 즐겼다고 해서‘킹스베리’, 중국에서는 늙지 않는 열매‘불로매(不老梅)라고 불린다.

아로니아(Aronia melanocarpa)는 블랙초크베리(black chokeberry)라고도 알려져 있으며, 북아메리카지역이 원산지로 유럽에서 많이 재배되고 있으며, 최근 국내에서도 재배가 증가되었다.

아로니아는 색과 향이 좋아 주스나 잼으로 주로 가공되며, 열매에는 안토시아닌 색소가 풍부하여 천연색소로의 사용이 가능하고, 폴리페놀 및 플라보노이드와 같은 파이토케미칼을 함유하고 있어 항산화 및 항염 작용, 면역조절 등 다양한 기능을 가지는 것으로 알려져 있다.

아로니아 열매는 크기가 작고 많이 열리며 미숙상태에서도 표면이 까맣게 된 후 익어가므로 농가에서는 열매의 완숙기를 판별하기가 어려워 다른 농작물의 작업일정에 따라 수확시기를 결정하고 있다.

나무에서는 완숙 후 열매가 쉽게 물러지지 않으며, 수확 후 후숙이 되지 않으므로 미숙 열매를 수확하는 것은 바람직하지 않다. 아로니아 미숙과의 안토시아닌이 완숙열매에 비해 30% 적게 함유하고 있다.

아로니아는 간기능 향상, 면역력 향상, 당뇨병 개선 및 지방 분해 효과, 눈 건강과 혈액순환 개선, 항암효과 등이 있다고 알려져 있다. 그러나, 위장기능이 좋지 않은 사람에게서 간혹 위산과다, 위궤양, 십이지장궤양 등의 부작용이 나타날 수 있으며 체질에 맞지 않을 경우 아로니아 복용 후에 복통이나 구토, 어지러움, 이명현상 등의 증상이 나타날 수도 있다.

아로니아 100 g에는 매실씨나 사과씨, 살구씨에 함유된 아미그달린(Amygdalin) 물질이 20.1mg 함유되어 있다고 보고되어 매실처럼 발효 후 섭취하는 방법이 바람직할 것으로 사료된다.

아로니아에는 주로 안토시아닌과 같은 폴리페놀류, 플라보노이드 및 탄닌 등을 함유하고 있다. 탄닌은 과실의 떫은 맛을 내는 성분으로 아로니아의 경우 다른 베리류 보다 많이 함유하고 있어 특유의 떫은 맛으로 다른 베리류에 비해 선호하지 않는 것으로 확인되고 있다.

대한민국 등록특허 10-1828863(등록일자 2018년02월07일) 대한민국 공개특허 10-2020-0032974(공개일자 2020년03월27일) 대한민국 등록특허 10-2032703(등록일자 2019년10월10일) 대한민국 등록특허 10-1542303(등록일자 2015년07월30일)

본 발명은 본 발명은 아로니아 발효액으로부터 분리된 위커하모마이세스 아노말루스 균주를 제공하고, 상기 분리된 위커하모마이세스 아노말루스 균주를 이용하여 아로니아의 탄닌을 저감시켜 떫은 맛의 저감화하는 방법을 제공하고자 하는 것을 발명의 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 아로니아 발효액으로부터 순수 분리, 동정하는 것으로서, 기탁번호 KCTC18829P로 기탁된 위커하모마이세스 아노말루스 AY202101(Wickerhamomyces anomalus AY202101) 균주를 제공한다.

또한,

기탁번호 KCTC18829P로 기탁된 위커하모마이세스 아노말루스 AY202101(Wickerhamomyces anomalus AY202101) 균주를 아로니아 발효액으로부터 순수 분리, 동정하는 단계와,

아로니아 착즙액에 상기 분리 동정한 위커하모마이세스 아노말루스 AY202101(Wickerhamomyces anomalus AY202101) 균주(기탁번호 KCTC18829P)배양액을 접종한 후 29~31 ℃에서 125~145 rpm으로 2~4 일간 배양하여 아로니아의 탄닌을 저감시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 위커하모마이세스 아노말루스 균주를 이용하여 아로니아 탄닌을 저감처리하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 아로니아 발효액으로부터 분리한 미생물을 이용하여 아로니아 탄닌 저감 처리함으로써 아로니아의 떫은 맛의 저감화를 효과적으로 이룰 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 농도별 아로니아 발효액의 발효기간별 일반세균 균수 분석 그래프.
도 2는 본 발명에 따른 농도별 아로니아 발효액의 발효기간별 효모 균수 분석 그래프.
도 3은 본 발명의 발효기간에 따른 설탕 함량 20%의 아로니아 발효액의 페놀성 화합물 분석 그래프.
도 4는 본 발명의 발효기간에 따른 설탕 함량 35%의 아로니아 발효액의 페놀성 화합물 분석 그래프.
도 5는 본 발명의 발효기간에 따른 설탕 함량 50%의 아로니아 발효액의 페놀성 화합물 분석 그래프.
도 6은 분리된 효모의 동정결과를 도시한 도면.
도 7은 본 발명에 따른 효모 분리균주의 카테킨 함량 분석 그래프.

본 발명은 아로니아 발효액으로부터 순수 분리, 동정하는 것으로서, 기탁번호 KCTC 18829P로 기탁된 위커하모마이세스 아노말루스 AY202101(Wickerhamomyces anomalus AY202101) 균주를 제공한다.

또한 상기 위커하모마이세스 아노말루스 AY202101(Wickerhamomyces anomalus AY202101) 균주를 이용한 아로니아 탄닌을 저감처리 방법을 제공한다.

본 발명자들은 상기 분리 및 동정된 균주를 2020년 06월 17일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하여 수탁번호 KCTC18829P를 부여받았다.

본 발명은 미생물이 당질을 이용하여 대사산물로 알코올, 유기산, CO₂ 등을 생성하는 발효 기술을 이용하는 것으로서, 발효를 통해 수득한 아로니아 발효액으로부터 분리한 미생물을 이용하여 아로니아 탄닌 저감 처리한다.

더욱 구체적으로는,

기탁번호 KCTC 18829P로 기탁된 위커하모마이세스 아노말루스 AY202101(Wickerhamomyces anomalus AY202101) 균주를 아로니아 발효액으로부터 순수 분리, 동정하는 단계와,

아로니아 착즙액에 상기 분리 동정한 위커하모마이세스 아노말루스 AY202101(Wickerhamomyces anomalus AY202101) 균주(기탁번호 KCTC18829P)배양액을 접종한 후 29~31 ℃에서 125~145 rpm으로 2~4 일간 배양하여 아로니아의 탄닌을 저감시키는 단계를 포함하여 아로니아 탄닌을 저감처리한다.

이때, 상기 아로니아 착즙액과 균주 배양액의 배합비는 1.5~2.0 : 1 중량비로 한다.

이하, 본 발명에 따른 기술 구성에 대한 구체적인 내용을 살펴보도록 한다.

[ 아로니아 발효액 제조 ]

상기 아로니아 발효액은 아로니아를 수확한 후 꼭지 및 줄기를 제거하여 아로니아와 설탕을 비율별(20wt%, 35wt%, 50wt%)로 80:20, 65:35 또는 50:50의 중량비율이 되도록 혼합하여 23~26 ℃에서 1~2주간 발효시킨 것을 사용한다.

더욱 바람직하게는, 아로니아와 설탕을 80:20의 중량비율로 혼합하여 25 ℃의 온도조건에서 2주간 발효시킨 것을 사용한다. 이때, 1~2주간 발효액의 품질 특성 및 미생물학적 특성을 분석한다.

[ 아로니아 발효액의 이화학적 특성 ]

발효기간에 따른 아로니아 발효액의 이화학적 특성으로 pH, 당도, 산도 및 색도를 분석하였다.

아로니아 발효액의 당도 및 pH, 색도를 각각 당도계(PAL-1, Atago, Tokyo, Japan), pH meter(Seveneasy, Mettler- Toledo, Greifensee, Switzerland), 분광색차계(CM-5, Konica Minolta, Tokyo, Japan)로 측정하였다.

열매의 수분함량은 상압가열건조법으로 측정하였고, 착즙액의 산도는 0.1N NaOH를 이용하여 착즙액을 중화 적정하여 소요되는 양을 측정한 후 사과산으로 계산하였다.

다음의 표 1은 농도별 아로니아 발효액의 발효기간별 이화학적 특성 분석을 나타낸 것이다.

농도별 아로니아 발효액의 발효기간별 이화학적 특성 분석

발효 기간(일)	농도	pH	당도	산도	색도
발효 기간(일)	농도	pH	당도	산도	L	a	b
0	20 %	3.90± 0.03	33.43± 0.49	5.11± 0.75	25.95± 0.45	57.92± 0.26	43.95± 0.50
	35 %	3.97± 0.01	47.70± 0.26	5.01± 0.30	22.41± 0.30	55.09± 0.25	38.60± 0.52
	50 %	4.02± 0.04	60.97± 0.51	3.63± 0.25	25.92± 0.25	57.87± 0.66	41.72± 0.41
7	20 %	3.77± 0.03	31.63± 0.78	5.36± 0.60	30.74± 1.23	61.08± 0.70	47.20± 0.34
	35 %	3.78± 0.04	45.60± 1.14	5.20± 0.23	32.74± 1.06	62.10± 0.39	44.05± 1.74
	50 %	3.95± 0.01	60.37± 3.25	3.73± 0.22	36.56± 0.69	62.32± 0.20	31.47± 1.06
14	20 %	3.83± 0.00	28.83± 0.61	8.77± 0.38	32.60± 0.57	61.37± 0.15	44.09± 0.94
	35 %	3.74± 0.01	45.87± 0.25	7.22± 0.25	30.84± 1.06	60.72± 0.45	43.59± 0.79
	50 %	3.91± 0.01	60.10± 0.53	4.04± 0.25	35.96± 1.40	62.08± 0.42	32.22± 1.69
21	20 %	3.84± 0.03	27.30± 0.92	9.27± 0.41	32.73± 0.67	60.75± 0.14	42.08± 1.22
	35 %	3.75± 0.06	45.40± 0.26	7.54± 0.23	29.03± 0.63	59.33± 0.36	42.53± 0.23
	50 %	3.98± 0.01	60.33± 0.35	4.44± 0.18	33.46± 4.73	60.19± 0.21	33.70± 5.17
28	20 %	3.78± 0.02	25.50± 1.04	12.18± 1.06	31.63± 0.73	59.59± 0.10	42.20± 0.74
	35 %	3.70± 0.03	44.50± 0.30	9.50± 0.23	27.27± 0.35	58.03± 0.16	40.97± 0.09
	50 %	3.75± 0.01	60.10± 0.40	6.02± 0.59	34.35± 1.68	60.57± 0.31	32.53± 2.14
42	20 %	3.83± 0.01	22.50± 0.95	9.22± 0.09	32.02± 0.72	57.77± 0.10	40.50± 0.72
	35 %	3.70± 0.00	43.40± 0.56	7.82± 0.03	26.98± 0.79	57.06± 0.41	38.68± 0.23
	50 %	3.77± 0.01	60.03± 0.31	4.82± 0.24	30.73± 0.72	58.15± 0.33	32.59± 0.97
56	20 %	3.86± 0.03	20.90± 0.66	9.18± 0.08	32.69± 1.12	54.79± 0.29	39.27± 0.65
	35 %	3.71± 0.01	43.27± 0.32	8.02± 0.15	25.48± 0.78	54.70± 0.27	36.19± 0.54
	50 %	3.78± 0.40	59.33± 0.31	5.33± 0.13	26.12± 2.10	54.89± 0.83	33.47± 1.12

설탕 농도별 아로니아 발효액의 이화학적 특성을 분석한 결과 20%, 35%, 50% 아로니아 발효액 모두 발효기간이 지날수록 pH는 감소하고, 산도는 높아지는 경향을 나타내었으며, 당도는 점차 감소하였다.

농도별 아로니아 발효액의 pH의 경우 발효기간에 따라 3.70 ~ 4.02의 범위로 확인되었으며, 발효 28일에 20% 아로니아 발효액은 3.78±0.02, 35%는 3.70±0.03, 50%는 3.75±0.01로 가장 낮은 pH를 나타내었다.

농도별 아로니아 발효액의 당도의 경우 20% 아로니아 발효액은 33.43±0.49 ~ 20.90±0.66%의 범위로 확인되었으며, 35% 아로니아 발효액은 47.70±0.26 ~ 43.27±0.32% 범위, 50% 아로니아 발효액은 60.97±0.51 ~ 59.33±0.31% 범위로 확인되었다. 농도별 아로니아 발효액 모두 발효가 진행될수록 당도는 점차 감소하는 경향으로 확인되었다.

농도별 아로니아 발효액의 산도의 경우 발효 28일까지 산도가 증가하다 감소하였으며, 가장 높은 산도를 나타낸 발효 28일의 20% 아로니아 발효액은 12.18±1.06%로 가장 높았으며, 35% 아로니아 발효액은 9.50±0.23%, 50% 아로니아 발효액은 6.02±0.59%로 확인되었다.

이는 pH는 가장 낮은 시점인 발효 28일에 산도는 가장 높은 것으로 확인되었다.

[ 아로니아 발효액의 미생물학적 특성 ]

발효기간에 따른 아로니아 발효액의 미생물학적 특성으로 일반세균, 효모를 분석하였다.

아로니아 발효액은 발효기간별로 샘플을 채취하여 1 g을 취하여 생리식염수 (0.85% NaCl) 9 mL와 혼합한 후 시료를 단계적으로 희석한 다음 균수를 측정하였다.

효모균은 3M Petrifilm Yeast and Mold Count Plates(YM)를 사용하여 25℃에서 48시간 배양하였다. 배양된 콜로니 수는 30~300개인 희석배수에서 계수한 후 시료 1 g당 CFU로 산출하였다.

도 1에 도시된 바와 같이, 농도별 아로니아 발효액의 발효기간별 일반세균을 분석한 결과 설탕 20%가 함유된 아로니아 발효액이 5.61±0.16 Log CFU/g으로 가장 높은 일반세균을 나타내었으며, 설탕 50% 함유 아로니아 발효액이 가장 낮은 일반세균을 나타내었다.

설탕 함유 20%, 35% 및 50% 농도의 아로니아 발효액 모두 발효 21일에 각각 5.61±0.16 Log CFU/g, 4.84±0.24 Log CFU/g 및 4.59±0.35 Log CFU/g으로 가장 높은 일반세균이 확인되었다. 농도별 아로니아 발효액 모두 21일까지 균수가 증가하다가 이후 감소하는 경향으로 확인되었다.

도 2에 도시된 바와 같이, 농도별 아로니아 발효액의 발효기간별 효모 균수를 분석한 결과 설탕 20%가 함유된 아로니아 발효액이 6.88±0.17 Log CFU/g으로 가장 높은 효모 균수를 나타내었다.

설탕 50% 함유 아로니아 발효액이 가장 낮은 효모 균수를 나타내었다.

설탕 함유 20%, 35% 및 50% 농도의 아로니아 발효액 모두 발효 14일에 각각 6.88±0.17 Log CFU/g, 6.26±0.15 Log CFU/g 및 6.00±0.12 Log CFU/g으로 가장 높은 효모 균수가 확인되었다.

농도별 아로니아 발효액 모두 14일까지 균수가 증가하다가 이후 감소하는 경향으로 확인되었다.

[ 아로니아 발효액의 아미그달린 분석 ]

아로니아 발효액은 동결건조 후 분말화하여 사용하였으며, 분말 시료 1g에 메탄올 100 mL를 첨가하고 환류추출기로 70℃에서 2시간 추출한 후, 추출액을 여과지로 여과하여 얻은 여과액을 감압 농축하여 메탄올을 제거하고 잔류물에 증류수 80 mL를 가하여 녹인다.

이후 n-hexane 100 mL를 가하여 분액깔때기로 150 rpm에서 1시간 동안 진탕 추출한 후 수용액 층만을 취하여 여과액을 100 mL 메스플라스크로 옮긴 후, 0.2 μm syringe filter로 여과하여 시험용액으로 사용하였다.

시료 5 μL를 column(Shiseido capcellpak C18 UG, 250 × 4.6 ㎜, ID 5 ㎛)에 주입하고 PDA 검출기를 이용하여 검출하였으며, 이때 이동상 조건으로 acetonitrile과 증류수를 1.0 mL/min의 유속으로 이동시켜 분석하였다. 분석온도와 column oven 온도는 35℃, 검출파장은 UV 214 nm에서 측정하였다.

발효기간별 아로니아 발효액의 아미그달린 함량 분석

발효 기간(주)	설탕 농도(%)	Amygdalin(mg/100g)
0	20	40.99±3.34
	35	9.09±0.24
	50	5.77±0.01
4	20	13.45±3.95
	35	4.81±0.24
	50	3.13±0.59
8	20	12.04±0.59
	35	5.72±2.09
	50	3.24±0.07
12	20	10.64±2.02
	35	2.95±0.43
	50	2.01±0.55

각 설탕 함량에 따른 발효기간별 아미그달린을 분석한 결과 상기 표 2에 나타낸 바와 같이 발효가 진행 될수록 아미그달린의 함량은 감소하는 것으로 확인되었다.

특히 20% 설탕이 함유된 아로니아 발효액의 경우 발효 초기 40.99±3.34 mg/100g으로 다소 높은 함량을 보였으나, 이는 아로니아 함량이 가장 많이 함유되어 높은 것으로 판단된다.

발효 12주차에는 10.64±2.02 mg/100g으로 약 25% 감소하여 다른 35 및 50% 설탕 함유 아로니아 발효액보다 아미그달린 함량이 크게 감소한 것으로 확인되었다.

20% 설탕이 함유된 아로니아 발효액의 경우 pH와 산도 및 미생물 균수 분석을 비교하였을 때 가장 발효가 잘 진행된 것으로 확인되어 아미그달린도 발효 상태에 가장 좋은 20% 설탕이 함유된 아로니아 발효액이 발효가 진행됨에 따라 큰 폭으로 감소한 것으로 보인다.

[ 아로니아 발효액의 페놀성 화합물 성분 분석 ]

아로니아 발효액의 페놀성 화합물의 함량의 변화를 분석하기 위해 아로니아 발효액을 동결건조 분말을 HPLC(Thermo Dionex)로 분석하였다.

분석은 시료 10 μL를 column(Ino C-18, 250×4.6 mm, ID 5 μm, Youngjin Biochrom, Gyeonggi, Korea)에 주입하고 DAD 검출기를 이용하여 검출하였으며, 이때 이동상 조건으로 acetonitrile과 0.1% Trifluoroacetic acid 함유물을 1.0 mL/min의 유속으로 이동시켜 분석하였다.

분석온도와 column oven 온도는 40℃, 검출파장은 UV 360 nm에서 측정하였다.

설탕 함량별 아로니아 발효액의 페놀성 화합물 분석은 Galic acid, Chlorogenic acid, Caffeic acid, Rutin, Quercetin 5종을 분석하였다.

도 3은 발효기간에 따른 설탕 함량 20% 아로니아 발효액의 페놀성 화합물 분석 그래프로서, 설탕 함량 20% 아로니아 발효액의 경우 Galic aicd는 발효기간 모두 검출되지 않았으며, Chlorogenic acid은 발효 초기 1,127.04±14.45 mg/kg에서 발효 후기 150.42±2.55 mg/kg으로 확인되었다. Rutin의 경우 발효 초기 71.77±3.08 mg/kg에서 발효 후기 검출되지 않아 두 페놀성 화합물은 발효가 진행될수록 감소하는 경향을 나타내었다.

또한 Caffeic acid 및 Quercetin은 각각 발효 초기 13.62±0.47 mg/kg 및 10.80±0.42 mg/kg에서 발효 후기 540.30±45.49 mg/kg 및 247.37±53.00 mg/kg으로 발효가 진행될수록 증가하는 경향을 나타내었다.

도 4는 발효기간에 따른 설탕 함량 35% 아로니아 발효액의 페놀성 화합물 분석 그래프로서, 설탕 함량 35% 아로니아 발효액의 경우 Galic aicd는 발효기간 모두 검출되지 않았으며, Chlorogenic acid은 발효 초기 613.24±13.18 mg/kg에서 발효 후기 138.08±0.92 mg/kg으로 확인되었다. Rutin의 경우 발효 초기 39.92±0.41 mg/kg에서 발효 후기 검출되지 않아 두 페놀성 화합물은 발효가 진행될수록 감소하는 경향을 나타내었다.

또한 Caffeic acid 및 Quercetin은 각각 발효 초기 7.32±1.07 mg/kg 및 4.88±0.49 mg/kg에서 발효 후기 231.36±0.47 mg/kg 및 94.64±4.31 mg/kg으로 발효가 진행될수록 증가하는 경향을 나타내었다.

도 5는 발효기간에 따른 설탕 함량 50% 아로니아 발효액의 페놀성 화합물 분석 그래프로서, 설탕 함량 50% 아로니아 발효액의 경우 Galic aicd는 발효기간 모두 검출되지 않았으며, Chlorogenic acid은 발효 초기 355.79±5.90 mg/kg에서 8주차에 190.34±1.07 mg/kg으로 감소하다 12주차에는 247.37±1.25 mg/kg으로 다시 증가하는 경향이 확인되었다. Rutin의 경우 발효 초기 27.75±1.17 mg/kg에서 8주차에 12.46±0.09 mg/kg으로 감소하다 12주차에 24.09±0.78 mg/kg으로 증가하였다.

또한 Caffeic acid 및 Quercetin은 각각 발효 초기 3.91±1.95 mg/kg 및 4.44±2.80 mg/kg에서 발효 후기 93.07±8.69 mg/kg 및 49.29±5.81 mg/kg으로 발효가 진행될수록 증가하는 경향을 나타내었다.

설탕 함량 50% 아로니아 발효액의 경우 설탕 함량이 높아 페놀성화합물이 다소 적게 검출되었다.

[ 아로니아 발효액에서 탄닌 저감화 균주 발굴 ]

1. 아로니아 발효액에서 미생물 분리

각 농도별 아로니아 발효액에서 탄닌 저감화 미생물을 분리하기 위해 아로니아 발효액의 시료는 산도가 가장 높고 효모의 균수가 가장 높은 설탕 20% 농도의 아로니아 발효액을 선정하였다.

선정된 아로니아 발효액의 발효기간에 따라 효모를 각 20균주씩 분리하였다.

효모는 Yeast Extract-Peptone-Dextrose agar (Difco Laboratories Inc, Detroit, MI, USA)를 이용하여 37 ℃에서 48시간 배양하여 총 83 균주를 분리하였다.

2. 분리된 미생물의 탄닌 저감화 균주 분석

아로니아 발효액에서 분리된 미생물에 대한 탄닌 저감화 균주를 선별하기 위해 1차 균주 선별로 esculin agar법을 응용하여 β-glucosidase활성을 가지는 효모를 선별하였다.

Esculin agar는 효모 균주는 YM 배지에 0.1% esculin과 0.05% ferric ammonium citrate를 첨가하여 분석하였다.

두 배지에 순수 분리된 각각의 균주를 접종하여 black zone을 형성하는 균주를 선별하였다. 효모의 경우 총 83 균주 모두 black zone으로 확인되었다.

3. 탄닌 분해 균주 미생물의 동정 : 16S rRNA

아로니아 발효액으로부터 분리된 효모의 탄닌 저감화 후보 효모 20균주에 대해 미생물 동정을 실시하였다.

미생물 동정은 16s ribosomal RNA 염기서열 분석으로 하였으며, 분석은 ㈜솔젠트에 의뢰하였다. PCR 및 sequencer는 각각 ABI 9700 PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)과 ABI 3730 XL DNA analyzer (Applied Biosystem)가 사용되었다. 분석된 미생물의 16s rRNA 염기서열은 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool을 이용하여 동정 결과 값을 나타내었다.

분리된 효모의 동정결과 20균주 중 6균주는 Saccharomyces cerevisiae, 2균주는 Hanseniaspora uvarum, 11균주는 Wickerhamomyces anomalus, 1균주는 Lachancea fermentati으로 확인되었다.(도 6)

위에서 분리 및 동정된 결과를 토대로 효모 5균주를 선정하여 아로니아 추출물의 탄닌 성분 저감화를 분석하였다.

4. 미생물을 이용한 아로니아 추출물의 탄닌 성분 저감화 분석(카테킨)

선정된 효모 각 5종에 대해 탄닌 성분 저감화 효능을 HPLC를 이용하여 분석하였다.

효모는 YM 배지를 이용하여 각 배지에 아로니아 착즙액 5%, 효모 배양액 3%를 접종하여 30℃에서 135 rpm으로 3일간 배양하여 탄닌(카테킨) 성분을 분석하였다.

catechins의 함량은 Han SK 등(2010)의 방법을 응용하여 분석하였다. catechins는 (Sigma-Aldrich Chemical Co.) ACQUITY UPLC H-Class (Waters Corp., Milford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다.

실험용액은 각각의 아로니아 발효액 동결건조 분말 1 g에 70% 메탄올 10 mL로 녹인 용액을 0.45 μm syringe filter로 여과하여 분석에 사용하였다.

시료 10 μL를 column(Shiseido capcellpak C18 UG, 250 × 4.6 ㎜, ID 5 ㎛)에 주입하고 PDA 검출기를 이용하여 검출하였으며, 이때 이동상 조건으로 acetonitrile과 0.05% H₃PO₄ 함유물을 1.0 mL/min의 유속으로 이동시켜 분석하였다. 검출파장은 UV 280 nm에서 측정하였다.

탄닌 저감화 균주를 선별하기 위해 효모 분리균주의 탄닌 중 카테킨 함량을 분석한 결과 도 7에 도시된 바와 같이, 분리된 균주 5종 모두 control보다 낮은 함량을 나타내었다. control은 YM 배지에 아로니아 착즙액 5%를 첨가한 군으로 균주는 접종하지 않은 그룹이다. control의 경우 카테킨의 함량이 89.43 ppm으로 확인되었으며, AY201401은 11.20 ppm, AY201404는 14.77 ppm, AY201409은 10.41 ppm, AY202101은 10.00 ppm, AY202106은 17.44 ppm으로 확인되었다.

따라서 효모 분리균주 중 가장 낮은 카테킨 함량을 나타낸 AY202101 균주가 탄닌 중 카테킨 저감화 균주로 선별되었다. AY202101 균주의 동정 결과 Wickerhamomyces anomalus 균주로 확인되었다. 최종 탄닌 저감화 균주로 선정된 Wickerhamomyces anomalus AY202101 균주는 2020년 06월 17일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하여 수탁번호 KCTC18829P를 부여받았다.

< 아로니아 발효액의 떪은 맛 관능평가 >

아로니아 발효액의 떫은 맛을 조사하기 위해 관능평가를 실시하였다. 관능평가는 아로니아의 맛에 익숙한 베리앤바이오식품연구소 직원 10명을 대상으로 9점 만점으로 평가하도록 하였다.

설탕 함량별 아로니아 발효액의 관능평가를 위해 12주차의 아로니아 발효액으로 관능평가를 실시하였다. 설탕 함량 20%, 35%, 50%의 발효액으로 색, 발효취, 단맛, 떫은맛, 신맛은 강할수록 높은 점수를 주었으며, 전체적인 기호도는 시험자의 선호도로 점수를 책정하였다.(표 3)

설탕 함량에 따른 아로니아 발효액의 관능평가

	색	발효취	맛			전체적인 기호도
	색	발효취	단맛	떫은맛	신맛	전체적인 기호도
20%	5.9±2.7	7.7±1.8	4.2±1.6	6.9±1.9	5.8±2.3	3.8±1.1
35%	6.7±2.0	6.7±0.8	6.8±1.3	5.6±2.0	4.6±1.7	6.4±1.5
50%	7.2±0.6	5.1±1.4	8.2±1.1	3.4±1.6	3.0±1.8	6.9±1.1

아로니아 발효액의 관능평가 결과 색의 경우 설탕 함량이 가장 적은 20%가 색이 가장 연한 것으로 확인되었으며, 설탕 농도가 높을수록 색은 진한 것으로 확인되었다.

발효취의 경우 20% 설탕 함량 아로니아 발효액이 가장 높은 발효취를 나타내었다. 맛의 경우 단맛은 설탕이 가장 많이 함유된 50%에서 가장 높다고 하였으며, 떫은 맛 및 신맛은 설탕 20% 함유 아로니아 발효액이 가장 높은 것으로 확인되었다.

따라서 전체적인 기호도는 설탕이 많이 함유된 50% 설탕 아로니아 발효액을 선호하는 것으로 확인되었다.

50% 설탕 함유 아로니아 발효액의 발효기간별 관능평가

	색	발효취	맛			전체적인 기호도
	색	발효취	단맛	떫은맛	신맛	전체적인 기호도
아로니아 착즙액	4.6±1.2	2.6±1.6	2.4±1.3	5.5±3.3	5.4±2.7	2.4±1.5
50%-0일차	7.9±1.1	3.5±2.1	6.6±1.1	4.3±2.1	3.6±2.3	5.9±2.3
50%-4주차	8.4±0.5	4.9±2.2	7.0±1.5	5.6±1.8	3.3±1.7	6.3±1.2
50%-8주차	7.5±0.8	7.0±1.5	7.0±1.5	5.1±1.6	3.9±1.7	7.0±0.9
50%-12주차	6.6±1.5	6.1±1.5	6.0±1.4	4.6±1.5	4.3±2.2	6.6±1.2

상기 설탕 함량에 따른 아로니아 발효액의 관능평가 결과 50% 설탕이 함유된 아로니아 발효액의 선호도가 가장 높은 것으로 확인되어 발효기간에 따른 관능평가를 실시하였다. 표 4에서 제시하고 있는 바와 같이, 색의 경우 발효 4주차가 가장 높았으며, 발효취는 발효 8주차가 가장 높았다.

맛의 경우 단맛은 발효 4 및 8주차가 비슷한 수준으로 확인되었으며, 떫은 맛은 발효 4주차, 신맛은 비슷한 수준으로 확인되었다. 전체적인 기호도의 경우 발효 8주차의 아로니아 발효액을 가장 선호하는 것으로 확인되었다.

본 발명에 따른 아로니아와 설탕을 이용한 발효액으로부터 분리한 효모 균주를 이용하여 아로니아 탄닌 저감화를 이룸으로써, 아로니아의 떫은 맛의 저감화를 효과적으로 이룰 수 있어 산업상 이용가능성이 크다.

한국생명공학연구원 생물자원센터

KCTC18829P

20200617

<110> BERRY&BIOFOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Decreasing methods of tannins in Aronia extract using Wickerhamomyces anomalus from Aronia fermentation composition <130> 2020-p-164 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 563 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Wickerhamomyces anomalus AY202101 <400> 1 cgcggcgata aaccttacac acattgtcta gtttttttga actttgcttt gggtgcatca 60 gcctagctgc gtgcccaaag gtctaaacac atttttttta atgttaaaac ctttaaccaa 120 tagtcatgaa aatttttaac aaaaattaaa atcttcaaaa ctttcaacaa cggatctctt 180 ggttctcgca acgatgaaga acgcagcgaa atgcgatacg tattgtgaat tgcagatttt 240 cgtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcaccctctg gtattccaga gggtatgcct 300 gtttgagcgt catttctctc tcaaaccttc gggtttggta ttgagtgata ctctgtcaag 360 ggttaacttg aaatattgac ttagcaagag tgtactaata agcagtcttt ctgaaataat 420 gtattaggtt cttccaactc gttatatcag ctaggcaggt ttagaagtat tttaggctcg 480 gcttaacaac aataaactaa aagtttgacc tcaaatcagg taggactacc cgctgaactt 540 aagcatatca ataagccgga gga 563

Claims

아로니아 발효액으로부터 순수 분리, 동정하는 것으로서, 기탁번호 KCTC 18829P로 기탁된 위커하모마이세스 아노말루스(Wickerhamomyces anomalus) AY202101 균주.
기탁번호 KCTC 18829P로 기탁된 위커하모마이세스 아노말루스(Wickerhamomyces anomalus) AY202101 균주를 아로니아 발효액으로부터 순수 분리, 동정하는 단계와,
아로니아 착즙액에 상기 분리 동정한 위커하모마이세스 아노말루스(Wickerhamomyces anomalus) AY202101 균주 배양액을 접종한 후 29~31 ℃에서 125~145 rpm으로 2~4 일간 배양하여 아로니아의 탄닌을 저감시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아로니아 발효액으로부터 분리된 위커하모마이세스 아노말루스 균주를 이용하여 아로니아 탄닌을 저감처리하는 방법.
청구항 2에 있어서,
아로니아 발효액은 아로니아를 수확한 후 꼭지 및 줄기를 제거하여 아로니아와 설탕을 80:20, 65:35 또는 50:50의 중량비율이 되도록 혼합하여 23~26 ℃에서 1~2주간 발효시킨 것을 특징으로 하는 아로니아 발효액으로부터 분리된 위커하모마이세스 아노말루스 균주를 이용하여 아로니아 탄닌을 저감처리하는 방법.
청구항 2에 있어서,
아로니아 착즙액과 균주 배양액의 배합비는 1.5~2.0 : 1 중량비를 이루는 것을 특징으로 하는 아로니아 발효액으로부터 분리된 위커하모마이세스 아노말루스 균주를 이용하여 아로니아 탄닌을 저감처리하는 방법.