KR102122058B1

KR102122058B1 - 아로니아에서 분리한 토종효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae GBY5), 이의 분리방법, 상기 균주를 이용한 오디발효주 및 발효 식초 제조방법

Info

Publication number: KR102122058B1
Application number: KR1020180172784A
Authority: KR
Inventors: 권지웅; 류은혜; 채규서; 조성욱
Original assignee: 고창군
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2020-06-26

Abstract

본 발명은 아로니아에서 분리한 토종효모 Saccharomyces cerevisiae GBY5와, 이의 분리방법, 상기 분리된 토종효모를 이용한 오디발효주 및 발효 식초 제조방법에 관한 것으로서,
시판효모인 Fermivin과 유사한 발효 특성을 나타내기 때문에 수입 시판건조효모인 Fermivin을 대체할 수 있는 토종 효모를 제공하고, 상기 토종 효모인 S. cerevisiae GBY5가 Fermivin에 비하여 우수한 적색도 및 폴리페놀 함량을 나타냄에 따라 심미적 뿐만 아니라 기능적인 측면에서도 경쟁력 있는 효모로서 기능성 오디발효주 및 발효식초를 제공할 수 있다.

Description

아로니아에서 분리한 토종효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae GBY5), 이의 분리방법, 상기 균주를 이용한 오디발효주 및 발효 식초 제조방법{Saccharomyces cerevisiae GBY5 isolated from Aronia, Isolating method thereof, Method for production of mulberry wine and vinegar using the strin}

본 발명은 아로니아에서 분리한 토종효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae GBY5)와, 이의 분리방법, 상기 분리된 토종효모를 이용한 오디발효주 및 발효 식초 제조방법에 관한 것으로서,

시판 건조효모인 Fermivin과 유사한 발효 특성을 나타내기 때문에 수입 효모인 Fermivin을 대체할 수 있는 토종 효모를 제공할 수 있다는 장점과, 상기 토종 효모인 S. cerevisiae GBY5가 Fermivin에 비하여 우수한 적색도 및 폴리페놀 함량을 나타냄에 따라 심미적 뿐만 아니라 기능적인 측면에서도 경쟁력 있는 효모로서 기능성 오디발효주 및 발효식초를 제공할 수 있다는 장점을 갖는다.

경제성장에 따른 생활수준의 향상 및 여성의 사회진출로 인하여 와인 시장의 저변이 확대됨에 따라 와인이 대중화 되고 있으며 소비량이 더욱 증가하는 추세이다.

또한 가볍게 술을 즐기는 사회 분위기 확산과 건강을 중요시하는 소비자들이 증가함에 따라 알코올 도수가 높은 주류보다 저 알코올 주류의 선호도가 증가하고 있다(Kim KI & Kim ML 2010).

와인은 발효주로서 포도뿐만 아니라 다양한 과실이나 열매의 과즙을 알코올 발효 시킨 것으로서 발효과정을 통하여 풍미가 증진되고, 과실이 지니고 있는 기능성 고분자물질들이 저분자물질로 전환됨에 따라 생리활성이 증가하게 된다(Son WR & Choi SW 2013).

이와 같은 과실 발효주에서는 원료의 특성이 품질에 가장 큰 영향을 미치기 때문에 복분자, 블루베리 및 자두와 같은 기능성 과실을 이용한 와인의 시장성이 주목 받고 있으며, 제품개발 또한 활발하게 이루어져왔다(Son WR & Choi SW 2013).

그러나 와인 고유의 풍미 및 기호성 향상 등은 발효를 통해 이루어지며, 발효 미생물에 따라 차이가 발생하게 된다. 이처럼 발효에 이용되는 미생물이 와인 생산에서 중요한 위치를 차지하고 있지만, 머루 발효주(Kim EJ 등 2007), 오디 발효주(Chae KS등 2014), 블루베리 발효주(Yoon HH 등 2015a), 및 복분자 발효주(Yoon HH 등 2015b) 등과 같이 대부분의 발효주 연구에서 사용되는 효모는 다른 효모에 비하여 많은 알코올을 생산하는 것으로 알려진 Saccharomyces cerevisiae 균주가 대부분을 차지하고 있다(Choi HS 등 2006). 이와 같이 과실 발효주가 경쟁력을 가지기 위해서는 원재료의 다양화뿐만 아니라 새로운 효모 개발을 통해 발효주에 다양한 풍미를 부여하고 품질 향상에 대한 연구가 필요한 실정이다.

오디는 뽕나무과(Moraceae) 뽕나무속(Morus)에 속하는 교목성 낙엽수인 뽕나무의 열매로서 검은색 또는 자홍색을 띄고 온대와 열대 지방에 주로 분포하며(Park SW 등 1997), 복분자와 더불어 국내에서 재배역사가 가장 오래된 베리류로 분류된다(Ju MJ 등 2009).

오디는 노화 및 콜레스테롤 억제(Du Q 등 2008), 항산화, 항염증 및 시력개선 효과(Choi SW 2005), 당뇨병(Kim TW 등 1996) 등에 효과를 나타내는 안토시아닌 계통의 색소 및 플라보노이드를 다량 함유한 기능성 신소재로서 최근 주목 받고 있다(Kim TK 등 2003).

하지만 오디는 과육이 약하여 상처 입거나 무르기 쉬울 뿐만 아니라 수분함량이 높아 저장성이 낮으므로 일부만이 생과로 유통되고, 나머지는 냉동 유통되거나 음료나 잼, 젤리, 술 등으로 가공되어 유통되고 있다(Park SW 등 1997).

오디의 경우 당도는 발효주 생산을 위해서는 부족하나 오디가 갖고 있는 고유의 강한 색상과 향은 당의 첨가에 의해 희석되지 않기 때문에 발효주 생산을 위한 과실로 적절하며 특성 있는 술로써 개발이 가능하다(Park SW 등 1997).

따라서 본 연구에서는 아로니아로부터 분리된 토종효모인 S. cerevisiae GBY5와 대조군으로 상업적으로 주류 제조에 많이 사용되고 있는 S. cerevisiae Fermivin을 이용한 발효주를 제조하여 발효특성을 비교하고 항산화 활성 분석을 통해 새로운 토종 효모를 이용한 기능성 오디 발효주의 개발 가능성에 대해 조사하였다.

대한민국 공개특허특1996-0041346(공개일자 1996.12.19) 대한민국 등록특허 10-1413101(등록일자 2014.06.23)

본 발명은 시판효모인 Fermivin과 유사한 발효 특성을 나타내기 때문에 수입 시판 건조효모인 Fermivin을 대체할 수 있는, 아로니아에서 분리한 토종효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae GBY5)를 제공함으로써, 상기 Fermivin에 비하여 우수한 적색도 및 폴리페놀 함량을 나타내는 상기 토종효모를 통해 심미적 측면 외에 기능적인 측면에서도 경쟁력 있는 기능성 오디발효주 및 발효식초를 제공하고자 하는 것을 발명의 목적으로 한다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 아로니아로부터 순수 분리, 동정된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae GBY5)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여,

도 1에 도시된 바와 같이, 아로니아를 25 ℃에서 3 ~ 7 일간 발효한 후 멸균 거즈로 분리하여 아로니아 여과액을 제조하는 단계(S10)와,

멸균식염수를 이용한 10배 희석법으로 상기 아로니아 여과액을 희석하여 아로니아 여과희석액을 제조하는 단계(S20)와,

YPD 고체배지에 상기 아로니아 여과희석액을 도말하고 23 ~ 27 ℃에서 48 ~ 72 시간 동안 배양하여 아로니아 배양액을 제조하는 단계(S30)와,

상기 아로니아 배양액으로부터 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae GBY5)를 순수 분리하는 단계(S40)를 포함하여 이루어지는, Saccharomyces cerevisiae GBY5 분리방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여,

도 2에 도시된 바와 같이, 오디 분쇄한 후 설탕을 이용하여 25 ~ 27°Brix가 되도록 보당하는 단계(S10')와,

보당 과정을 거친 오디에 상기 Saccharomyces cerevisiae GBY5를 1.0 ~ 5.0×10⁹ CFU/kg이 되도록 접종하는 단계(S20')와,

상기 Saccharomyces cerevisiae GBY5를 접종한 오디를 교반하고 23 ~ 27 ℃에서 5 ~ 8 일 동안 발효시켜 오디 발효주를 제조하는 단계(S30')와,

상기 오디 발효주를 유압착즙기로 착즙하여 -3 ~ -8 ℃에서 1 ~ 3 일 동안 냉동 보관한 후, 포어 사이즈(pore size) 1.2 ㎛인 멤브레인 필터(membrane filter)를 사용하여 여과하는 단계(S40')를 포함하여 이루어지는, 오디발효주 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 오디에 접종되는 Saccharomyces cerevisiae GBY5 초기균수는 발효에 영향을 미치기 때문에 상기 제시된 범위 내에서 접종하는 것이 바람직하다.

그리고 상기 발효기간은 알코올 함량의 변화가 없는 시점까지로 상기 제시된 범위 내에서 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여,

도 3에 도시된 바와 같이, 상기 오디발효주 제조방법으로 제조된 오디발효주를 알코올 함량 5 ~ 7 %로 희석하는 단계(S10")와,

알코올 함량 5 ~ 7 %가 되도록 증류수로 희석한 오디발효주의 초기산도를 1.5 ~ 2.5 %로 조정하는 단계(S20")와,

상기 초기산도를 1.5 ~ 2.5 %로 조정한 오디발효주에 초산균주 Acetobacter pasteurianus KACC 13994를 5 ~ 20% (v/v)를 접종하는 단계(S30")와,

초산균주를 접종한 오디발효주를 28 ~ 33 ℃에서 17 ~ 23 일간 정치배양하는 단계(S40")를 포함하여 이루어지는, 발효식초 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 초기산도는 2.0 %로 조정하는 것이 초산발효에 있어 바람직하며, 초기산도의 조정은 사과 2배식초를 이용하여 조정한다.

또한 배양온도는 초산균주가 잘 생육하는 온도범위를 정한 것으로서, 더욱 바람직하게는 30 ℃이다. 그리고 배양기간은 초산발효 후 식초의 초산 함량이 4 % 이상이 되어 초산함량 변화가 더 이상 없는 발효종료시점까지이다.

본 발명은 시판효모인 Fermivin과 유사한 발효 특성을 나타내기 때문에 수입 시판건조효모인 Fermivin의 대체기능을 갖는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae GBY5)를 제공하고, 상기 토종 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae GBY5)가 시판효모인 Fermivin에 비하여 우수한 적색도 및 폴리페놀 함량을 나타냄에 따라 심미적 측면 뿐만 아니라 기능적인 측면에서도 높은 경쟁력을 갖는 기능성 오디발효주 및 발효식초를 제공하는 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae GBY5 분리방법에 따른 순서도.
도 2는 본 발명의 오디발효주 제조방법에 따른 순서도.
도 3은 본 발명의 발효식초 제조방법에 따른 순서도.
도 4는 S. cerevisiae GBY5와 S. cerevisiae Fermivin을 이용한 오디 발효주의 알코올 함량 및 당도의 변화를 나타낸 그래프.
도 5는 S. cerevisiae GBY5와 S. cerevisiae Fermivin을 이용한 오디 발효주의 pH 및 총산도의 변화를 나타낸 그래프.
도 6은 Acetobacter pasteurianus KACC 13994를 이용한 오디 발효주의 초산 발효 특성을 나타낸 그래프.

본 발명은 아로니아로부터 분리된 Saccharomyces cerevisiae GBY5(수탁번호 KCCM12271P)를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 Saccharomyces cerevisiae GBY5(수탁번호 KCCM12271P)의 분리방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 Saccharomyces cerevisiae GBY5(수탁번호 KCCM12271P)를 이용한 오디발효주 및 발효 식초 제조방법을 제공한다.

본 발명자들은 상기 분리 및 동정된 균주를 2018년 05월 31일자로 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12271P를 부여받았다.

이하, 본 발명에 따른 구체적인 기술내용에 대해 살펴보도록 한다.

[ 균주 분리 및 오디 발효주 제조 ]

1. 실험재료

본 실험에 사용된 오디는 전라북도 고창군에서 2018년에 수확한 것을 구입하여 -40 ℃에서 냉동 보관하여 사용하였다.

2. 사용균주의 분리 및 동정

전라북도 고창군 농가에서 구입한 아로니아를 25 ℃에서 7 일간 발효 한 후 멸균거즈로 여과한 액을 균주 분리를 위한 시료로 사용하였다.

시료를 10배 희석법으로 희석한 후 YPD(bacto yeast extract 1%(w/v), bacto peptone 2%(w/v), dextrose 2%(w/v) 고체배지(Difco, Spark, MD, USA)에 도말하고 25 ℃에서 48 시간 배양하여 단일집락을 분리하였다.

YPD 고체배지에 계대 배양하여 순수 분리된 균주는 sequencing 전문 기관인 ㈜마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 18S rRNA의 염기서열을 분석한 후 National Center for Biotechnology information(NCBI, RP, Bethesda, MD, USA)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)프로그램을 사용하여 균주를 동정하였다.

3. 균주의 배양

오디의 발효를 위해 사용한 토종효모는 YPD(Difco) 액체배지를 이용하여 25 ℃에서 48 시간 동안 진탕 배양기(VS-8480, Vision Scientific Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 배양한 후 10,000×g에서 10 분간 원심분리하여 얻은 균체를 멸균수로 2회 세척한 후 사용하였다.

또한 실험의 대조구로 수입 시판건조효모 Saccharomyces cerevisiae Fermivin(DSM Food Specialties, B.V., Delft, netherlands)를 구입하여 15 % 설탕용액에 20 ℃에서 10 분간 배양한 후 활성화시켜 발효에 사용하였다.

4. 오디 발효주의 제조

오디 10 kg을 으깬 뒤 시판 백설탕을 이용하여 25°Brix가 되도록 보당한 후 토종효모 및 시판효모를 1×10⁹ CFU/kg이 되도록 접종하여 교반하고 25 ℃에서 6 일 동안 발효시켰다.

발효가 완료된 오디 발효주는 유압착즙기(Stainless 70 L, tomotech Ltd., Seoul, Korea)를 사용하여 착즙하고 -5 ℃에서 2 일 동안 냉동 보관하여 pore size 1.2 μm membrane filter(RAWP14250, Merck Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하여 여과하였다.

5. 발효특성

알코올 함량은 알코올 분석기 세트(Alcoholyzer wine, Anton Paar, Graz, Austria)를 이용하여 측정하였으며, 당도는 상온에서 당도계(PAL-1 Pocket Refractometer, ATAGO, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.

pH는 pH meter(S20, Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switzerland)로 측정하였고, 총산도는 AOAC(1990) 방법에 의해 오디 발효주 10 mL를 pH 8.3까지 도달하는데 필요한 0.1 N NaOH 용액의 소비량(mL)으로 정의하고 citric acid(%, w/w)함량으로 환산하여 나타내었다.

또한 색도는 분광색차계(CM-5, Minolta, Osaka, Japan)를 사용하여 Hunter L값(명도, lightess), a값(적색도, redness) 및 b값(황색도, yellowness)을 3회 반복하여 측정하여 평균값으로 나타내었다.

6. 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 안토시아닌 함량

총 폴리페놀 함량은 건강기능식품공전 방법(KFDA 2012)을 응용하여 측정하였다.

즉 시료 1 mL에 증류수 7.5 mL와 Folin-Ciocalteau’s phenol regent(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.5 mL, 35% Na₂CO₃(Sigma-Aldrich) 1 mL를 첨가하고, 실온 암조건에서 1시간 동안 정치한 후, UV/VIS spectrophotometer(UV-2450, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 사용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때 표준검량곡선은 tannin acid(Sigma-Aldrich)를 사용하여 작성하고 이로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다. 총 플라보노이드 함량은 Chang CC 등(2002)의 방법을 응용하여 측정하였다.

시료 200 μg/mL 농도로 제조한 용액에 diethylene glycol 2 mL, 1 N-NaOH 20 μL를 순서대로 첨가하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후 UV/VIS spectrophotometer를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 함량은 rutin(Sigma-Aldrich)을 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.

총 안토시아닌 함량은 Kim YD 등(1998)의 방법을 응용하여, 각각의 시료 10 mL에 0.1 % HCl을 함유하는 80% 메탄올 용액 40 mL로 24 시간 동안 진탕배양기(Vision Scientific)에서 추출한 후 UV/VIS spectrophotometer를 사용하여 528 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때 표준물질은 cyanidin을 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 안토시아닌 함량을 구하였다.

7. DPPH 라디칼 소거활성

DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능은 Choi JS 등 (1993)의 방법을 응용하여, 5, 10, 15, 25, 35, 50 μL/mL 농도로 조제한 각각의 추출물 100 μL에 에탄올 200 μL를 가하고 0.2 mM DPPH 용액(Sigma-Aldrich) 300 μL를 가한 후 볼텍스 믹서(VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Gangwon, Korea)로 교반하여 실온에서 30분간 반응시키고 ELISA reader(Synergy HT, Biotec, Washington DC, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조구는 에탄올만을 첨가하여 분석하였다.

8. ABTS 라디칼 소거활성

ABTS(2-2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt) 라디칼 소거능은 Art MJTJ 등(2004)의 방법을 응용하여 농도별로 조제한 각각의 시료 5 μL에 ABTS radical 용액 195 μL를 첨가하여 7 분간 반응시킨 후 ELISA reader(Biotec)를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였고, 대조구는 시료 대신에 에탄올을 첨가하였다.

9. 통계처리

본 연구의 각 시험항목별 실험결과는 3회 반복하여 분석하였으며, SPSS program 23.0(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계처리 후 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 시험군 간의 통계적 유의성 검증은 Student’s t-test를 실시하였으며, 유의성은 p<0.05 수준에서 검증하였다.

[ 균주 분리 및 오디 발효주 제조 결과 및 고찰 ]

1. 균주분리 및 동정

아로니아로부터 분리된 균주의 동정은 18S rRNA의 염기서열을 분석한 후 NCBI의 BLAST 분석프로그램을 이용한 상동성 분석 결과 Saccharomyces cerevisiae와 98% 이상의 상동성을 나타내었으며, 따라서 이 균주를 S. cerevisiae GBY5(KCCM12271P)로 명명하였다.

2. 알코올 함량과 당도

아로니아로부터 분리된 토종 S. cerevisiae GBY5와 수입 시판건조효모 Fermivin을 이용하여 오디 발효주를 제조하였고 0일부터 6일까지의 발효 기간에 따른 알코올 함량 및 당도의 변화를 도 4에 나타내었다.

S. cerevisiae GBY5의 경우 발효 1일째부터 알코올 생성량이 급격하게 증가한 후 4일째에 알코올 함량이 정지하여 발효 완료 후 최종 알코올 함량이 13.33±0.02%로 나타났으며, 대조군으로 사용된 Fermivin 또한 S. cerevisiae GBY5와 유사한 발효 양상을 나타내어 발효 완료 후 최종 알코올 함량이 13.24±0.02%까지 증가하였다.

효모에 의한 발효 유무를 판단하기 위한 지표로 당도 변화를 살펴본 결과 발효가 진행됨에 따라 S. cerevisiae GBY5와 Fermivin 모두 당도가 감소하여 최종 당도는 각각 8.93±0.06°Brix 및 9.23±0.55°Brix를 나타내었다.

이는 Chae KS 등(2014)의 연구와 유사한 결과로 S. cerevisiae B-8을 이용한 오디 발효에서 발효가 진행됨에 따라 당도는 감소하고 알코올 함량은 증가한다는 보고와 일치하였다. Kim YS 등(2008)에 따르면 오디 마쇄액을 24°Brix로 보당한 후 S. cerevisiae KCCM 12224로 26℃에서 8일 동안 발효 한 후 최종 알코올은 11.0±0.01 %로 본 실험 결과와 비교 시 S. cerevisiae GBY5가 발효기간이 2일이 더 짧음에도 불구하고 약 2% 높은 알코올 생성량을 나타내었다.

이는 균주에 의한 차이로 균주에 의해 생성되는 알코올 함량이 차이를 나타내는 것으로 판단되며, S. cerevisiae GBY5를 이용한 발효시 오디 발효액에 포함된 당은 효모의 영양원이나 발효 기질로 이용되면서 알코올로 전환됨에 따라 당도는 감소하고 알코올 함량은 증가하여 발효가 정상적으로 진행된 것으로 판단된다.

3. pH, 총산도 및 색도

오디 발효주의 pH와 총산도는 발효진행 상황을 판단할 수 있는 중요한 지표이며, 발효주의 품질에 중요한 영향을 미치는 요소이다. S. cerevisiae GBY5를 이용한 오디 발효주의 pH 및 총산의 변화를 측정한 결과는 도 5에 나타내었다.

S. cerevisiae GBY5로 발효한 오디 발효주의 경우 발효기간이 경과함에 따라 pH는 초기 4.41±0.07에서 서서히 감소하여 발효 종료 후 4.00±0.01로 감소하였으며, 총산도의 경우 발효초기 0.41±0.01%에서 발효가 진행됨에 따라 점차 증가하여 발효 종료 후 0.77±0.00%를 나타내었다. Fermivin을 이용한 발효의 경우 pH는 S. cerevisiae GBY5와 유사한 경향을 나타내어 발효 종료 후 4.03±0.01로 나타났으나, 총산도의 경우 발효 종료 후 0.81±0.00%로 S. cerevisiae GBY5에 비해 높게 나타났다. 이러한 결과는 Kim YS 등(2008)의 오디 마쇄액을 24°Brix로 보당한 후 S. cerevisiae KCCM 12224로 26℃에서 8일 동안 발효 한 후 pH 및 총산도는 각각 4.07±0.01, 0.83±0.02%으로 나타났다는 연구결과와 유사한 것으로 나타났다.

색도는 와인 품질평가의 중요 항목 중 하나로 폴리페놀 함량, 미생물 활성 및 SO2 등 여러 요인에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Lee JE 등 2002). 본 연구에서 S. cerevisiae GBY5로 발효한 오디 발효주의 색도를 측정한 결과를 표 1에 나타내었다.

S. cerevisiae GBY5와 S. cerevisiae Fermivin을 이용한 오디 발효주의 색도

균주명	색도
	명도(L)	적색도(a)	황색도(b)
S. cerevisiae Fermivin	30.68±0.01¹⁾	49.47±0.01	32.11±0.01
S. cerevisiae GBY5	28.59±0.00^*	49.73±0.00^*	32.53±0.01^*

¹⁾ 평균±표준편차

*p<0.05 S. cerevisiae GBY5는 S. cerevisiae Fermivin과 p<0.05 수준에서 유의적 차이가 있음

명도(L)의 경우 Fermivin이 30.68±0.01로 S. cerevisiae GBY5에 비해 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났으나, 황색도(b)의 경우 S. cerevisiae GBY5가 32.53±0.01로 Fermivin에 비해 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다. 오디 발효주에 있어 중요한 색소 인자인 적색도(a)는 S. cerevisiae GBY5가 49.73±0.00으로 Fermivin에 비해 유의적(p<0.05)으로 높은 값을 나타내어 더 붉은 색을 나타내었다.

4. 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 및 총 안토시아닌 함량

토종 S. cerevisiae GBY5와 수입 시판건조효모 Fermivin을 이용하여 제조한 오디 발효주의 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 안토시아닌 함량변화를 표 2에 나타내었다.

S. cerevisiae GBY5와 S. cerevisiae Fermivin을 이용한 오디 발효주의 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총 안토시아닌 함량

균주명	총 폴리페놀 (TAE¹⁾ mg/mL)	총 플라보노이드 (RUE²⁾ mg/mL)	총 안토시아닌 (CYE³⁾ mg/mL)
S. cerevisiae Fermivin	2.78±0.03⁴⁾	1.05±0.02	0.57±0.01
S. cerevisiae GBY5	2.92±0.01^*	1.11±0.08	0.57±0.01

¹⁾ 총 폴리페놀은 100g당 탄닌산 tannin acid (TAE) mg으로 표시함.

²⁾ 총 플라보노이드는 100g 당 루틴 rutin (RUE) mg으로 표시함.

³⁾ 총 안토시아니는은 100g당 시아니딘 cyanidin (CYE) mg으로 표시함

⁴⁾ 평균±표준편차

*p<0.05 S. cerevisiae GBY5는 S. cerevisiae Fermivin과 p<0.05 수준에서 유의적 차이가 있음.

항산화 활성의 간접적인 지표가 되는 것으로 알려진(Lee SY 등 2008, Kwak JH 등 2010) 총 폴리페놀 함량의 경우 S. cerevisiae GBY5가 2.92±0.01 TAE mg/mL로 Fermivin의 2.78±0.03 TAE mg/mL에 비해 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다. 활성산소종을 효과적으로 제거하는 항산화능이 높다고 알려진(Tsao R 2010) 총 플라보노이드 함량의 경우 S. cerevisiae GBY5가 1.11±0.08 RUE mg/mL, Fermivin은 1.05±0.02 RUE mg/mL로 나타났으나 유의적 차이(p<0.05)는 없는 것으로 나타났다.

또한 근래 노화억제와 시력 개선 효과 및 망막장애의 치료, 항산화 작용 등 다양한 생리 활성을 갖는 것으로 보고됨에 따라 인체에 무해한 천연 색소 및 기능성 소재로써 각광받고 있는(Kim HB 등 2003, Kang CS 등 2003, Park SW 등 1997) 총 안토시아닌 함량을 측정한 결과 역시 S. cerevisiae GBY5와 Fermivin이 0.57±0.01 CYE mg/mL로 두 종의 발효주간의 유의적 차이(p<0.05)는 발견되지 않았다.

이러한 결과는 Chae KS 등(2014)의 연구에서 S. cerevisiae B-8과 Fermivin으로 발효한 오디 발효주에서 총 폴리페놀 함량은 S. cerevisiae B-8가 1.97±0.01 GAE mg/mL로 Fermivin의 1.90±0.02 GAE mg/mL에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았으나, 총 플라보노이드 함량의 경우 두 종의 발효주간의 유의적 차이는 없었다는 보고와 유사한 결과를 나타내었다. Kim YS 등(2008)은 S. cerevisiae KCCM 12224 효모를 이용한 오디 와인의 발효 중 총 안토시아닌 함량이 감소하였는데, 이는 주로 cyanidin-3-glucoside(C-3-G)의 감소에 의한 영향이라고 보고하였다.

플라보노이드, 카테킨, 안토시아닌 등의 기능성 물질을 종합적으로 부르는 폴리페놀 성분은 체내에서 항산화 작용을 통하여 항암효과, 심혈관계 질환 예방, 노화방지 등(Kim HJ 등 2000)을 나타내므로 총 폴리페놀 함량이 높은 S. cerevisiae GBY5는 현재 양조 산업에 주로 이용되고 있는 시판효모인 Fermivin을 대체할 수 있는 효모로 오디 발효주 제조에 산업적으로 이용 가능할 것으로 판단된다.

5. DPPH 및 ABTS 리디칼 소거활성 변화

토종 S. cerevisiae GBY5와 수입 시판건조효모 Fermivin을 이용하여 제조한 오디 발효주의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성의 IC₅₀ 값을 측정한 결과를 표 3에 나타내었다.

S. cerevisiae GBY5와 S. cerevisiae Fermivin을 이용한 오디 발효주의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능 비교

균주명	DPPH 라디컬 소거 화성	ABTS 라디컬 소거 화성
균주명	(IC₅₀μL/mL)¹⁾
S. cerevisiae Fermivin	15.68±0.05²⁾	22.83±0.20
S. cerevisiae GBY5	16.80±0.03^*	22.45±0.15^*

¹⁾ 저해 활성은 농도 저해 곡선의 내삽에 의해 얻어지는 3반복 값의 50% 저해 농도의 평균으로 나타냄.

²⁾ 평균±표준편차

*p<0.05 S. cerevisiae GBY5는 S. cerevisiae Fermivin과 p<0.05 수준에서 유의적 차이가 있음.

S. cerevisiae GBY5와 Fermivin의 DPPH 라디칼 소거활성의 IC₅₀ 값은 각각 16.80±0.03 μL/mL, 15.68±0.05 μL/mL로 Fermivin의 DPPH 라디칼 소거활성이 S. cerevisiae GBY5보다 유의적(p<0.05)으로 높은 활성을 나타냈다.

반면에 S. cerevisiae GBY5와 Fermivin의 ABTS 라디칼 소거활성의 IC₅₀ 값을 측정한 결과 S. cerevisiae GBY5가 22.45±0.15 μL/mL로 Fermivin의 22.83±0.20 μL/mL보다 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다.

이는 S. cerevisiae GBY5가 양이온 라디칼인 ABTS에 잘 반응하는 항산화 물질이 많을 것으로 예상되며(Wang M 등 1999), Chae KS 등(2014)의 연구에서 S. cerevisiae B-8과 Fermivin으로 발효한 오디 발효주에서 토종효모인 S. cerevisiae B-8의 DPPH 라디칼 소거활성이 Fermivin 보다 낮은 활성을 나타내었으나, ABTS 라디칼 소거활성의 경우 S. cerevisiae B-8이 Fermivin보다 ABTS 라디칼 소거활성이 높게 나타나 본 연구결과와 유사한 것으로 나타났다.

본 발명에서는 발효주 제조를 위한 새로운 효모를 개발하고자 아로니아로부터 토종 효모를 분리 동정하고, 대조구로 시판효모 S. cerevisiae Fermivin과 발효특성 및 항산화 활성 비교를 통해 새로운 토종 효모를 이용한 오디 발효주의 개발 가능성을 확인하였다.

아로니아로부터 분리된 S. cerevisiae GBY5와 S. cerevisiae Fermivin을 이용하여 오디발효주를 제조하고 알코올함량, 당도, pH, 총산도 및 색도 등의 발효 특성을 분석한 결과, 두 균주 모두 발효 1일차부터 4일차까지 알코올 함량이 증가하여 약 13 %까지 증가하였으며, 당도는 발효가 진행됨에 따라 S. cerevisiae GBY5와 Fermivin 모두 당도가 감소하여 최종 당도는 각각 8.93±0.06°Brix 및 9.23±0.55°Brix를 나타내었다.

또한 두 균주 모두 발효에 의해 pH는 감소하고 총산도는 증가하는 경향을 나타내었으며, 발효주의 색도를 측정한 결과 Fermivin을 이용한 발효주에서 명도(L)가 30.68±0.01로 S. cerevisiae GBY5에 비해 높게 나타난 반면 황색도(b) 및 적색도(a)의 경우 S. cerevisiae GBY5가 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다.

발효주의 기능성 변화를 비교하기 위하여 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 안토시아닌 함량을 비교한 결과, 총 폴리페놀 함량에서 차이가 확인되었으며 S. cerevisiae GBY5를 이용한 발효주의 총 폴리페놀 함량이 2.92±0.01 TAE mg/mL로 Fermivin에 의한 발효주 2.78±0.03 TAE mg/mL 보다 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다. 또한 오디 발효주의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성의 IC₅₀ 값을 측정한 결과, DPPH 라디칼 소거활성의 경우 S. cerevisiae Fermivin이 GBY5보다 유의적(p<0.05)으로 높게 나타난 반면, ABTS 라디칼 소거활성의 경우 S. cerevisiae GBY5에서 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다.

이러한 결과를 종합해볼 때 아로니아로부터 분리된 S. cerevisiae GBY5 균주는 시판효모인 Fermivin과 유사한 발효 특성을 나타내기 때문에 수입 시판건조효모인 Fermivin을 대체할 수 있는 토종 효모로 기대된다. 또한 토종 효모인 S. cerevisiae GBY5가 Fermivin에 비하여 우수한 적색도 및 폴리페놀 함량을 나타냄에 따라 심미적 뿐만 아니라 기능적인 측면에서도 경쟁력 있는 효모로서 발효주 생산에 이용 가능할 것이라 판단된다.

[ 오디 발효주를 이용한 발효 식초 제조 ]

1. 실험재료

본 실험에 사용된 오디는 전라북도 고창군에서 2018년에 수확한 것을 구입하여 -40 ℃에서 냉동 보관하여 사용하였으며, 휴대용 블렌더(HMF-3260, Hanil Co., Seoul, Korea)를 이용하여 으깬 후 원료로 사용하였다.

2. 사용균주 및 배지조성

알코올 발효에 사용된 효모는 (재)베리앤바이오식품연구소에서 분리·동정한 Saccharomyces cerevisiae GBY5(KCCM12271P)를 사용하였고, YPD(bacto yeast extract 1 %(w/v), bacto peptone 2 %(w/v), dextrose 2 %(w/v) 액체배지(Difco, Spark, MD, USA)에서 25 ℃에서 48 시간 계대배양한 후 사용하였다. 초산 발효를 위한 초산균은 농촌진흥청에서 Acetobacter pasteurianus KACC 13994를 분양 받아 YPM배지(yeast extract 0.5%, peptone 0.3%, mannitol 2.5%)에서 30 ℃에서 24 시간 진탕배양한 후 사용하였다.

3. 알코올발효

오디 10 kg을 으깬 뒤 시판 백설탕을 이용하여 25°Brix가 되도록 보당한 후 효모를 1×10⁹ CFU/kg이 되도록 접종하여 교반하고 25 ℃에서 6 일 동안 발효시켰다. 발효가 완료된 오디 발효주는 유압착즙기(Stainless 70 L, tomotech Ltd., Seoul, Korea)를 사용하여 착즙하고 -5 ℃에서 2일 동안 냉동 보관하여 pore size 1.2 μm membrane filter(RAWP14250, Merck Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하여 여과하였다.

4. 초산발효

여과된 알코올 발효액을 알코올 함량 6 %로 희석한 후, 초기산도를 2 %로 조정한 후 초산균주 Acetobacter pasteurianus KACC 13994를 10 % (v/v)를 접종한 후 30 ℃에서 20 일간 정치배양하면서 품질특성을 확인하였다.

5. 발효특성

알코올 함량은 알코올 분석기 세트(Alcoholyzer wine, Anton Paar, Graz, Austria)를 이용하여 측정하였으며, 당도는 상온에서 당도계(PAL-1 Pocket Refractometer, ATAGO, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. pH는 pH meter(S20, Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switzerland)로 측정하였고, 총산도는 AOAC(1990) 방법에 의해 오디 발효주 및 식초 10 mL를 pH 8.3까지 도달하는데 필요한 0.1 N NaOH 용액의 소비량(mL)으로 정의하고 citric acid(%, w/w)함량 및 acetic acid(%, w/w)로 환산하여 나타내었다. 또한 색도는 분광색차계(CM-5, Minolta, Osaka, Japan)를 사용하여 Hunter L값(명도, lightess), a값(적색도, redness) 및 b값(황색도, yellowness)을 3회 반복하여 측정하여 평균값으로 나타내었다.

6. 유기산 함량 분석

유기산은 오디발효주 및 오디식초액을 0.45 μm membrane filter(Millipore, Bedford, MA, USA)로 여과한 후 희석하여 HPLC(Ultimate 3000, Dionex, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 이 때 표준물질은 젖산, 시트르산, 말산, 초산, 숙신산, 옥살산, 푸마르산(Sigma-Aldrich)을 사용하였으며, 컬럼은 Aminex HPX-87H(300×10 mm; Bio-Rad, Hercules, CA, USA), solvent는 0.01N H₂SO₄(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 분석조건으로 flow rate는 0.5 mL/min, UV 조건은 210 nm, injection volume은 10 μL였다(Sung JM 등 2008).

7. 유리당 함량 분석

유리당 분석을 위해 시료 5 g에 50 % 에탄올(Sigma-Aldrich) 용액을 가하여 85℃ 수조(Model 10-101, Dae Han Co., Seoul, Korea)에서 25분간 가온하여 추출하였다. 이를 12,000 ×g으로 10분간 원심분리한 후 membrane filter(0.45 μm)로 여과하여 HPLC(Dionex), RI detector(Shodex RI-101, Showa Denko, Tokyo, Japan)를 사용하여 분석하였으며, 기기의 오븐(Dionex)온도는 70℃로 유지하였다. 이 때 표준물질은 글루코스, 갈락토오스, 아라비노오스, 소르비톨, 자일로오스, 프룩토오스, 만노오스, 수크로스, 말토오스, 락토오스, 라피노오스, 스타키오스(Sigma-Aldrich)를 사용하였으며, 컬럼은 Sugar-pak column(300×6.5 mm; Waters, Milford, MA, USA), solvent는 3차 증류수를 0.5 mL/min의 속도로 흐르도록 하였으며, injection volume은 10 μL였다. 최종분석은 운영소프트웨어(Chromeleon 6.0 Chromatography Data System Software, Dionex)를 이용하였다(Kim MH 등 2017).

[ 오디 발효주를 이용한 발효 식초의 특성 ]

1. 알코올 발효특성

아로니아로부터 분리된 토종 S. cerevisiae GBY5을 이용하여 오디 발효주를 제조하였고 0일부터 6일까지의 발효 기간에 따른 알코올 함량 및 당도의 변화를 Fig. 1에 나타내었다. S. cerevisiae GBY5의 경우 발효 1일째부터 알코올 생성량이 급격하게 증가한 후 4일째에 알코올 함량이 정지하여 발효 완료 후 최종 알코올 함량이 13.33±0.02%로 나타났으며, 최종 당도는 각각 8.93±0.06°Brix를 나타내었다. S. cerevisiae GBY5로 발효한 오디 발효주의 경우 발효기간이 경과함에 따라 pH는 초기 4.41±0.07에서 서서히 감소하여 발효 종료 후 4.00±0.01로 감소하였으며, 총산도의 경우 발효초기 0.41±0.01%에서 발효가 진행됨에 따라 점차 증가하여 발효 종료 후 0.77±0.00%를 나타내었다.

색도는 와인 품질평가의 중요 항목 중 하나로 폴리페놀 함량, 미생물 활성 및 SO₂ 등 여러 요인에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Lee JE 등 2002). 본 연구에서 S. cerevisiae GBY5로 발효한 오디 발효주의 색도를 측정한 결과 표 4와 같이 명도(L)의 경우 발효전 18.48에서 발효 후 28.59로 발효 한 후 명도가 증가하였으며, 오디 발효주에 있어 중요한 색소 인자인 적색도(a)는 S. cerevisiae GBY5가 발효전 50.55에서 발효 후 49.73으로 감소하였다. 황색도(b)의 경우 발효 전 31.86에서 발효 후 32.53으로 나타났다.

S. cerevisiae GBY5를 이용한 오디 발효주의 색도

	색도
	명도(L)	적색도(a)	황색도(b)
발효 전	18.48±0.00	50.55±0.01	31.86±0.00
발효 후	28.59±0.00	49.73±0.00	32.53±0.01

2. 초산 발효특성

초산 발효 과정 중 알코올 함량과 산도의 변화를 측정한 결과는 도 6과 같다. 초산발효 과정에서 알코올 함량은 초기에 5.14 %이었으며 발효가 진행됨에 따라 점차 감소하여 발효 종료 후 1.70 %로 나타났고, 총산도는 발효 초기에 2.06 %에서 발효 종료 후 4.82 %로 나타났다. Acetobacter pasteurianus KACC 13994를 이용한 초산 발효 과정에서 발효 전 명도(L)는 54.24에서 발효 후 47.83으로 명도가 감소하였으나, 적색도(a)는 발효 전 41.77에서 발효 후 44.89로 증가하였다. 황색도(b)의 경우 발효 전 17.32에서 발효 후 26.83으로 증가하였다.(표 5)

Acetobacter pasteurianus KACC 13994를 이용한 오디 초산 발효 특성

	색도
	명도(L)	적색도(a)	황색도(b)
발효 전	54.24±0.00	41.77±0.01	17.32±0.00
발효 후	47.83±0.00	44.89±0.01	26.83±0.00

3. 오디 발효주 및 오디 식초의 유기산 함량

S. cerevisiae GBY5를 이용한 오디 발효주의 유기산 함량 분석 결과 구연산과 젖산 함량이 각각 3582.97 mg/L, 3881.15 mg/L으로 나타났으며, 안식향산은 21.12 mg/L으로 나타났다. 한편, 말산과 푸마르산은 검출되지 않았다. 오디 식초의 경우 구연산과 안식향산, 젖산함량이 오디 발효주에 비해 감소하여 각각 1508.44 mg/L, 8.71 mg/L, 116.51 mg/L로 나타났으며, 초산의 경우 초산발효에 의해 함량이 크게 증가하여 60311.37 mg/L로 나타났다.(표 6)

오디 발효주 및 식초의 유기산 함량

	유기산(mg/L)
	구연산	말산	안식향산	푸마르산	젖산	초산
오디 발효주	3582.97	ND	21.12	ND	3881.15	1995.11
오디 식초	1508.44	ND	8.71	ND	116.51	60311.37

ND: Not detected

4. 오디 발효주 및 오디 식초의 유리당 함량

S. cerevisiae GBY5를 이용한 오디 발효주 및 오디 식초의 유리당 함량을 측정한 결과 수크로오스, 글루코스, 프룩토오스, 소르비톨은 검출되지 않았으나, 만니톨의 경우 오디 발효주가 6236.45 mg/L로 나타났으며, 오디 식초의 경우 만니톨 함량이 감소하여 2310.53 mg/L로 나타났다.(표 7)

	유리당(mg/L)
	수크로오스	글루코스	프룩토오스	소르비톨	만니톨
오디 효주	ND	ND	ND	ND	6236.45
오디 식초	ND	ND	ND	ND	2310.53

ND: Not detected

본 발명은 시판효모인 Fermivin과 유사한 발효 특성을 나타내기 때문에 수입 시판건조효모인 Fermivin의 대체기능을 갖는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae GBY5)를 제공하고, 상기 토종 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae GBY5)가 시판효모인 Fermivin에 비하여 우수한 적색도 및 폴리페놀 함량을 나타냄에 따라 심미적 측면 뿐만 아니라 기능적인 측면에서도 높은 경쟁력을 갖는 기능성 오디발효주 및 발효식초를 제공하는 효과를 가짐으로써 산업상 이용가능성이 크다.

한국미생물보존센터

KCCM12271P

20180531

<110> KOCHANG COUNTY <120> Saccharomyces cerevisiae GBY5 isolated from Aronia, Isolating method thereof, Method for production of mulberry wine and vinegar using the strin <130> 2018-422 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 302 <212> RNA <213> Saccharomyces cerevisiae GBY5 <400> 1 ttcaatacaa cacactgtgg agttttcata tctttgcaac tttttctttg ggcattcgag 60 caatcggggc ccagaggtaa caaacacaaa caattttatt tattcattaa atttttgtca 120 aaaacaagaa ttttcgtaac tggaaatttt aaaatattaa aaactttcaa caacggatct 180 cttggttctc gcatcgatga agaacgcagc gaaatgtgat acgtaatgtg aattgcagaa 240 ttccgtgtat cgtcttatct ttgaactcac attgcgcacc ttggtgttct ggggtggctg 300 cc 302

Claims

사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주에 있어서,
아로니아로부터 순수 분리, 동정되는 것을 특징으로 하는 Saccharomyces cerevisiae GBY5(수탁번호 KCCM12271P).
아로니아를 25 ℃에서 3 ~ 7 일간 발효한 후 멸균 거즈로 분리하여 아로니아 여과액을 제조하는 단계(S10)와,
멸균식염수를 이용한 10배 희석법으로 상기 아로니아 여과액을 희석하여 아로니아 여과희석액을 제조하는 단계(S20)와,
YPD 고체배지에 상기 아로니아 여과희석액을 도말하고 23 ~ 27 ℃에서 48 ~ 72 시간 동안 배양하여 아로니아 배양액을 제조하는 단계(S30)와,
상기 아로니아 배양액으로부터 사카로마이세스 세레비지애 GBY5(Saccharomyces cerevisiae GBY5)(수탁번호 KCCM12271P)를 순수 분리하는 단계(S40)를 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 Saccharomyces cerevisiae GBY5(수탁번호 KCCM12271P) 분리방법.
오디 분쇄한 후 설탕을 이용하여 25 ~ 27°Brix가 되도록 보당하는 단계(S10')와,
보당 과정을 거친 오디에 청구항 1의 Saccharomyces cerevisiae GBY5(수탁번호 KCCM12271P)를 1.0 ~ 5.0×10⁹ CFU/kg이 되도록 접종하는 단계(S20')와,
상기 Saccharomyces cerevisiae GBY5(수탁번호 KCCM12271P)를 접종한 오디를 교반하고 23 ~ 27 ℃에서 5 ~ 8 일 동안 발효시켜 오디 발효주를 제조하는 단계(S30')와,
상기 오디 발효주를 유압착즙기로 착즙하여 -3 ~ -8 ℃에서 1 ~ 3 일 동안 냉동 보관한 후, 포어 사이즈(pore size) 1.2 ㎛인 멤브레인 필터(membrane filter)를 사용하여 여과하는 단계(S40')를 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 오디발효주 제조방법.
청구항 3의 제조방법으로 제조된 오디발효주를 알코올 함량 5 ~ 7 %로 희석하는 단계(S10")와,
알코올 함량 5 ~ 7 %가 되도록 증류수로 희석한 오디발효주의 초기산도를 1.5 ~ 2.5 %로 조정하는 단계(S20")와,
상기 초기산도를 1.5 ~ 2.5 %로 조정한 오디발효주에 초산균주 Acetobacter pasteurianus KACC 13994를 5 ~ 20% (v/v)를 접종하는 단계(S30")와,
초산균주를 접종한 오디발효주를 28 ~ 33 ℃에서 17 ~ 23 일간 정치배양하는 단계(S40")를 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 발효식초 제조방법.