KR20170013637A - 아세토박터 파스테우리아누스 kacc92047p로 발효한 복분자 식초의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 복분자 식초의 상품성 향상을 위한 복분자 식초 제조 방법에 관한 것으로, 선별된 최적의 초산균인 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) KACC92047P 균주를 통해 종초를 제조하여 최적의 초산발효 시스템을 확립함으로써 본 발명의 제조방법을 통해 살균 공정 및 저장 과정 중 품질이 뛰어난 복분자 식초를 제조할 수 있다.

Description

아세토박터 파스테우리아누스 KACC92047P로 발효한 복분자 식초의 제조방법{Manufacturing Method of Rubus coreanum Vinegar fermented by Acetobacter pasteurianus KACC92047P}

본 발명은 아세토박터 파스테우리아누스 KACC92047P로 발효한 복분자 식초의 제조방법에 관한 것이다.

복분자(Rubus coreanus Miquel)는 장미과에 속하는 낙엽활엽관목으로 높이는 2~3 m에 달하는 산딸기 일종인 복분자 딸기의 열매를 말한다. 복분자 과실은 우리나라 남부 및 중부지방의 해발 50~1000 m의 산기슭의 양지에 자생하며, 5~6월에 꽃이 피고 지역, 품종에 따라 다르지만, 6월 중순에서 7~8월에 열매가 성숙된다.

복분자 과실은 당도가 7.6~12.4 brix 범위이며, 유리당, 무기질의 인, 철 및 칼륨이 많이 함유하여 있고 특히 유기산과 비타민 C가 많이 포함되어 있고 또한, 생리활성 물질로서 폴리페놀, 플라보노이드 등이 다량 함유되어 있으며, 항암활성 및 면역증진효과, 항산화 및 항균효과, 혈관신생억제(anti-angiogenesis)효과 및 알레르기 관련 질병 치료 효과 등의 다양한 생리활성이 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 복분자는 청량음료, 잼, 차, 주류 등의 식용으로 사용되고 있으며, 약용으로도 민간에서 강장, 보혈, 호흡질환, 천식 등에 효과가 있다고 알려져 있고, 복분자 과육의 붉은 색은 안토시아닌 계통으로 다양한 기능성 성분을 함유하고 있다는 것으로 알려지는 등 건강지향적인 식품소재로 각광을 받고 있다. 따라서 현재 복분자는 냉동과일, 복분자 과즙, 복분자 잼 형태로 가공 유통되고 있으며, 건강식품으로 인식되면서 과즙인 액상 주스 또는 술 제조에도 그 이용성을 확대해 나가고 있으며 그 전망 또한 매우 밝다고 예상된다.

최근의 식품에 대한 소비자의 관심은 식품소재가 지닌 다양한 기능성을 이용한 웰빙로하스의 지향 및 가공식품의 안전성에 있다. 특히, 농약의 과다 사용과 같은 재배과정의 문제점 및 비위생적인 관리 그리고 값싼 외국소재에 대한 불신감이 커지고 있어 국내의 신뢰할 만한 좋은 자연환경을 이용한 재배환경에서 무농약을 이용하여 재배되어지는 위생적이며 자연친화적인 유기농소재에 관심을 가지고 있다.

전라북도 무주군에서 생산되는 복분자는 2002년부터 농약이나 기타의 화학물질을 전혀 사용하지 않는 재배방식을 시도하여 복분자를 재배하고 있으며, 2005년도에는 유기재배인증을 국립농산물 품질관리원에서 인증받음으로써 국내에서 손꼽히는 유기농 복분자를 생산하고 있다. 식초는 동서양의 대표적 발효식품으로 최근 식생활의 향상으로 식초는 단순 조미료 기능에서 건강용 식초로의 소비패턴으로 변화되고 있으며, 이러한 식초 소비패턴의 변화는 식초시장을 고급화, 다양화로 가속시키고 있다. 최근 식초의 항암, 항돌연변이, 항노화, 면역, 동맥경화, 고혈압 등의 성인병 예방 효과, 식중독균의 살균효과, 콜레스테롤 저하 효과, 체지방 감소 및 피로회복 효과 등의 효과가 알려지면서 다양한 용도의 식초제품이 개발되고 있으며, 식초가 갖는 다양한 효능에 대한 소비자의 인지도가 확산되면서 거의 건강 음료로 받아들여질 만큼 높은 인기를 누리고 있다. 최근에는 과실의 향이나 유효성분을 이용한 감, 매실, 밀감, 배, 사과 등의 과실초 발효와 인삼성분이나 마늘, 양파를 이용한 기능성 식초의 제조가 시도되고 있다.

그러나 이러한 유기농으로 재배되어진 복분자의 경우, 일반 복분자에 비하여 미생물에 독성을 나타내는 인자들이 많이 포함되어짐으로 인하여 미생물의 생육을 저해하는 경우가 많다고 알려져 있다. 따라서 이러한 유기농 재배용 복분자의 발효에 적합한 미생물을 개발할 필요성이 있다.

현재 시판되고 있는 건강용 식초는 사과식초, 양조식초, 현미식초 및 레몬식초가 있고 최근에 개발되고 있는 건강 식초 음료는 매실식초, 마늘식초 및 알카리성 감자식초 등이 출시되고 있다. 건강기능성 식초 음료는 홍초와 붉은 과실로 석류, 오미자, 자색고구마 식초 음료(대상 제품)가 판매되고 있으며, 중국 전래의 흑초 발효방식인 균개기법으로 만든 흑초(오뚜기 제품)와, 여성 미용 음료인 여인미 시리즈에서 사과식초가 3.5％ 들어간 사과맛(한국야쿠르트 제품)의 사과식초와, 감, 홍삼, 석류, 매실 등 4종으로 구성된 식초 음료(해표 제품)를 판매하고 있다. 건강에 관심이 높은 소비자들은 웰빙형 식품을 선호하고 있으므로 복분자를 이용한 고급식초 및 식초 음료는 종래의 식초 음료에 비해 복분자는 향과 맛 및 색이 우수하며, 고 기능성을 함유하고 있으므로 경쟁력이 있다고 사료된다.

식초는 오랜 기간 우리 일상생활에 중요한 조미료로 사용된 발효식품 중의 하나로서, 자연적으로 술이 시어지는 현상에 의해 발견되고 이용된 것이다. 주로 음식의 맛을 내는데 이용되어 직접 식용되기도 하지만 피클 등 절임 식품, 마요네즈, 케첩, 소스류 등의 제조 원료로도 널리 사용된다. 그 외에 의약적인 효능을 갖고 있어 민간 의약품으로 사용되기도 하며 부패균 생육억제 작용을 이용하여 방부제나 보존료로 이용되기도 하였다. 또한 체내의 젖산을 분해하여 몸의 피로를 회복시키는 효과가 있으며 숙취 해소와 이뇨작용, 소화액의 분비 촉진, 당뇨병 예방, 비만 방지, 혈압상승방지, 노화방지 및 스트레스 해소에 효능이 있는 것으로 보고되어 식초의 용도가 더욱 다양화되어 가고 있다. 특히 발효식초는 최근에 기능성 식품으로도 많이 활용되며 묽게 희석하여 직접 음용하는 음료 제품이 개발되고 있다.

식초의 종류는 곡류나 알코올성 음료 또는 과일즙을 발효시켜 만들어지는 발효식초(양조 식초)와 빙초산이나 초산을 중심재료로 만들어지는 합성식초로 나뉜다. 발효식초는 과실식초, 곡물식초, 주정식초로 재료에 따라 나뉘며 과실식초는 과실술덧, 과실착즙액, 주정 및 당류 등의 원료를 혼합한 초산 발효액이고, 곡물식초는 곡물술덧, 곡물당화액, 알코올 및 당류 등의 원료를 혼합하며, 주정식초는 주정, 당류, 첨가물 등의 원료를 혼합하여 초산발효액이다. 합성식초는 발효과정을 거치지 않고 빙초산 또는 초산을 희석하여 유기산을 첨가한 것으로 무색투명하다.

발효식초는 원료의 자체의 향기성분과 발효공정 중에 생성된 향기성분을 가지며 초산 이외에 휘발성 및 비휘발성의 각종 유기산류, 당류, 아미노산류, 에스테르류 등을 함유하고 있다. 합성식초는 빙초산을 희석한 것으로 석유 원료로부터 아세트알데히드를 만든 후, 이것을 다시 화학적으로 산화시켜 초산을 만든 것이다. 그래서 초산성분 이외에 다른 영양성분이 없을 뿐만 아니라 발효식초와 달리 강산성이며 향기성분도 거의 없다.

식생활의 향상에 따른 건강용 식초의 수요가 증가하고 있으나 발효식초는 수율이 낮고 소요되는 시간이 길며 장기간 발효 과정으로 인한 이미, 이취 발생뿐만 아니라 품질관리가 어려운 문제가 있어 고품질의 천연 양조식초 제조에 어려움이 있어 현재 산업적으로 생산되는 식초는 대부분 합성된 초산을 희석하여 제조되는 실정이다. 이러한 한계를 극복하기 위해 식초의 제조 공정은 지속적으로 개량되어가고 있으나 초산 발효균주의 개량은 아직 미미한 상태이다. 이에 초산의 생산 수율이 높고 식초 제조에 용이한 균주를 발굴 및 개발하여야 할 필요성이 대두되고 있다.

관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제 1020120072918호는 4종류의 효모로 제조한 술덧을 이용하여 정치 초산 발효에 의한 천연 양조식초를 제조하는 방법에 관한 것으로 천연 양조식초 제조방법은 시판 식초로부터 고유기산을 생성하는 초산균을 분리하고, 알코올 생성 효모를 선정하여 종래의 병행복발효법의 공정을 개선한 2단계 발효법에 의해 알코올 발효와 초산 발효를 분리 실시함으로써 장기간 발효과정으로 발생할 수 있는 이미, 이취의 단점을 극복하고 초산 생성율이 현저히 높고 아울러 품질이 우수한 천연 양조식초 제조방법을 제공하여 스트레스 해소에 도움을 주는 부신피질 호르몬 생성에 작용하는 초산의 함량이 현저히 높은 천연 양조식초를 제공함으로써 공해와 스트레스에 시달리는 현대인의 건강을 보호 및 유지시킬 수 있는 효과를 발휘한다고 기재되어 있으며, 다른 관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제 1020110097500호는 복숭아로부터 분리되고, 산 생성능을 가지며, 양파의 초산 발효능을 가지고, 양파를 발효시켜 초산, 사과산, 구연산, 숙신산, 옥살산 및 주석산을 생성할 수 있는 기탁번호 KFCC 11476P를 갖는 아세토박터 트로피칼리스 균주(Acetobacter tropicalis KFCC 11476P)에 대해서 기재되어 있다.

이에, 본 발명자들은 복분자로부터 제조한 복분자 식초의 상품성 향상을 위한 전용 초산균 선발 및 최적의 초산발효 시스템 확립하고자 하였으며, 이를 통해 복분자 식초 제조 및 저장 중 품질향상을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아세토박터 파스테우리아누스 KACC92047P로 발효한 복분자 식초의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은

1) 복분자 또는 복분자즙을 알콜발효(alcohol fermentation)하여 알콜발효액을 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 알콜발효액에 초산균으로써 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) KACC92047P를 이용한 종초(vineger starter)를 첨가한 후 초산발효(acetic acid fermentation)하여 초산발효물을 제조하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 초산발효물을 여과 또는 살균하는 단계;

를 포함하는 복분자 식초의 제조 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 복분자 농도가 50 내지 75%(v/v)이고 알콜 농도가 5 내지 6%(v/v)인 복분자 술에 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) KACC92047P 균주를 이용한 종초를 첨가하여 초산발효시키는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 초산발효물을 여과 또는 살균하는 단계를 포함하는 복분자 식초의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 복분자 식초의 상품성 향상을 위한 복분자 식초 제조 방법에 관한 것으로, 선별된 최적의 초산균인 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) KACC92047P 균주를 통해 종초를 제작하여 최적의 초산발효 시스템을 확립함으로써 본 발명의 제조방법을 통해 살균 공정 및 저장 과정 중 품질이 뛰어난 복분자 식초를 제조할 수 있다.

도 1은, 아세토박터(Acetobacter) 속 및 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 균주인 초산균(acetic acid bacteria)의 초산(acetic acid) 생성능을 나타낸 도이다.
도 2는, 초산 생성능이 뛰어난 4종류의 균주의 복분자 술에서의 산도(titratable acidity) 변화를 나타낸 도이다.
도 3은, 가수량(0, 50%, 100%, 150% 및 200% (v/v))에 따른 복분자 식초의 초산발효(acetic acid fermentation) 과정 중의 pH 및 산도의 변화를 나타낸 도이다.
도 4는, 초기 알코올 농도(5, 6, 7 및 8%)에 따른 복분자 식초의 초산발효(acetic acid fermentation) 과정 중 pH, 당도(soluble solid) 및 산도의 변화를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

1) 복분자 또는 복분자즙을 알콜발효(alcohol fermentation)하여 알콜발효액을 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 알콜발효액에 초산균으로써 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) KACC92047P를 이용한 종초(vineger starter)를 첨가한 후 초산발효(acetic acid fermentation)하여 초산발효물을 제조하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 초산발효물을 여과 또는 살균하는 단계;

를 포함하는 복분자 식초의 제조 방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 복분자 또는 복분자즙은 50 내지 75%(v/v) 농도인 것이 바람직하며, 복분자 또는 복분자즙에 물을 넣지 않거나 50 내지 100%(v/v) 첨가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 첨가되는 물이 100%(v/v)를 초과하면 복분자 식초의 산도가 낮아지고, 맛과 향 등의 전반적이 선호도 또한 낮아지게 된다.

상기 단계 1)의 알콜발효액은 초기 알콜 농도가 5 내지 6%(v/v) 농도인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 초기 알콜 농도가 7 내지 8%(v/v)인 경우는 초산발효가 더디며 식초의 맛과 향 등의 전반적인 기호도가 낮아지고, 8%(v/v) 이상인 경우는 초산발효가 거의 진행되지 않는다.

상기 단계 2)의 종초는 알콜 6%의 술에 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) KACC92047P 균주를 접종한 뒤 진탕배양 또는 정치배양하여 제조하는 것이 바람직하다.

상기 단계 2)의 초산발효 전에 갈변 억제제를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 갈변 억제제는 구연산, 수산, 비타민 C 또는 PVPP에서 선택되어질 수 있고, 비타민 C 또는 구연산인 것이 가장 바람직하다. 상기 갈변 억제제는 알콜 발효 전 또는 초산 발효 전에 첨가할 수 있으며, 초산 발효 전에 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 초산 발효 전에 첨가할 경우, 수산의 경우는 복분자 식초의 총 안토시아닌 함량을 높게 하지만 초산 발효를 저해시킨다.

상기 복분자 식초의 현탁 입자를 분리하기 위해 중력침강법, 응집제(카제인, 젤라틴, 키토산, 규조토)의 처리, 규조토프리코팅법 또는 원심분리 방법을 사용할 수 있으며, 응집제(규조토)의 첨가, 원심분리 또는 규조토프리코팅법으로 여과시키는 것이 가장 바람직하다.

상기 단계 3)의 여과는 원심분리 또는 규조토프리코팅법으로 여과시키는 것이 바람직하다. 또한 상기 단계 3)의 살균은 여과를 하지 않은 경우 70℃ 온도에서 살균하고, 여과를 한 경우 40 내지 70℃ 온도에서 살균하는 것이 바람직하나, 여과만으로도 살균의 효과가 있다.

본 발명의 구체적인 실험예에 있어서, 본 발명자들은 복분자 식초 제조용 종초(Mother vinegar, vinegar starter)을 선발하기 위해 상기 균주들의 초산 생성 분석을 실시하였다. 그 결과, 상위 4종의 균주 A. malorum V5-7, A. pasteurianus Gam2, Ga . intermedius V11-5 및 A. malorum KACC12222가 발효 3일 이후부터 식초 발효에 필요한 총 산의 4% 이상을 생성하는 것을 확인하였으며 가장 높은 산 생성능을 보였다(도 1 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 식초 발효 적합 균주로 선정된 4종의 균주를 이용하여 종초 제조 및 초산 발효능을 확인하였으며 그 결과, A. pasteurianus KACC92047P 및 A. pasteurianus gam2 두 균주가 초산 발효를 활발히 하였으며, 초산 발효 3일째 산도 3%를 초과하였다. A. malorum V5-7 및 A. aceti KCTC1010는 복분자 술에서 초산 발효에 어려운 것으로 나타났다(도 2 참조). 이에, 본 발명자들은 A. pasteurianus KACC92047P 균주를 복분자 식초 제조에 사용할 균주로 선정하였다.

또한, 본 발명자들은 복분자 식초 제조 과정으로써, 복분자 알코올 발효액 제조를 위한 물의 첨가량에 따라 초산 발효 과정에 미치는 영향을 확인하기 위하여 분자즙액에 첨가하는 물의 첨가량은 0, 50%, 100%, 150% 및 200%(v/v)으로 설정하여 복분자 알코올 발효액을 제조하였다. 상기 복분자 알코올 발효액에 선별된 A. pasteurianus KACC92047P를 이용하여 제조한 종초로 초산 발효시켰으며, 초산 발효 과정의 pH, 산도(acidity) 측정 및 초산 발효 후의 품질 특성을 확인하였다. 그 결과, pH의 경우, 초산 발효 1~7일 동안 pH가 서서히 낮아졌으며, 초산 발효 7일째 가장 낮은 pH를 보였으며 이후 조금 높아지는 것을 확인하였다(도 3a 참조). 또한 산도의 경우, 모든 경우 발효 1~7일 동안 서서히 높아졌으며, 발효 11일째 5.2~6.1%로 나타나는 것을 확인하였다(도 3b 참조). 가수량이 100%인 경우가 가장 높은 산도를 나타내었으며, 가수량(물의 첨가량)이 150% 이상인 경우, pH는 낮았지만 산도는 가수량 150% 이하의 경우보다 높지 않았다. 또한, 가수량에 따라 제조된 복분자 식초의 기호도 평가를 하였으며 그 결과, 향과 맛은 처리구에 따른 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 색은 가수량 100%의 경우 가장 높은 기호도를 나타내었으며, 전반적인 기호도는 가수량 0%, 50% 및 100%가 가수량 150% 및 200% 보다 우수한 것으로 유의적인 차이를 나타내는 것을 확인하였다(표 3 참조). 또한, 가수량에 따라 제조된 복분자 식초의 색도를 분석하였으며 그 결과, 색도의 L값은 가수량이 높을수록 24.12로 밝게 나타났다. a값 또한 가수량이 높을수록 2.93으로 붉은색에 가깝게 나타났으며, b값도 유사한 패턴을 나타내었다(표 4 참조). 또한, 가수량에 따라 제조된 복분자 식초의 유기산(organic acids)을 분석하였으며 그 결과, 초산과 구연산이 주요한 유기산으로 나타났으며 가수량이 높을수록 구연산의 함량이 적게 검출되는 것을 확인하였다(표 5 참조). 또한, 가수량에 따라 제조된 복분자 식초의 총 폴리페놀과 총 안토시아닌 함량을 분석하였으며 그 결과, 총 폴리페놀과 총 안토시아닌은 가수량이 높을수록 감소하였으며, 총 폴리페놀의 경우 가수량 200%일 때 약 20%의 감소량을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 총 안토시아닌 함량의 경우 가수량에 의해 감소되는 비율이 적은 것으로 나타났다(표 6 참조).

또한, 본 발명자들은 복분자 알코올 발효액의 알코올 농도에 따른 초산 발효에의 영향을 확인하기 위하여 선별된 A. pasteurianus KACC92047P를 이용하여 제작한 종초를 이용하여 복분자의 농도는 50%, 초기 복분자 알코올 농도는 5, 6, 7 및 8%로 설정하였고, 초산 발효 과정의 pH, 당도(soluble solid), 산도(acidity) 측정 및 초산 발효 후의 품질 특성을 분석하였다. 그 결과, pH의 경우, 발효 1~9일 동안 pH가 서서히 낮아졌으며 알코올 도수가 높은 8%는 거의 낮아지지 않는 것을 확인하였다(도 4a 참조). 당성분은 큰 변화가 없는 것으로 나타났다. 또한, 산도는 최종 발효 후 2.0~5.6%으로 나타났으며, 알코올 농도가 높은 7~8%의 경우, 초산발효가 더딘 것을 확인하였다(도 4c 참조). 또한, 초기 알코올 농도(5, 6, 7, 8%)에 따른 기호도 평가를 실시하였으며 그 결과, 알코올 농도가 낮은 5~6%으로 발효된 식초가 색, 향, 맛 그리고 전반적인 기호도에서 높은 평가를 받은 것을 확인하였다(표 7 참조). 또한, 초기 알코올 농도(5, 6, 7, 8%)에 따른 유기산을 분석을 하였으며 그 결과, 초산과 구연산이 주요한 유기산으로 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 알코올 농도가 낮은 5~6%으로 발효된 식초의 유기산 함량이 알코올 농도가 높은 7~8%으로 발효된 식초보다 높게 검출되는 것을 확인하였다(표 8 참조).

또한, 본 발명자들은 응집제 처리에 따른 복분자 식초의 현탁 입자 분리 정도를 조사하기 위해, 중력침강법, 응집제(카제인, 젤라틴, 키토산) 처리, 규조토프리코팅 감압여과 및 원심분리여과 효과를 비교하였다. 그 결과, 응집제 처리시 중력침강법과 유의적인 차이를 보이지 않는 것을 확인하였다. 키토산의 경우 오히려 탁도가 증가하였고, 규조토와 카제인은 중력침강법에 비해 탁도가 감소하는 것을 확인하였다(표 9 참조). 또한, 중력침강법 및 물리적 처리(원심분리, 규조토프리코팅 여과)에 의한 현탁 입자 분리 정도를 비교한 결과, 원심분리 및 규조토프리코팅 여과에 의한 탁도의 감소 변화를 확인하였다. 원심분리 8,000 rpm 이상시 중력침강법에 비해 약 10배 가량의 탁도 감소를 나타내었다. 또한, 규조토프리코팅 여과의 경우 원심분리 2,000 rpm에 의한 효과와 유사하게 나타나는 것을 확인하였다(표 10 참조).

또한, 본 발명자들은 복분자 식초의 저장 중 품질 유지 관리 방법을 확인하기 위해 식초의 저장 중 갈변현상이 PPO에 의해 갈변 되는지, 그리고 갈변 억제 첨가제(구연산, 수산, 비타민 C 및 PVPP)를 처리하였을 때의 갈변 효과를 확인하였으며 그 결과, 초산 발효 전에 첨가하는 것이 알코올 발효 전에 첨가하는 것보다 폴리페놀 산화효소의 활성이 억제되었으며, 첨가제 중 구연산 및 수산(옥살산)의 효과가 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다(표 11 참조).

또한, 본 발명자들은 갈변 억제 첨가제에 따른 복분자 식초의 저장 중 총 폴리페놀 함량 변화를 확인하였으며 그 결과, 알코올 발효 전 및 초산 발효 전 첨가 모두 갈변 억제 첨가제에 의한 유의적인 변화를 나타내지 않는 것을 확인하였다(표 12 참조).

또한, 본 발명자들은 갈변 억제 첨가제에 따른 복분자 식초의 저장 중 총 안토시아닌 함량 변화를 확인하였으며 그 결과, 알코올 발효 전 첨가시에는 유의적인 변화가 없었으나, 초산 발효 전에 첨가한 경우에는 총 안토시아닌 함량이 높게 유지 되는 것을 확인하였으며, 갈변 억제 첨가제 중 수산(옥살산)이 가장 효과가 높게 나타났다(표 13 참조).

또한, 본 발명자들은 갈변 억제 첨가제에 따른 복분자 식초의 저장 중 갈색도의 변화를 확인하였으며 그 결과, 알코올 발효 전 첨가한 경우 유의적인 차이가 없었으나, 초산 발효 전에 첨가한 경우에는 갈색도가 대조군보다 낮게 유지 되는 것을 확인하였다. 또한, 첨가제 중 비타민 C에 의한 갈변 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다(표 14 참조).

또한, 본 발명자들은 갈변 억제 첨가제에 따른 복분자 식초의 저장 중 유기산 함량의 변화를 확인하였으며 그 결과, 알코올 발효 전 첨가의 경우 저장 중 비타민 C에 의하여 초산의 감소가 나타나는 것을 확인하였다(표 15 참조). 초산 발효 전 첨가한 경우, 알코올 발효 전 첨가한 경우에 비해 초산의 유기산 함량은 낮았지만, 저장 중 감소율은 낮은 것으로 나타났다(표 15 참조). 또한, 초산 발효 전 첨가제 중 수산(옥살산)의 경우, 초산 발효를 저해하는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명자들은 살균에 따른 본 발명의 복분자 식초의 침전 생성 억제 및 품질특성을 분석하였으며 그 결과, 여과 전 및 후에 따라 발효 식초의 pH, 당 및 산도의 변화는 나타나지 않는 것으로 나타났고 여과한 실험군에서는 초산균이 검출되지 않아 여과만으로도 제균의 효과를 나타내었다. 살균 온도에 따른 살균 효과의 경우, 70℃에서 초산균이 검출되지 않아 저온살균의 온도는 70℃가 적당한 것으로 나타났다. 또한, 살균 온도가 높아짐에 따라 산도의 감소를 확인하였다(표 16 참조).

따라서, 본 발명은 초산 발효가 우수한 최적의 초산균인 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) KACC92047P 균주를 통해 종초를 제작하여 최적의 초산발효 시스템을 확립하였으며, 상기 제조방법을 통해 살균 공정 및 저장 과정 중 상품성이 향상된 복분자 식초 제조에 활용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 복분자 식초 제조용 초산균의 선발

<1-1> 초산의 과산화( Overoxidation ) 확인

초산균이 초산을 과산화하는 것은 초산균이 존재하는 곳의 알코올 농도, 초산 농도, 온도 등 환경 요인에 따라 달라질 수 있으므로 이에 대한 세부적인 연구가 필요하다. 초산을 한 번 더 산화시키는 과산화는 pH를 높이고 산도를 떨어뜨려 식초 발효시 방해가 되는 요인이 된다. 이에, 본 발명자들은 표 1에 나타낸 균주들을 통해 과산화 분석을 실시하였다.

구체적으로, 초산 과산화는 시험배지(D-glucose 5 g/L, glycerol 5 mL/L, polypeptone 5 g/L, yeast extract 5 g/L, bromocresol purple 30 mg/L, acetic acid 10 mL/L, ethanol 10 mL/L, agar 15 g/L)에 초산균을 접종하여 푸른색의 콜로니가 생성되면 과산화 특성이 있는 것으로 판정하였다. 또한, 초산 및 pH 내성 분석을 위해 초산 내성 분석 시험배지(D-glucose 5 g/L, glycerol 5 mL/L, polypeptone 5 g/L, yeast extract 5 g/L, acetic acid 30 mL/L, ethanol 20 mL/L, agar 15 g/L) 및 pH 내성분석 시험배지(D-glucose 5 g/L, glycerol 5 mL/L, polypeptone 5 g/L, yeast extract 5 g/L, pH 3.0~3.4, ethanol 20 mL/L, agar 15g/L)에 초산균을 접종하여 30 및 37℃에 3일간 배양하여 콜로니 생성 유무로써 초산 내성 및 pH 내성을 판정하였다.

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 아세토박터(Acetobacter) 속과 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 모두 과산화하지 않는 것을 확인하였다(표 2). 또한, 초산에 대한 내성은 Gluconacetobacter 속 균주에서만 나타나는 것으로 확인되었다. pH에 대한 내성은 A. malorum V5-7, A. acetii KCTC1010에서 가장 높은 활성을 보였고, Gluconacetobacter 속 균주와 A. pasteurianus Gam2에서도 pH 3.3까지 내성을 보이는 것으로 나타났다. A. malorum KACC12222, A. pasteurianus KACC13994는 pH 3.5까지 내성을 있는 것으로 관찰되었다. A. pasteurianus KACC92047P, Ga . entanii RDA-S에서는 pH 3.5 이하에서는 콜로니가 발견되지 않았다(표 2). 따라서, 초산균의 최적 생장 pH는 5.0~6.5인 것으로 판단되었다.

Species	Strain	Number	Source
Acetobacter acetii	-	KCTC1010	Quick vinegar, Zwolle, Netherlands
Acetobacter malorum	-	KACC12222	Rotting apple, Belgium
Acetobacter pasteurianus	-	KACC13994	Beer, Netherlands
Acetobacter pasteurianus	RDA-F	KACC92047P	Vinegar (Rubus coreanus), Seongnam-si, Gyeonggi-do
Acetobacter pasteurianus	Gam2	-	Vinegar (persimmon), Yeongju-si, Gyeongsangbuk-do
Acetobacter malorum	V5-7	-	Vinegar (Rubus coreanus), Seocheon-gun, Chungcheongnam-do
Gluconacetobacter entanii	RDA-S	-	Vinegar (Rubus coreanus), Seongnam-si, Gyeonggi-do
Gluconacetobacter intermedius	V11-5	-	Vinegar (persimmon), Cheongdo-gun, Gyeongsangbuk-do
Gluconacetobacter xylinus	V8-1	-	Vinegar (persimmon), Muju-gun, Jeollabuk-do

<1-2> 발효 중 콜로이드( Colloid ) 생성 확인

초산균이 생성하는 콜로이드는 초산균의 글루코오스(glucose) 대사에 의해 생산되는 덱스트란(dextrans), 레반(levans), 셀룰로오스(cellulose)이며 세포 외 다당체이다. 이러한 세포 외 다당체는 최종 식초 제품의 품질에 해로운 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 상기 표 1의 균주들의 발효 중 콜로이드 생성을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 콜로이드 생성 분석은 시험배지(D-glucose 5 g/L, glycerol 20 mL/L, polypeptone 10 g/L, yeast extract 10 g/L, potato extract 200 mg/L)에 초산균을 30℃에 3일간 정치배양 후, 콜로이드 형성 유무를 판정하였다.

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 Gluconacetobacter 속 중 Ga . intermedius V11-5 및 Ga . xylinus V8-1 균주에 경우 다량의 콜로이드를 생성하였으며, 이는 식초 발효균으로 적합하지 않다고 판단하였다. Acetobacter 속 균주 중 A. malorum KACC1222, V5-7, A. pasteurianus KACC92047P, 및 Gam2는 상층부에 얇은 균막이 발견되었으나, 이는 균주의 성장이 활발한 것을 의미함으로 식초 발효균으로 적합한 것으로 판단하였다.

		Acetobacter spp.						Gluconacetobacter spp.
		KCTC 1010	KACC 12222	KACC 13994	KACC 92047P	Gam2	V5-7	RDA-S	V11-5	V8-1
											콜로이드(Colloid)		-	WS	-	WS	WS	WS	-	C	C
초산 내성 (Acetic acid tolerance)		-	-	-	-	-	-	-	+	+
pH 내성 (tolerance)	3.5	++	+	+	-	+	++	-	+	++
	3.3	++	-	-	-	+	++	-	+	+
	3.1	+	-	-	-	-	+	-	-	-
과산화(Overoxidation)		-	-	-	-	-	-	-	-	-

'C': 콜로이드(colloid), 'WS': 흰 막+침전물(white film+sediment)

<1-3> 초산 생성능 확인

본 발명자들은 복분자 식초 제조용 종초(Mother vinegar, vinegar starter)을 선발하기 위해 상기 표 1의 균주들의 초산 생성 분석을 실시하였다.

구체적으로, 초산 생성능은 시험배지(D-glucose 10 g/L, glycerol 10 mL/L, polypeptone 2 g/L, yeast extract 2 g/L, potato extract 100 mg/L, acetic acid 10 mL/L, ethanol 40 mL/L)에 초산균을 30℃에 5일간 진탕 배양하여 2일마다 적정산도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 상위 4종의 균주 A. malorum V5-7, A. pasteurianus Gam2, Ga . intermedius V11-5 및 A. malorum KACC12222가 발효 3일 이후부터 식초 발효에 필요한 총 산의 4% 이상을 생성하는 것을 확인하였으며 가장 높은 산 생성능을 보였다(도 1). 상위 4종 외 A. pasteurianus KACC13994, A. pasteurianus KACC92047P 및 Ga . entanii RDA-S 균주도 발효 5일 이후에는 총 산이 3% 이상 될 것으로 예상되어, 초산균 7 균주는 종초로써 가능성을 확인하였다.

<1-4> 종초 ( Mother vinegar ) 제조 및 초산 발효 확인

종초(vineger starter, mother vinegar)는, 새롭게 식초덧을 담글 때 쓰이는 종(種)이 되는 초이다. 일반 발효에서는 순수배양균에서부터 확대배양하여 사용하지만 초의 제조에는 발효 종료액의 일부만 남겨 종초로 하던지 혹은 정상적인 발효를 하고 있는 초덧을 쓰는 경우가 많다. 우량 종균은 균막을 빠르게 늘려 균막의 노화가 늦고 발효가 종료될 때까지 막을 보존함으로써 산 생성의 속도가 빠르며, 산 생성이 끝까지 진행되어 원하는 농도까지 산을 생산하고 생성된 초산을 산화하지 않고 발효액을 혼탁시키지 않아서 제품의 정제가 용이하다. 본 발명자들은 상기 실시예 <1-3>에서 식초 발효 적합 균주로 선정된 4종의 균주를 이용하여 종초 제조 및 초산 발효능을 확인하고자 하기와 같은 실험을 실시하였다.

구체적으로, 본 실험에 사용된 균주는 상기 실시예 <1-3>에서 선별한 A. acetii KCTC1010, A. pasteurianus KACC92047P, A. pasteurianus gam2 및 A. malorum V5-7이다. 상기 4 종의 초산균을 이용하여 종초 제조를 실시하였다. 우선, 앰플(ample)에 동결건조된 각 균주를 액체 배지 10 mL에 배양 후, 2~3회 계대배양을 실시하였다. 이후, 원심분리하여 펠렛(pellet)을 수거한 후, 복분자 술의 희석액(알코올 6%) 100 mL에 접종하였다. 상기 접종한 액을 30℃, 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 발효 3일 후,복분자 술(알코올 6%) 200 mL을 첨가하여 시간에 따른 적정산도를 하기 식을 통해 도출하였다.

적정산도(Titratable acidity, TA) :

('F' = 1.002, 'df' = 희석지수(dilution factor))

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 복분자 술에서 A. pasteurianus KACC92047P 및 A. pasteurianus gam2 두 균주가 초산 발효를 활발히 하였으며, 초산 발효 3일째 산도 3%를 초과하였다. A. malorum V5-7 및 A. aceti KCTC1010는 복분자 술에서 초산 발효에 어려운 것으로 나타났다(도 2). 이에, 본 발명자들은 A. pasteurianus KACC92047P 균주를 복분자 식초 제조에 사용할 균주로 선정하였다.

< 실험예 1> 복분자 알코올 발효액 제조시 가수량에 따른 초산 발효에의 영향

<1-1> pH 및 산도에의 영향 확인

본 발명자들은 복분자 식초 제조 과정으로써, 복분자 알코올 발효액 제조를 위한 물의 첨가량에 따라 초산 발효 과정에 미치는 영향을 분석하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-4>에서와 같이 선별된 A. pasteurianus KACC92047P를 이용하여 복분자 술(알코올 6%)에 30℃에서 7일간 정치배양하여 종초를 제조하였다. 복분자즙액에 첨가하는 물의 첨가량은 0, 50%, 100%, 150% 및 200%(v/v)으로 설정하여 복분자 알코올 발효액을 제조하였다. 복분자 알코올 발효액은 설탕을 첨가하여 당도가 최종 20~24°Brix(w/v)가 되도록 조정한 다음, 메타중아황산칼륨을 100 ppm(w/v)을 넣어 살균과정을 거쳤다. 약 4~5시간 지난 후 효모를 200 ppm(w/v)를 넣은 다음 저어준 후, 25℃ 조건에서 알코올 발효를 약 7~10일간 진행하였다. 상기 복분자 알코올 발효액에 상기 제조한 종초를 복분자 알코올 발효액의 10% (v/v)를 넣어 30℃ 조건에서 약 10~12일간 초산 발효시켰으며, 초산 발효 과정의 pH, 산도(acidity) 측정 및 초산 발효 후의 품질 특성을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 pH의 경우, 초산 발효 1~7일 동안 pH가 서서히 낮아졌으며, 첨가한 물의 양이 많을수록 pH가 조금 더 낮은 경향을 나타내었다. 초산 발효 7일째 가장 낮은 pH를 보였으며 이후 조금 높아지는 것을 확인하였다(도 3a). 또한 도 3b에 나타낸 바와 같이 산도의 경우, 모든 경우 발효 1~7일 동안 서서히 높아졌으며, 발효 11일째 5.2~6.1%로 나타나는 것을 확인하였다(도 3b). 가수량이 100%인 경우가 가장 높은 산도를 나타내었으며, 가수량(물의 첨가량)이 150% 이상인 경우, pH는 낮았지만 산도는 가수량 150% 이하의 경우보다 높지 않았다.

<1-2> 복분자 식초의 기호도 확인

본 발명자들은 가수량에 따라 상기 실험예 <1-1> 방법으로 제조된 복분자 식초의 기호도 평가를 하였다. 기호도 평가는 복분자 식초의 색, 향, 맛 그리고 전반적인 기호도에 대해 9점 척도법으로 10명의 패널을 대상으로 평가하였다. 통계분석은 SPSS (V12)를 사용하여 분산분석(ANOVA) 통해 유의성을 검정하였다.

그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 향과 맛은 처리구에 따른 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 색은 가수량 100%의 경우 가장 높은 기호도를 나타내었으며, 전반적인 기호도는 가수량 0%, 50% 및 100%가 가수량 150% 및 200% 보다 우수한 것으로 유의적인 차이를 나타내는 것을 확인하였다(표 3).

가수량	색	향	맛	전반적인 선호도
0%	5.30 a,b	6.40 a	6.40 a	7.20 b
50%	6.50 a,b	5.80 a	7.00 a	7.60 b
100%	7.30 b	6.30 a	6.00 a	7.70 b
150%	5.30 a	5.40 a	5.40 a	3.90 a
200%	5.20 a	5.10 a	5.40 a	3.40 a

<1-3> 복분자 식초의 색도 확인

본 발명자들은 가수량에 따라 상기 실험예 <1-1> 방법으로 제조된 복분자 식초의 색도를 분석하였다.

구체적으로, 색차계(UltraScan Pro Spectrophotometer, HunterLab Co., VA, USA)를 사용하여 헌터값(Hunter values)인 명도(lightness, L*), 적색정도(redness, a*) 및 황색정도(yellowness, b*)를 측정하였다.

그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 색도의 L값은 가수량이 높을수록 24.12로 밝게 나타났다. a값 또한 가수량이 높을수록 2.93으로 붉은색에 가깝게 나타났으며, b값도 유사한 패턴을 나타내었다(표 4).

가수량	헌터값(Hunter’s color value)
	L	a	b
0%	23.53±0.14 a	-0.02±0.10 a	-0.46±0.07 a
50%	23.63±0.18 a,b	0.47±0.13 b	-0.32±0.10 a
100%	23.80±0.24 a,b,c	1.13±0.12 c	-0.12±0.06 b
150%	24.06±0.25 b,c	2.82±0.09 d	0.26±0.05 c
200%	24.12±0.30 c	2.93±0.04 d	0.33±0.12 c

<1-4> 복분자 식초의 유기산( organic acids ) 확인

본 발명자들은 가수량에 따라 상기 실험예 <1-1> 방법으로 제조된 복분자 식초의 유기산(organic acids)을 분석하였다.

구체적으로, 유기산 분석은 HPLC (Chromaster 5000, Hitachi, Ltd, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다. 유기산 분석은 ODS-100W (4.6 mm × 250.0 mm) column을 연결하여 사용하였다. 이동상은 3 mM perchloric acid를 사용하였으며, flow rate는 0.6 mL/min, column oven의 온도는 63℃로 하였다. 분리물은 반응용액(0.2 mM bromothymol blue, 15 mM Na₂HPO₄, 2 mM NaOH)과 반응한 후 UV 440 nm에서 검출하였다. 이때 반응용액의 flow rate는 1.2 mL/min, 반응온도는 30℃로 하였다. 시료 2 mL을 17,000 rpm에서 15분간 원심분리 시킨 다음, 0.45 ㎛ membrane filter (Millipore Co., Befford, MA, USA)로 여과시킨 후, Sep-pak C18 cartridge (Waters Oasis, Milfort, MA, USA)로 색소를 제거하여 사용하였다.

그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이 초산과 구연산이 주요한 유기산으로 나타났으며 가수량이 높을수록 구연산의 함량이 적게 검출되는 것을 확인하였다(표 5). 초산 함량은 가수량(산도)과 상관관계를 보이지 않았으며, 이는 복분자 자체 유래의 유기산에 의해 영향을 받은 것으로 나타났다.

가수량	수산(Oxalic)	말릭산(Malic)	초산(Acetic)	구연산(Citric)	숙신산(Succinic)
0%	nd	18.99	4029.72	585.11	nd
50%	nd	27.13	4166.66	371.86	44.58
100%	nd	54.03	3971.44	322.51	45.85
150%	nd	32.34	3898.00	237.36	47.73
200%	nd	12.39	4111.19	226.09	64.93

단위: ppm

<1-5> 복분자 식초의 폴리페놀 및 안토시아닌 함량 확인

본 발명자들은 가수량에 따라 상기 실험예 <1-1> 방법으로 제조된 복분자 식초의 총 폴리페놀과 총 안토시아닌 함량을 분석하였다.

구체적으로, 총폴리페놀 및 총안토시아닌 함량은 증류수로 희석한 복분자 식초 시료 1 mL에 0.2 M sodium acetate (pH 1.0) 9 mL를 넣어 총폴리페놀은 280 nm, 총안토시아닌은 520 nm에서 측정하였다. 총폴리페놀은 gallic acid 표준용액을 검량선으로, 총안토시아닌은 malvidin-3-glucoside 표준용액을 검량선으로 환산하여 나타내었다.

그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 총 폴리페놀과 총 안토시아닌은 가수량이 높을수록 감소하였으며, 총 폴리페놀의 경우 가수량 200%일 때 약 20%의 감소량을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 총 안토시아닌 함량의 경우 가수량에 의해 감소되는 비율이 적은 것으로 나타났다(표 6).

가수량	폴리페놀(polyphenol)(ppm)	안토시아닌(anthocyanin)(ppm)
0%	45.39	616.53
50%	41.20	611.07
100%	38.32	609.67
150%	37.13	605.47
200%	36.56	605.20

< 실험예 2> 복분자 알코올 발효액의 알코올 농도에 따른 초산 발효에의 영향

<2-1> pH 및 산도에의 영향 확인

본 발명자들은 복분자 알코올 발효액의 알코올 농도에 따른 초산 발효에의 영향을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-4>에서와 같이 선별된 A. pasteurianus KACC92047P를 이용하여 복분자 술(알코올 6%)에 30℃에서 7일간 정치배양하여 종초를 제조하였다. 상기 제조한 종초를 이용하여 복분자 식초를 제조하기 위해, 상기 실험예 <1-1>에서와 같이 알콜 발효액을 제조하였으며, 복분자의 농도는 50%로 설정하였고 복분자 식초의 초산 발효를 위한 초기 복분자 알코올 농도는 5, 6, 7 및 8%로 설정하였고, 초산 발효 과정의 pH, 당도(soluble solid), 산도(acidity) 측정 및 초산 발효 후의 품질 특성을 상기 실험예 <1-1>과 같이 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 pH의 경우, 발효 1~9일 동안 pH가 서서히 낮아졌으며 알코올 도수가 높은 8%는 거의 낮아지지 않는 것을 확인하였다(도 4a). 당성분은 큰 변화가 없는 것으로 나타났다(도 4b). 또한, 산도는 최종 발효 후 2.0~5.6%으로 나타났으며, 알코올 농도가 높은 7~8%의 경우, 초산발효가 더딘 것을 확인하였다(도 4c).

<2-2> 복분자 식초의 기호도 확인

본 발명자들은 복분자 식초의 초기 알코올 농도(5, 6, 7, 8%)에 따른 기호도 평가를 상기 실험예 <1-2>와 같이 실시하였다.

그 결과, 표 7에 나타낸 바와 같이 알코올 농도가 낮은 5~6%으로 발효된 식초가 색, 향, 맛 그리고 전반적인 기호도에서 높은 평가를 받은 것을 확인하였다(표 7). 이는 알코올 농도가 높은 처리구의 경우 초산 발효의 진행이 늦어 식초보다는 술과 식초의 중간 정도의 상태에 있기 때문인 것으로 판단하였다.

알콜함량	색	향	맛	전반적 선호도
5%	6.0 a,b	6.1 a	5.9 a	6.4 a
6%	7.1 a	6.1 a	6.0 a	6.4 a
7%	5.1 b,c	4.8 a,b	3.5 b	4.1 b
8%	4.3 c	4.1 b	3.3 b	2.8 b

<2-3> 복분자 식초의 유기산( organic acids ) 확인

본 발명자들은 복분자 식초의 초기 알코올 농도(5, 6, 7, 8%)에 따른 유기산을 분석을 상기 실험예 <1-4>와 같이 실시하였다.

그 결과, 표 8에 나타낸 바와 같이 초산과 구연산이 주요한 유기산으로 나타나는 것을 확인하였다(표 8). 또한, 알코올 농도가 낮은 5~6%으로 발효된 식초의 유기산 함량이 알코올 농도가 높은 7~8%으로 발효된 식초보다 높게 검출되는 것을 확인하였다(표 8). 이는 알코올 농도가 높은 경우 초산 발효가 진행되지 못했기 때문인 것으로 판단하였다.

알콜함량	수산(Oxalic)	말릭산(Malic)	초산(Acetic)	구연산(Citric)	숙신산(Succinic)
5%	nd	56.10	3589.07	303.86	35.39
6%	nd	49.24	3719.00	332.11	43.30
7%	nd	52.66	2620.91	395.86	55.62
8%	nd	55.28	1417.63	391.04	69.66

단위 : ppm

< 실험예 3> 복분자 식초의 현탁입자 분리 방법 확인

본 발명자들은 응집제 처리에 따른 복분자 식초의 현탁 입자 분리 정도를 조사하기 위해, 중력침강법, 응집제(카제인, 젤라틴, 키토산) 처리, 규조토프리코팅 감압여과 및 원심분리여과 효과를 비교하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-4>에서 선별된 A. pasteurianus KACC92047P를 이용하여 복분자 술(알코올 6%)에 30℃에서 7일간 정치배양하여 종초를 제조하였다. 상기 실험예 <1-1>에서와 같이 알콜발효액을 제조하기 위해 복분자의 농도는 50%로 설정하였으며 복분자 식초의 초산 발효를 위한 초기 알코올 농도는 6%으로 설정하여 복분자 식초를 제조하였다. 상기 제조한 복분자 식초에 응집제를 각각 1%(w/v)만큼 첨가하여 응집제 사용에 따른 현탁입자 분리 정도를 측정하였다. 또한, 원심분리여과를 위해 2,000, 4,000 및 8,000 rpm으로 원심분리하였다. 그리고 규조토프리코팅법은 여과지 위에 규조토를 평평하게 펴주어 압력을 가하여 규조토를 통과하여 식초가 여과되도록 하였다. 대조군으로써 중력침강법으로 설정하였다.

그 결과, 표 9에 나타낸 바와 같이 응집제 처리시 중력침강법과 유의적인 차이를 보이지 않는 것을 확인하였다. 키토산의 경우 오히려 탁도가 증가하였고, 규조토와 카제인은 중력침강법에 비해 탁도가 감소하는 것을 확인하였다(표 9).

첨가제(Additives)	탁도(Turbidity)(O.D. at 660 nm)
대조군(중력침강법)	0.116
카제인(Casein)	0.095
젤라틴(Gelatin)	0.098
키토산(Chitosan)	0.120
규조토(Diatomite)	0.093

또한, 표 10에 나타낸 바와 같이 중력침강법 및 물리적 처리(원심분리, 규조토프리코팅 여과)에 의한 현탁 입자 분리 정도를 비교한 결과, 원심분리 및 규조토프리코팅 여과에 의한 탁도의 감소 변화를 확인하였다. 원심분리 8,000 rpm 이상시 중력침강법에 비해 약 10배 가량의 탁도 감소를 나타내었다. 또한, 규조토프리코팅 여과의 경우 원심분리 2,000 rpm에 의한 효과와 유사하게 나타나는 것을 확인하였다(표 10).

	탁도(Turbidity)(O.D. at 660 nm)
대조군(중력침강법)	0.114
원심분리(2,000 rpm)	0.031
원심분리(4,000 rpm)	0.020
원심분리(8,000 rpm)	0.016
규조토프리코팅 여과(Diatomite filter)	0.030

< 실험예 4> 복분자 식초의 저장 중 품질유지 관리 방법 확인

<4-1> 갈변 억제 첨가제에 의한 복분자 식초 내 폴리페놀 산화효소( polyphenol oxidase ; PPO ) 활성 억제 효과 확인

갈변은 세포 내에 존재하는 카테킨(catechin), 티로신(tyrosine)과 같은 폴리페놀(polyphenol) 화합물이 폴리페놀 산화효소(polyphenol oxidase; PPO)의 작용으로 산화되어 테아플라빈(theaflavin), 멜라닌(melanin) 등의 색소를 형성하며 일어나는 현상이다. 본 발명자들은 복분자 식초의 저장 중 갈변현상이 PPO에 의해 갈변 되는지, 그리고 갈변 억제 첨가제를 처리하였을 때의 갈변 효과를 확인하고자 하기와 같은 실험을 실시하였다.

구체적으로, 갈변 억제 첨가제로써 구연산, 수산, 비타민 C 및 PVPP(Polyvinylpolypyrrolidone)를 사용하였다. 시험 조건으로는 알코올 발효 전 및 초산 발효 전에 상기 첨가제를 0.1% 첨가한 후 폴리페놀 산화효소(PPO) 활성을 측정하였다. 폴리페놀 산화효소 활성의 측정은 복분자식초 시료 5 mL에 1% carbowax 6000이 함유된 0.1M phosphate buffer (pH 6.5) 10 mL를 혼합하여 추출한 후 각각을 8000 rpm으로 20분간 원심분리하여 얻어진 상등액을 조효소추출물로 간주하였다. 이때, 최종 부피가 3 mL가 되도록 0.1M phosphate buffer (pH 6.5) 1.2 mL, 조효소추출물 0.3 mL, 기질로서 5 mM chlorogenic acid 1.5 mL를 혼합, 반응시킨 다음 마이크로 플레이트 리더(SYNERGY MX, BioTek, Winooski, Vermont, USA)로 420 nm에서 흡광도를 측정하여 효소 활성으로 나타내었다.

그 결과, 표 11에 나타낸 바와 같이 초산 발효 전에 첨가하는 것이 알코올 발효 전에 첨가하는 것보다 폴리페놀 산화효소의 활성이 억제되었으며, 첨가제 중 구연산 및 수산(옥살산)의 효과가 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다(표 11).

갈변 억제 첨가제에 의한 복분자 식초 내의 폴리페놀 산화효소(PPO) 활성

	알코올 발효 전 첨가					초산 발효 전 첨가
	발효전	초산발효시작	초산발효종료	저장 10일후	저장 30일후	초산발효시작	초산발효종료	저장 10일후	저장 30일후
대조군	0.34±0.001a	0.14±0.001c	0.19±0.001d	0.34±0.001a	0.21±0.001b	0.14±0.001	0.21±0.000a	0.23±0.002a	0.24±0.001a
비타민C	0.31±0.002c	0.13±0.004d	0.19±0.002d	0.17±0.002e	0.19±0.001c	0.14±0.001	0.17±0.002d	0.17±0.001c	0.19±0.002c
PVPP	0.31±0.003b	0.24±0.002a	0.30±0.001a	0.33±0.001a	0.35±0.001a	0.16±0.001	0.20±0.002b	0.21±0.001b	0.19±0.001b
구연산	0.30±0.001d	0.14±0.001c	0.20±0.000c	0.20±0.002c	0.18±0.001d	0.14±0.001	0.20±0.003c	0.21±0.001b	0.17±0.001e
수산	0.29±0.001e	0.15±0.001b	0.23±0.001b	0.24±0.004b	0.35±0.002a	0.13±0.001	0.17±0.001d	0.17±0.001d	0.17±0.001d

<4-2> 갈변 억제 첨가제에 의한 복분자 식초 내의 총 폴리페놀 함량 확인

본 발명자들은 갈변 억제 첨가제에 따른 복분자 식초의 저장 중 총 폴리페놀 함량 변화를 확인하기 위하여 상기 실험예 <1-5>와 같은 방법으로 분석을 실시하였다.

그 결과, 표 12에 나타낸 바와 같이 알코올 발효 전 및 초산 발효 전 첨가 모두 갈변 억제 첨가제에 의한 유의적인 변화를 나타내지 않는 것을 확인하였다(표 12).

갈변 억제 첨가제에 의한 복분자 식초 내의 총 폴리페놀 함량

	알코올 발효 전 첨가					초산 발효 전 첨가
	발효전	초산발효시작	초산발효종료	저장 10일후	저장 30일후	초산발효시작	초산발효종료	저장 10일후	저장 30일후
대조군	1502.75±69.887a	752.06±44.194a	585.39±20.624b	674.98±258.098c	499.98±5.893bc	1215.25±65.396a	1062.48±275.221a	958.31±141.850a	1056.92±204.393a
비타민C	1172.89±114.905b	397.20±62.685a	254.14±41.248c	748.59±86.636b	689.56±156.153b	949.98±195.966b	790.25±74.807b	841.64±44.096b	1091.64±195.567a
PVPP	1458.31±274.273a	1099.98±77.168b	1064.56±38.302a	1043.73±173.830a	964.56±73.657a	1158.31±305.704a	895.81±336.366a	808.31±101.036b	1026.36±165.324a
구연산	1266.64±11.785b	664.56±20.624c	370.81±166.458c	570.81±5.893c	530.53±249.734c	879.14±146.012b	966.64±213.234a	795.81±105.656b	1006.92±243.682a
수산	1549.98±88.388a	723.59±25.459c	514.56±2.946b	415.25±17.347c	641.64±82.496bc	895.81±22.048b	961.09±117.581b	898.59±39.602b	923.59±48.829a

<4-3> 갈변 억제 첨가제에 의한 복분자 식초 내의 총 안토시아닌 함량 확인

본 발명자들은 갈변 억제 첨가제에 따른 복분자 식초의 저장 중 총 안토시아닌 함량 변화를 확인하기 위하여 상기 실험예 <1-5>와 같은 방법으로 분석을 실시하였다.

그 결과, 표 13에 나타낸 바와 같이 알코올 발효 전 첨가시에는 유의적인 변화가 없었으나, 초산 발효 전에 첨가한 경우에는 총 안토시아닌 함량이 높게 유지 되는 것을 확인하였으며, 갈변 억제 첨가제 중 수산(옥살산)이 가장 효과가 높게 나타났다(표 13).

갈변 억제 첨가제에 의한 복분자 식초 내의 총 안토시아닌 함량

	알코올 발효 전 첨가					초산 발효 전 첨가
	발효전	초산발효시작	초산발효종료	저장 10일후	저장 30일후	초산발효시작	초산발효종료	저장 10일후	저장 30일후
대조군	490.31±22.774c	214.90±7.512d	166.27±10.666c	144.41±1.639c	142.77±2.839d	654.31±25.259d	554.31±9.547c	512.65±0.000c	466.81±3.608c
비타민C	505.07±7.512b	175.01±7.392e	144.41±3.279d	94.68±0.946d	66.27±3.413e	683.48±20.091c	595.98±13.010b	393.90±6.250e	220.98±3.608d
PVPP	549.87±11.630a	401.79±12.377a	334.03±2.504a	267.91±9.465a	216.54±11.821a	645.98±9.547d	585.56±31.458c	527.23±19.094b	491.81±9.547b
구연산	502.88±16.745b	228.02±4.337c	176.65±0.946b	169.00±7.512b	152.61±2.839c	716.81±15.729b	614.73±13.010b	466.81±3.608d	470.98±15.729c
수산	522.00±49.080a	270.09±6.625b	184.85±6.625b	177.20±7.146b	201.79±3.279b	725.15±39.031a	677.23±18.042a	616.81±7.217a	589.73±9.547a

<4-4> 갈변 억제 첨가제에 의한 복분자 식초의 갈색도 확인

본 발명자들은 갈변 억제 첨가제에 따른 복분자 식초의 저장 중 갈색도의 변화를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

구체적으로, 갈색도는 복분자 식초 시료 일정량을 취하여 마이크로 플레이트 리더(SYNERGY MX, BioTek, Winooski, Vermont, USA)를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 표 14에 나타낸 바와 같이 알코올 발효 전 첨가한 경우 유의적인 차이가 없었으나, 초산 발효 전에 첨가한 경우에는 갈색도가 대조군보다 낮게 유지 되는 것을 확인하였다. 또한, 첨가제 중 비타민 C에 의한 갈변 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다(표 14).

갈변 억제 첨가제에 의한 복분자 식초의 갈색도

	알코올 발효 전					식초 발효 전
	발효전	초산발효시작	초산발효종료	저장 10일후	저장 30일후	초산발효시작	초산발효종료	저장 10일후	저장 30일후
대조군	0.31±0.004d	0.34±0.005b	0.17±0.001c	0.17±0.001d	0.16±0.001d	0.18±0.002c	0.24±0.001	0.24±0.002ab	0.27±0.001a
비타민C	0.44±0.023ab	0.21±0.002d	0.17±0.001c	0.18±0.001d	0.19±0.003c	0.18±0.001c	0.22±0.001	0.20±0.001c	0.19±0.001d
PVPP	0.35±0.001c	0.41±0.027a	0.45±0.004a	0.37±0.001a	0.38±0.003a	0.19±0.002bc	0.23±0.001	0.25±0.005ab	0.25±0.001b
구연산	0.46±0.005a	0.28±0.000c	0.15±0.002d	0.20±0.004c	0.22±0.002b	0.19±0.002b	0.24±0.001	0.25±0.000a	0.26±0.000b
수산	0.41±0.002b	0.27±0.001c	0.20±0.002b	0.23±0.004b	0.38±0.010a	0.22±0.000a	0.24±0.001	0.23±0.001b	0.24±0.001c

<4-5> 갈변 억제 첨가제에 의한 복분자 식초 내의 유기산 함량 확인

본 발명자들은 갈변 억제 첨가제에 따른 복분자 식초의 저장 중 유기산 함량의 변화를 확인하기 위해 상기 실험예 <1-4>와 같이 분석하였다.

그 결과, 표 15에 나타낸 바와 같이 알코올 발효 전 첨가의 경우 저장 중 비타민 C에 의하여 초산의 감소가 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 알코올 발효 전 PVPP를 첨가한 경우 초산 발효시 초산 생성이 저조한 것을 확인하였다(표 15). 이는 알코올 발효시 발효에 문제가 있는 것으로 판단되었다. 초산 발효 전 첨가한 경우, 알코올 발효 전 첨가한 경우에 비해 초산의 유기산 함량은 낮았지만, 저장 중 감소율은 낮은 것으로 나타났다(표 15). 또한, 초산 발효 전 첨가제 중 수산(옥살산)의 경우, 초산 발효를 저해하는 것으로 나타났다.

갈변 억제 첨가제에 의한 복분자 식초 내의 유기산 함량

			수산	말릭산	초산	구연산	숙실산
알코올 발효 전 첨가제	발효 전	대조군	44.1	nd	15.2	907.8	0
		비타민C	33.1	27.8	12.4	950.7	0
		PVPP	49.9	56.8	31.5	937.5	17.2
		구연산	40.2	12.2	0	1057.5	0
		수산	138	20.8	0	822.6	18.5
	초산 발효 시작	대조군	9.9	59.7	364.7	216.2	78.3
		비타민C	13.9	17.1	311.1	250.4	98.8
		PVPP	0	53.8	265	402.4	107
		구연산	13.2	28	372.1	237.4	54.9
		수산	19.3	55.8	359.1	220.7	62.5
	초산발효 종료	대조군	20.1	29.9	4942	324.4	45.4
		비타민C	18.1	19.8	5161.7	306.7	23.9
		PVPP	0	73.3	444.4	535	164.3
		구연산	19.4	17.1	4587	353.6	21.6
		수산	13.1	22.2	5713.8	344	66.6
	저장 10일 후	대조군	22.5	36.4	4643.3	315.5	13.2
		비타민C	63.1	35.1	4778.9	297.6	0
		PVPP	0	60.1	458.4	521.3	163.8
		구연산	26.6	18.5	4786.1	351.4	62.9
		수산	13.1	36.5	5818.3	352.6	46.1
	저장 30일 후	대조군	10.4	24.9	3694.6	226.4	49.3
		비타민C	18.6	40.5	4139.7	225.3	31.8
		PVPP	0	65.3	416.8	501.4	158
		구연산	11.2	30.9	4413.9	339.7	31.8
		수산	12.3	66	4449.9	515.4	160.9
초산 발효 전 첨가제	초산 발효 시작	대조군	16.5	45.8	362.3	350.8	101.7
		비타민C	12.5	84.2	354.3	365.2	89.8
		PVPP	16.3	68.4	370.3	341.6	73.4
		구연산	0	75.6	323.9	410.9	103.6
		수산	87.1	60.4	342.6	355.6	74
	초산발효 종료	대조군	21.9	52.9	3359.3	413.9	29.2
		비타민C	0	61.8	2949.3	397.1	33.7
		PVPP	18.4	67.9	3092.3	384.3	55.6
		구연산	26.9	51.7	3012.9	463.7	43.8
		수산	76.4	55.8	362.5	360.6	62.7
	저장 10일 후	대조군	16.4	75.7	3262.7	397.7	53
		비타민C	18.6	53.8	2934.5	369.6	21.5
		PVPP	22.7	57.1	3120.4	385	47.9
		구연산	17.4	73.7	3026.9	493.1	53.9
		수산	81.5	61	370.2	336.6	88.1
	저장 30일 후	대조군	20.9	45.4	3057.9	348.9	29.8
		비타민C	29.9	37.4	2834.7	378.3	56
		PVPP	23.6	35.4	3109.8	370.3	32.1
		구연산	14.2	53.2	2978.1	451	54.6
		수산	81.8	55.8	410.8	415.5	112.3

<4-6> 살균 및 여과에 따른 복분자 식초의 침전 생성 억제 확인

식품의 살균 공정 중 큰 영향을 미치는 환경인자는 pH로 알려져 있다. 식품은 pH 6.0 이상의 비산성 식품, pH 4.5 ~ 6.0의 저산성 식품, pH 4.5 이하의 산성 식품으로 분류되며 미생물의 내열성은 pH 중성에서 가장 높으며 pH 산성 및 알칼리에서는 매우 약한 것으로 알려져 있다. pH 4.5를 분기점으로 하여 pH 4.5 이하 식품은 대기압에서 저온살균을 실시하며, pH 4.5 이상 식품은 100 이상에서 가압살균을 한다. 본 발명자들은 살균에 따른 본 발명의 복분자 식초의 침전 생성 억제 및 품질특성을 분석하였다.

구체적으로, 본 실험의 대상인 복분자 식초는 pH 4.5 이하의 식품으로, 대기압에서 저온살균 하였으며 저온살균의 온도는 무처리, 40, 50, 60 및 70℃로 설정하였고 살균시간은 30분으로 실시하였다. 살균 전 여과하지 않은 군과 여과한 군(규조토프리코팅)을 비교하였다. 살균 효과를 확인하기 위하여 초산균 수 측정 및 품질 분석을 실시하였다.

그 결과, 표 16에 나타낸 바와 같이 여과 전 및 후에 따라 발효 식초의 pH, 당 및 산도의 변화는 나타나지 않는 것으로 나타났다. 여과한 실험군에서는 초산균이 검출되지 않아 여과만으로도 제균의 효과를 나타내었다. 살균 온도에 따른 살균 효과의 경우, 70℃에서 초산균이 검출되지 않아 저온살균의 온도는 70℃가 적당한 것으로 나타났다. 또한, 살균 온도가 높아짐에 따라 산도의 감소를 확인하였다(표 16).

여과 및 살균에 의한 복분자 식초 내의 pH, 당도, 산도 및 균 수

처리	pH	당도(Soluble solid)	산도(Titratable acidity) (%)	log CFU/mL
여과전	2.86	3.5	4.23	4.15
여과전 40℃	2.86	3.5	4.2	4.38
여과전 50℃	2.85	3.5	4.21	4.5
여과전 60℃	2.85	3.5	4.21	3.9
여과전 70℃	2.85	3.5	4.2	nd
여과후	2.89	3.5	4.25	nd
여과후 40℃	2.89	3.4	4.19	nd
여과후 50℃	2.88	3.4	4.17	nd
여과후 60℃	2.88	3.5	4.19	nd
여과후 70℃	2.88	3.4	4.18	nd
여과후 울트라필터	2.89	3.4	4.12	nd

nd; 미검출(not detected)

국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC92047P 20150310

Claims (8)

1) 복분자 또는 복분자즙을 알콜발효(alcohol fermentation)하여 알콜발효액을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 알콜발효액에 초산균으로써 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) KACC92047P를 이용한 종초(vineger starter)를 첨가한 후 초산발효(acetic acid fermentation)하여 초산발효물을 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 초산발효물을 여과 또는 살균하는 단계;
를 포함하는 복분자 식초의 제조 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 복분자 또는 복분자즙은 50 내지 75%(v/v) 농도인 것을 특징으로 하는 복분자 식초의 제조 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 1)에서 복분자 또는 복분자즙에 물을 50 내지 100%(v/v) 첨가하는 것을 특징으로 하는 복분자 식초의 제조 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 알콜발효액은 초기 알콜 농도가 5 내지 6%(v/v) 농도인 것을 특징으로 하는 복분자 식초의 제조 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 초산발효 전에 갈변 억제제를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 복분자 식초의 제조 방법.

제 5항에 있어서, 상기 갈변 억제제는 비타민 C 또는 구연산인 것을 특징으로 하는 복분자 식초의 제조 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 여과는 원심분리 또는 규조토프리코팅법으로 여과시키는 것을 특징으로 하는 복분자 식초의 제조 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 살균은 여과를 하지 않은 경우 70℃ 온도에서 살균하고, 여과를 한 경우 40 내지 70℃ 온도에서 살균하는 것을 특징으로 하는 복분자 식초의 제조 방법.

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