KR20210057873A - 아세토박터 파스테우리아누스 a37 초산균 및 상기 초산균을 이용한 꾸지뽕 발효식초 제조방법 - Google Patents

아세토박터 파스테우리아누스 a37 초산균 및 상기 초산균을 이용한 꾸지뽕 발효식초 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균 및 상기 초산균을 이용한 꾸지뽕 발효식초 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 고알코올 농도에서도 고농도의 초산을 생성하여 알코올 내성과 산 생성능이 우수하며 향기 생성능도 뛰어난 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균을 분리 동정하고, 상기 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균을 이용하여 꾸지뽕 발효식초를 제조한 결과 초기 pH 4, 20℃의 조건에서 산 생성능, 항산화능 및 기능성 성분의 함량이 높은 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 꾸지뽕 발효식초의 제조 방법은 낮은 온도에서 빠른 효율로 초산발효를 시킬 수 있고, 항산화능 및 기능성 성분의 함량이 높은 꾸지뽕 발효식초를 제조할 수 있는 이점이 있다.

Description

아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균 및 상기 초산균을 이용한 꾸지뽕 발효식초 제조방법{Acetobacter pasteurianus A37 and manufacturing method of fermented Kujippong vinegar using the same}
본 발명은 산 생성능, 알코올 내성 및 향기 생성능이 우수한 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균 및 상기 초산균을 이용한 꾸지뽕 발효식초 제조방법에 관한 것이다.
식초는 동서양을 막론하고 오랜 옛날부터 제조, 이용되어온 발효식품의 하나이며, 일상생활에서 쉽게 사용되는 신맛을 가지는 대표적인 조미료이다. 식초는 제조방법에 따라 발효식초와 희석초산으로 구분된다. 발효식초는 곡류, 과실류, 주류 등을 주원료로 하여 발효시켜 제조한 식초이고, 희석초산은 빙초산 또는 초산을 음용수로 희석하여 만든 식초이다. 발효식초는 만드는 방법에 따라 천연 발효식초와 알코올 발효식초로 다시 나뉘는데 천연 발효식초는 알코올을 발효시켜 술을 만든 후 그것을 다시 초산발효시켜 만드는 것으로, 순도 96~99% 이상의 에틸알코올(주정)을 희석하여 초산을 발효시키는 알코올 발효식초에 비해 기능성 성분이 풍부하고 건강에 이롭다. 또한, 발효식초는 원료에 따라 크게 두 가지로도 구분되는데 곡물을 원료로 발효시킨 곡물식초와 과실을 원료로 발효시킨 과실식초가 대표적이다. 이러한 식초에 존재하는 다양한 유기산과 아미노산이 체내 에너지 대사에 관여함으로써, 피로물질인 젖산이나, 동맥경화증, 혈전증 등을 일으키는 과산화지질의 축적 및 생성을 억제한다. 또한, 식초는 비만을 방지하고 피부 건강과 미용에도 좋을 뿐만 아니라, 인체 내 독성제거 및 숙취제거 등에도 효능이 있다. 그 외 칼슘 흡수율 증가, 변비 해소, 눈의 피로 완화, 저항력 상승 등과 같이 다양한 생리활성을 나타내는 것이 보고되어 있다.
꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata (Carr.) Bureau ex Lavallee)는 구지뽕나무, 굿가시나무, 활뽕나무라 불리고 뽕나무과에 속하는 낙엽교목이다. 꾸지뽕나무의 뿌리껍질, 나무질부, 나무껍질 및 잎에는 인체에 유효한 다양한 성분이 포함되어 있어서, 전래로부터 꾸지뽕나무는 그 뿌리, 껍질, 줄기, 잎, 나무껍질, 열매 등 부위에 따라 혈압강하제, 결핵치료제, 해열제, 건해제, 거담제, 이뇨제, 지혈제, 거풍제 등의 약재로 이용되었으며, 항진균제로서 무좀에 사용하고 소화기관의 허약에 의한 만성소화불량에 이용되고 있다. 꾸지뽕나무의 열매는 취과로 둥글며 지름이 2.5 cm 내외이며, 9월∼10월에 적색으로 성숙하며, 과육은 달고 식용이 가능하다. 그 열매에는 비타민 B, B1,B2, C, 리놀레인산, 포도당, 말토오스, 프럭토오스, 사과산, 레몬산 등 유용한 유기물질이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한 꾸지뽕 열매는 항암효과가 있는 것으로 알려진 플라노보이드를 함유하고 있어서, 약재로 사용되고 있음이 동의보감, 약성감, 본초강목 등에서 고대로부터 널리 알려져 있으며, 최근에도 지속적인 연구가 이루어지고 있다. 꾸지뽕은 화학 요법이나 방사선 요법을 이용할 수 없는 환자들한테 적용하여 좋은 효과를 보고 있는데, 종양을 더 자라지 못하게 하거나 줄어들게 할 뿐만 아니라 통증을 가볍게 하고 식욕을 증진시켜서 몸무게를 늘려주고 복수를 없애주는 작용이 있다.
이러한 꾸지뽕에 함유된 다양한 생리활성 물질과 항산화 물질은 추출 이후에 불안정하고, 인체에 독성을 띄는 경우가 있어 안정화시키거나, 독성을 줄이거나, 안정한 유도체로 전환시켜 효과를 높이려는 시도가 많이 진행되고 있으며, 그 일환으로 미생물이나 효소를 이용한 생물전환(Biological transformation) 방법이 개발되고 있다. 생물전환의 대표적 방법으로는 발효를 예로 들 수 있으며, 이중 초산발효를 통해 제조되는 식초는 신맛을 내는 초산, 구연산, 젖산 등 유기산과 아미노산 등의 영양분을 만들고, 젖산분해 기능이 있어 피로회복 효과가 있으며, 혈액의 점도를 낮추고 혈관 내벽에 붙은 콜레스테롤을 제거하는 효과 등 건강 및 미용에 다양한 효능이 있다.
대한민국 등록특허 제10-1139032호에는 꾸지뽕 나무껍질을 이용한 꾸지뽕 식초 제조방법 및 이에 의해 제조된 꾸지뽕 식초를 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-1895521호에는 꾸지뽕 나무를 이용한 꾸지뽕 발효식초의 제조방법을 개시하고 있으나, 본 발명의 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균과 꾸지뽕 열매를 이용하여 제조한 꾸지뽕 발효식초는 개시된 바 없다.
식초를 제조하기 위해서는 알코올에 초산균을 접종하여 초산 발효시키는 과정이 필요하다. 고품질의 발효식초를 제조하기 위해서는 고농도의 알코올 농도 환경에서도 초산을 높은 효율로 생성하여야 하기 때문에, 알코올 내성이 있고, 산 생성능이 우수한 초산균을 분리하는 것이 필수적으로 필요하다.
이에, 본 발명자들은 알코올 내성을 가지면서도 고농도의 알코올에서 산 생성능이 우수하고 향기 생성능이 있어 과일식초 제조에 적합한 신규한 초산균을 분리 동정하였고, 분리한 초산균으로 꾸지뽕 발효식초를 제조한 결과 낮은 온도에서 빠른 시간 내에 산도가 상승하고, 기능성 성분의 함량이 높은 꾸지뽕 발효식초를 제조하는데에 성공하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 산 생성능, 알코올 내성 및 향기 생성능이 우수한 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균, 상기 초산균을 이용하여 초기 pH 4, 20℃에서 산 생성능이 우수하고 기능성 성분의 함량이 높은 꾸지뽕 발효식초의 제조방법 및 상기 방법을 이용하여 제조된 꾸지뽕 발효식초를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
수탁번호 KACC 92206P로 기탁된 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 꾸지뽕 착즙액을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조한 꾸지뽕 착즙액을 전처리하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 전처리가 완료된 꾸지뽕 착즙액을 발효시켜 꾸지뽕 발효주를 제조하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 꾸지뽕 발효주에 수탁번호 KACC 92206P로 기탁된 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 접종하여 꾸지뽕 발효식초를 제조하는 단계; 를 포함하는, 꾸지뽕 발효식초의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 꾸지뽕 발효식초를 제공한다.
본 발명은 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균 및 상기 초산균을 이용한 꾸지뽕 발효식초 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 고알코올 농도에서도 고농도의 초산을 생성하여 알코올 내성과 산 생성능이 우수하며 향기 생성능도 뛰어난 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균을 분리 동정하고, 상기 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균을 이용하여 꾸지뽕 발효식초를 제조한 결과 초기 pH 4, 20℃의 조건에서 산 생성능, 항산화능 및 기능성 성분의 함량이 높은 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 꾸지뽕 발효식초의 제조 방법은 낮은 온도에서 빠른 효율로 초산발효를 시킬 수 있고, 항산화능 및 기능성 성분의 함량이 높은 꾸지뽕 발효식초를 제조할 수 있는 이점이 있다.
도 1은 농가형 사업장으로부터 수집한 발효식초 38점으로부터 산 생성능이 우수한 초산균을 선별하기 위해, 탄산칼슘이 첨가된 고체배지를 이용하여 초산 생성에 의해 투명환을 형성하는지 여부를 관찰한 도이다.
도 2a 내지 도 2h는 탄산칼슘이 첨가된 고체배지를 이용하여 초산 생성에 의해 생성된 투명환의 크기를 나타낸 것으로, 초산균의 산 생성능을 정량적으로 평가한 도이다.
도 3a 내지 도 3h는 초산균의 정량적인 산 생성능을 측정하기 위해, 초산균이 생성한 초산의 산도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 알코올 내성을 가진 초산균을 선발하기 위해 6 내지 9%의 알코올 농도에서 각 초산균이 생성하는 산도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 선별한 초산균 11주의 형태학적 특성을 분석하기 위해, 각 초산균을 그람염색한 후, 현미경을 통해 검경한 도이다.
도 6은 선별한 초산균의 계통도이다.
도 7은 최종 선별한 3종류의 초산균(A26, A37 및 B7)을 이용하여 제조한 종초가 20℃ 및 30℃에서 생성한 투명환의 크기를 대조군(A.malorum)과 비교하여 나타낸 도이다.
도 8a 및 도 8b는 최종 선별한 3종류의 초산균(A26, A37 및 B7)을 이용하여 제조한 종초가 20℃ 및 30℃에서 생성한 초산의 산도를 나타낸 도이다.
도 9a 내지 도 9c는 각 갈변 억제제(PVPP, 아스코르브산, 벤토나이트 및 과황산칼슘)의 농도(0.05, 0.1, 0.15 및 0.2%)에 따라 꾸지뽕 착즙액의 갈변 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 10a 내지 도 10c는 꾸지뽕 착즙액의 청징화를 위해 셀룰라아제, 펙티나아제 및 셀룰라아제:펙티나아제=1:1로 혼합한 효소를 농도(100, 200 및 300 ppm)에 따라 꾸지뽕 착즙액의 청징화 효과를 나타낸 도이다.
도 11a 내지 도 11c는 각 온도(18, 25 및 30℃)에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효주의 pH 및 산도 변화를 나타낸 도이다.
도 12a 내지 도 12c는 각 온도(18, 25 및 30℃)에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효주의 당도 및 알코올 농도 변화를 나타낸 도이다.
도 13a 내지 도 13c는 각 온도(18, 25 및 30℃)에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효주의 갈변도 및 탁도 변화를 나타낸 도이다.
도 14a는 아세토박터 파스테우리아누스 A26 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 pH 및 산도 변화를 나타낸 도이다.
도 14b는 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 pH 및 산도 변화를 나타낸 도이다.
도 14c는 아세토박터 파스테우리아누스 B7 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 pH 및 산도 변화를 나타낸 도이다.
도 15a는 아세토박터 파스테우리아누스 A26 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 총페놀성 화합물의 함량을 나타낸 도이다.
도 15b는 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 총페놀성 화합물의 함량을 나타낸 도이다.
도 15c는 아세토박터 파스테우리아누스 B7 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 총페놀성 화합물의 함량을 나타낸 도이다.
도 16a는 아세토박터 파스테우리아누스 A26 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 총플라보노이드 함량을 나타낸 도이다.
도 16b는 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 총플라보노이드 함량을 나타낸 도이다.
도 16c는 아세토박터 파스테우리아누스 B7 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 총플라보노이드 함량을 나타낸 도이다.
도 17a는 아세토박터 파스테우리아누스 A26 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 도이다.
도 17b는 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 도이다.
도 17c는 아세토박터 파스테우리아누스 B7 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 도이다.
도 18a는 아세토박터 파스테우리아누스 A26 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 ABTS 양이온 라디칼 소거능을 나타낸 도이다.
도 18b는 아세토박터 파스테우리아누스 A37 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 ABTS 양이온 라디칼 소거능을 나타낸 도이다.
도 18c는 아세토박터 파스테우리아누스 B7 초산균의 각 pH에서 발효기간에 따른 꾸지뽕 발효식초의 ABTS 양이온 라디칼 소거능을 나타낸 도이다.
도 19는 꾸지뽕 발효식초의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KACC 92206P로 기탁된 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 제공한다.
상기 균주는 자두 식초로부터 분리된 것이다.
상기 균주는 산 생성능, 알코올 내성 및 향기 생성능으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이 우수하다.
상기 균주는 꾸지뽕 발효식초 제조용일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 1) 꾸지뽕 착즙액을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조한 꾸지뽕 착즙액을 전처리하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 전처리가 완료된 꾸지뽕 착즙액을 알코올 발효시켜 꾸지뽕 발효주를 제조하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 꾸지뽕 발효주에 수탁번호 KACC 92206P로 기탁된 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 접종하여 꾸지뽕 발효식초를 제조하는 단계; 를 포함하는, 꾸지뽕 발효식초의 제조방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 꾸지뽕 착즙액은 꾸지뽕 열매를 세척, 착즙 및 가수하고, 20 내지 30°Brix로 보당하여 사용할 수 있고, 구체적으로 22 내지 25°Brix로 보당할 수 있다. 상기 꾸지뽕 착즙액의 당도가 22°Brix보다 낮은 경우 식초의 당도가 낮아지고, 맛과 향 등의 전반적인 선호도 또한 낮아질 수 있으며, 상기 꾸지뽕 착즙액의 당도가 너무 높은 경우 점성이 높아 초산발효가 안 될 수 있다.
상기 단계 2)의 꾸지뽕 착즙액의 전처리는 아스코르브산 0.05 내지 0.5 (w/v)을 첨가하여 갈변을 억제하는 단계; 및
2) 셀룰라아제 및 펙티나아제를 1:1의 비율로 100 내지 400 ppm을 첨가하여 청징화시키는 단계; 를 포함한다.
상기 전처리 단계에서 바람직하게는 아스코르브산 0.1 내지 0.3 (w/v), 셀룰라아제 및 펙티나아제를 1:1의 비율로 200 내지 400 ppm을 첨가할 수 있다.
상기 단계 3)의 알코올 발효는 18 내지 30℃에서 3일 내지 14일 동안 정치 발효시킬 수 있고, 구체적으로 20 내지 27℃에서 10일 내지 14일, 더 구체적으로 23 내지 26℃에서 11일 내지 13일 동안 정치발효시킬 수 있다.
상기 종초는 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 6 내지 9%의 알코올 농도를 가진 꾸지뽕 발효주에 접종하여 27 내지 32℃에서 10일 내지 14일 동안 배양하여 제조할 수 있고, 구체적으로 7 내지 9%의 알코올 농도를 가진 꾸지뽕 발효주에 접종하여 27 내지 32℃에서 10 내지 14일 동안 배양하여 제조할 수 있고, 더 구체적으로 7.5 내지 9%의 알코올 농도를 가진 꾸지뽕 발효주에 접종하여 28 내지 31℃에서 11 내지 13일 동안 배양하여 제조할 수 있다.
상기 단계 4)의 꾸지뽕 발효식초는 수탁번호 KACC 92206P로 기탁된 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 이용하여 제조된 종초를 접종하여 제조된다.
상기 종초는 7 내지 15 %(v/v)의 농도로 접종할 수 있고, 구체적으로 9 내지 12 %(v/v)의 농도로 접종할 수 있다.
상기 단계 4)는 초기 pH 3 내지 5의 꾸지뽕 발효주에 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 접종하여 18 내지 23℃에서 20 내지 35일 동안 정치 발효시킬 수 있고, 구체적으로 초기 pH 3.5 내지 4.5의 꾸지뽕 발효주에 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 접종하여 19 내지 22℃에서 25 내지 33일 동안 정치 발효시킬 수 있다.
상기 단계 4)에서는 초산발효가 일어나고, 초산발효는 농가형 정치발효(표면발효) 또는 기업형 속성발효(심부발효)의 방법으로 수행될 수 있고, 구체적으로는 정치발효의 방법으로 수행될 수 있다. 정치발효는 배지에 초산균을 접종한 후 정치된 상태에서 초산발효를 진행하는 방법으로, 발효설비가 간단하여 초기 투자비용을 최소화할 수 있으며 부드러운 신맛을 낼 수 있으나, 초산균 특성에 맞는 발효온도나 통기량 등의 발효조건을 조절해야 하고, 장시간 동안 발효를 진행해야 하며, 수율이 낮고 식초에 이미, 이취가 잔류하는 문제점이 있다. 한편, 심부발효는 발효온도, 통기량 등의 발효조건을 조절할 수 있어 정치발효(표면발효)에 비해 발효기간이 짧고, 식초의 수율 및 산도를 높일 수 있으나, 식초가 톡 쏘는 강한 신맛을 나타내므로 관능성이 떨어지는 문제점이 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 꾸지뽕 발효식초를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주는 9%의 알코올 농도에서도 산 생성능이 우수하고, 단향을 생성하여 향기 생성능이 우수하여 과일식초 제조에 적합한 초산균으로 분리 동정하여 한국농용미생물보존센터(KACC)에 2017년 10월 23일자로 기탁하여 2017년 10월 30일에 수탁번호 KACC 92206P를 부여받았다. 또한, 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 이용하여 꾸지뽕 발효식초를 제조한 결과, 초기 pH 4, 20℃에서 30일 동안 발효시킨 결과 산도가 빠른 시간 내에 높아지고, 항산화능이 높으며, 기능성 성분의 함량이 높아 우수한 품질의 꾸지뽕 발효식초를 제조할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주는 과일식초 제조에 유용하게 사용될 수 있고, 상기 균주를 이용한 꾸지뽕 발효식초의 제조방법을 통해 산도가 높고 항산화능 및 기능성 성분의 함량이 높은 꾸지뽕 발효식초를 제조할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 과일식초 제조용 초산균의 선별
<1-1> 발효식초와 초산균 수집
과일식초과일식초 생성능, 알코올 내성 및 향기 생성능이 우수한 초산균을 선별하기 위해 권역별(경기도, 서울특별시, 충청도, 강원도, 전라도, 경상도) 5개 지역에서 식품명인, 농가형 사업장, 식품 관련 연구소 등으로부터 발효식초와 초산균 96점을 수집하였다.
수집한 시료는 강원도(39점), 경기도(6점), 전라도(35점), 충청도(9점), 경상도(6점), 서울특별시(5점)로 총 96점이며, 농가형 사업장으로부터 수집한 식초 38종의 수집 지역, 원료, 실물 사진 및 수집 일시를 표 1 및 표 2에 나타내었고, 식품 관련 연구기관에서 수집한 다양한 초산균 58주의 수집 지역 및 수집 일시를 표 3에 나타내었다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
<1-2> 수집한 식초에서 산 생성능이 있는 초산균의 선별 및 초산균의 분리
상기 실시예 1-1에서 농가형 사업장으로부터 수집한 38점의 식초에서 산을 생성하는 초산균이 존재하는 식초를 선별하고, 식초로부터 초산균을 분리하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 수집한 식초 38점의 식초 발효액을 탄산칼슘(CaCO3)이 1g/㎖ 첨가된 고체배지(Acetobacter solid medium, ASM, Yeast extract 0.5%, 포도당 3.0%, 탄산칼슘 1.0%, 에탄올 3.0%, 한천 2.0%)에 분주하고 평판도말(spreading)하여 접종한 후, 30℃에서 5일간 배양하였다. 고체배지에 생육한 초산균은 콜로니를 형성하므로 백금이를 사용하여 새로운 고체배지에 선상 도말(streaking)하여 재접종한 후, 각각의 배지를 다시 30℃에서 5일간 배양하여 초산균을 순수 분리하였다. 그 후 원래 탄산칼슘의 함유로 불투명한 색상을 나타내던 고체배지는 초산(acetic acid)을 생성하는 초산균에 의해 탄산칼슘이 분해되면서 투명환이 발생한다. 이에, 초산 생성에 따라 탄산칼슘이 분해되어 투명환(Clear zone)을 형성하는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 초산을 생성하여 탄산칼슘 분해로 인해 투명환이 생성되는 30점의 식초를 선별하고, 식초에서 초산균을 분리하였다.
<실시예 2> 산 생성능이 우수한 초산균의 선별
<2-1> 초산균의 분류
상기 실시예 1-2의 농가형 발효식초 30점으로부터 분리한 초산균, 식품 관련 연구기관에서 수집한 58주의 초산균을 A(농가형 발효식초로부터 분리한 초산균 30주), B(식품 관련 연구기관으로부터 수집한 초산균), C(농식품연구소로부터 수집한 초산균)으로 구분하여 하기 표 4 및 표 5와 같이 88주의 초산균의 번호를 매겼다.
Figure pat00004
Figure pat00005
<2-2> 정성적 평가를 통한 산 생성능이 우수한 초산균의 선발
상기 실시예 2-1의 88주의 초산균을 대상으로 산 생성능이 우수한 초산균을 정성적으로 선발하기 위해, 탄산칼슘 고체배지에서 배양기간에 따라 각 초산균이 생성하는 투명환의 크기를 측정하였다.
구체적으로, 탄산칼슘(CaCO3)이 1.0%(v/v) 첨가된 고체배지(Acetobacter solid medium, ASM, Yeast extract 0.5%, 포도당 3.0%, 탄산칼슘 1.0%, 에탄올 3.0%, 한천 2.0%)에 생육한 각각의 초산균을 이쑤시개(toothpick)로 1 스팟 접종한 뒤, 30℃에서 168시간 동안 배양하면서 24시간 간격으로 탄산칼슘이 초산에 의해 분해되어 형성되는 투명환의 크기를 측정하였다. 투명환의 크기는 디지털 캘리퍼스를 사용하여 투명환의 직경을 소수점 둘째자리까지 측정하였으며, 투명환 크기가 30mm 이상일 때, '+++', 20 mm 이상일 때, '++', 10 mm 이상일 때, '+', 10 mm 미만일 때, '-'로 표시하여 하기 표 6 및 표 7에 나타내었다. 본 실험의 대조군(Control)은 균주보존센터에 등록한 Acetobacter pasteurianus CV3(KACC 17058)를 분양받아 사용하여, 대조군의 초산균보다 생성한 투명환의 직경이 큰 초산균을 선별하였다.
Figure pat00006
Figure pat00007
그 결과, 표 6 및 7에 나타난 바와 같이, 가장 큰 직경의 투명환을 형성한 초산균은 총 32주(A6, A9, A11-②, A12, A19, A21-①, A21-③, A24, A26, A28-①, A28-②, A32, A33, A36, A37, A38, B3, B5, B6, B7, B11, B24, B25, B27, C1, C4, C9, C10, C11, C12, C14, C15)로 확인되었고, 도 2a 내지 도 2h에 나타난 바와 같이, 대조군인 CV3 초산균에 비해 농가형 발효식초(A type)에서 분리한 초산균 16주(4, 6, 9, 11-2, 12, 19, 21-1, 21-3, 24, 26, 28-2, 32, 33, 36, 37, 38), 식품 관련 연구기관(B type)이 8주(3, 5, 6, 7, 11, 24, 25, 27), 농식품연구소(C type)가 8주(1, 4, 9, 10, 11, 12, 14, 15)의 총 32주가 배양기간에 비례하여 산 생성능이 우수하였다.
<2-3> 정량적 평가를 통한 산 생성능이 우수한 초산균의 선별
상기 실시예 2-2에서 분리한 32주의 초산균을 대상으로 정량적인 평가를 통해 산 생성능이 우수한 초산균을 2차 선별하기 위해 초산균이 생성하는 초산의 산도를 하기와 같이 측정하였다.
구체적으로, 초산균의 활성으로 생성된 초산의 산도 측정은 전배양과 본배양을 거쳐 진행하였다. 먼저 전배양은 초산균용 액체배지(Acetobacter liquid medium, ALM, Yeast extract 0.5%, 포도당 0.5%, 글리세린 1.0%, MgSO4ㆍ7H2O 0.02%, 에탄올 6.0%, 아세트산 1.0%)를 시험관에 10 ㎖씩 분주한 후, 1차로 순수분리한 각각의 초산균을 1 백금이 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이어서 본배양은 전배양과 동일한 액체배지를 500 ㎖ 삼각 플라스크에 100 ㎖씩 분주한 후, 전배양액 10 ㎖를 접종하여 30℃에서 배양하였다.
산도 측정은 시료를 4일 간격으로 1 ㎖ 채취한 뒤, 증류수 9 ㎖로 10배 희석하여 1% 페놀프탈레인 용액을 2 내지 3방울 가한 후, 0.1N NaOH용액의 적정 소비량을 구해 아래의 방정식으로 계산하였다.
산도(%) =V×F×A×D×1/S×100
V : 0.1N-NaOH 용액의 적정 소비량(㎖)
F : 0.1N-NaOH 용액의 역가
A : 0.1N-NaOH 용액 1 ㎖에 상당하는 유기산의 양(초산=0.006)
D : 희석배수
S : 시료 채취량(㎖)
초산균의 산도는 대부분 배양 7일이 정지기(stational phase)에 도달하여 더 이상 산도가 증가하지 않으므로 발효기간을 7일로 한정하여 초산 생성량을 측정하였으며, 산도가 높을수록 산 생성능이 우수한 초산균으로 선발하였다.
그 결과, 도 3a 내지 도 3h에 나타난 바와 같이, 발효기간에 따른 분리 초산균의 산도가 5.5% 이상으로 나타난 A type 15주(A6, A9, A11-2, A12, A19, A21-1, A21-3, A24, A26, A28-1, A28-2, A33, A36, A37, A38), B type 7주(B3, B5, B6, B7, B11, B24, B25) 및 C type 7주(C1, C4, C9, C10, C11, C12, C15) 의 총 29주를 2차 선별하였다.
<실시예 3> 알코올 내성이 우수한 초산균의 선별
식초는 알코올의 초산발효에 의해 제조하기 때문에 고효율로 발효식초를 제조하기 위해서는 알코올 농도가 높은 환경에서 초산을 높은 효율로 생성하는 초산균의 선별이 필요하다. 상기 실시예 2-3에서 선발한 초산균을 대상으로, 고알코올 농도에 내성을 가지며 많은 초산을 생성할 수 있는 우수한 토착 초산균을 선별하기 위해, 배지의 알코올 농도(6.0, 7.0, 8.0, 9.0%) 조건을 달리하여 이들이 생성하는 산 생성능을 비교하였다.
구체적으로, 알코올 농도별(6∼9%)로 조정한 각각의 액체배지(ALM)에 1차 분리 초산균을 접종 후, 30℃에서 20일 동안 배양하면서 4일 간격으로 산도를 측정함으로써 분리 초산균의 알코올 내성을 확인하는 동시에 알코올 농도별 산 생성능을 비교 분석하였다. 상기 실시예 2-3에서 선별한 정량적으로 산 생성능이 우수한 초산균 29주(2차 선발)를 대상으로 알코올 내성을 갖는 초산균을 3차 선발하기 위해, 액체배지에 첨가하는 알코올 농도(6.0, 7.0, 8.0, 9.0%)를 달리하여 30℃, 20일간 발효하면서 4일 간격으로 산도를 분석하여 고알코올 조건에서 내성을 가지면서 산 생성능이 우수한 초산균을 선발하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 농가형 발효식초인 A type 15주에서 알코올 농도 9%에서도 5.5% 이상 농도의 초산을 생성하여 산 생성능이 우수한 초산균 6주(A9, A21-3, A26, A28-2, A36, A37) 및 알코올 7∼8% 존재 하에서 초산 생성능이 우수한 초산균 6주(A6, A11-2, A21-1, A24, A28-1, A33)를 발굴하였고, B type 7주에서 알코올 농도 9%에서도 산 생성능이 우수한 초산균 5주(B3, B5, B7, B11, B24) 및 알코올 8% 존재 하에서는 초산 생성능이 우수한 1주(B6)를 발굴하였다. 또한, C type 7주에서 알코올 7∼9%에서 산 생성능이 우수한 초산균 2주(C1, C9)를 발굴하였다.
<실시예 4> 향기 생성능이 우수한 초산균의 선별
향과 풍미가 우수한 과일식초를 제조하기 위해서는 과일 향 등을 생성하는 향기 생성능이 우수한 초산균을 사용하는 것이 필요하다. 따라서, 표 4 및 표 5의 88주의 초산균이 생성하는 향을 알아보기 위해 연구자의 후각을 통한 스니핑 테스트를 수행하였다.
구체적으로, 고체배지(ASM)에 분리한 초산균을 선상 도말 접종한 후, 30℃에서 4일 동안 배양하여 배지에서 생성되는 향을 토대로 과일향, 꽃향 및 단향의 생성 유무를 판단 후, 향기 생성능이 우수한 초산균을 선별하였다.
그 결과, 하기 표 8에 나타난 바와 같이, 향기를 생성하지 않는 초산균과 향기를 생성하는 초산균을 구분하였다. 향기를 생성하는 초산균은 단향, 과일향, 꽃향, 풀꽃향, 요구르트향을 나타내었다. 상기 실시예 3에서 선별한 알코올 내성과 산 생성능이 우수한 초산균 중 향기 생성능이 있는 초산균 11주(A6, A11-2, A21-1, A21-3, A24, A26, A28-1, A37, B3, B7, C9)를 선별하였다.
<실시예 5> 선별한 초산균의 특성 분석 및 분류학적 동정
<5-1> 선별한 초산균의 형태적 특성 분석
상기 실시예 4에서 선별한 11주의 초산균의 형태학적 특성을 관찰하기 위해, 각각의 분리 초산균을 그람염색 후, 위상차 현미경(DE/EM 109, Carl Zeiss, Germany, X800)을 통해 검경하였다.
그람 염색은 시험 균주들을 고체배지에 30℃에서 2일간 배양시킨 후, 균체 1백금이를 슬라이드 글라스에 고정시킨 후, crystal violet을 몇 방울 떨어뜨려 1분간 염색-수세-요오드 용액으로 1분간 매염-수세-알코올로 30초간 탈수-사프라닌으로 1분간 염색-수세 순으로 진행하여 위상차 현미경으로 형태적 특성을 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 관찰한 초산균 모두 그람 음성균이었으며, 운동성이 없는 단일균 형태의 간균으로 확인되었다.
<5-2> 선별한 초산균의 생화학적 특성 분석
상기 실시예 4에서 선별한 11주의 초산균의 생화학적 특성을 API 20NE Kit(BioMerieux, France)를 사용하여 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 4에서 선별한 11주의 초산균들을 API 20NE Kit(BioMerieux, France)에 100 ㎕를 접종하고 30℃에서 24시간 반응시킨 후, 생화학적 시험을 수행하였다. 생화학적 시험은 생리 식염수에 각각의 시험 초산균을 현탁하여 건조된 기질이 들어있는 키트의 cupule에 접종하여 배양한 후, 발색시약을 첨가하여 물질의 대사유무를 색의 변화로써 판정하였다.
그 결과, 모든 시험균주들은 Indole production 반응에 양성 반응을 보인 Glu. saccharivorans와 다르게 음성 반응을 보였고, 분리한 초산균의 대부분은 대조군으로 사용한 A. pasteurianus와 시험 결과가 일치하였다. 일부 초산균주(A6, A11-②, A37)는 gelatin hydrolysis에서 양성 반응을 보이면서 대조군인 A. malorum과 일치되는 부분을 보였지만 nitrate reduction, glucose fermentation 시험에서 불일치되는 것으로 보아 A. malorum으로 판정하기 어렵기 때문에 더 정확한 동정을 위해 하기 실시예 5-4에서 16S rRNA 염기서열분석을 통해 상동성(Homology)을 비교했다.
<API Kit를 이용한 Type strains의 생화학적 특성>
특성 A. pasteurianus A. malorum Glu. saccharivorans
Catalase + + +
Nitrate reduction - + -
Indole production - - +
Glucose fermentation - + -
Arginine dihydrolase - - -
Urease - - -
Escullin hydrolysis + + +
Gelatin hydrolysis - + -
β-glucosidase - - -
<분리한 초산균의 생화학적 특성 분석>
특성 A6 A11-② B7 A21-① A21-③ A24 A26 A28-① C9 A37 B3
Catalase + + + + + + + + + + +
Nitrate reduction - - - - - - - - - - -
Indole production - - - - - - - - - - -
Glucose fermentation - - - - - - - - - - -
Arginine dihydrolase - - - - - - - - - - -
Urease - - - - - - - - - - -
Escullin hydrolysis + + + + + + + + + + +
Gelatin hydrolysis + + - - - - - - - + -
β-glucosidase + - - - - - - - - - -
<5-3> 선별한 초산균의 탄소원 이용 특성 분석
상기 실시예 4에서 선별한 11주의 초산균이 다양한 종류의 탄소원을 이용하는지 여부를 조사하기 위해, 각각 3% 에탄올과 초산을 첨가한 AE배지에 포도당 대신, 다양한 탄소원(sucrose, lactose, mannose, rhamnose, galactose, fructose, maltose, glycerol, melibiose, xylose, inositol, mannitol, sorbitol, arabinose, lactate)을 첨가하여 30℃에서 7일 동안 110 rpm으로 진탕배양한 후, 660 nm에서 흡광도를 측정하여 생육 특성을 조사하였다(표 10).
<분리 초산균의 탄소원 이용능>
탄소원 AE(3a/3e) broth-포도당을 아래로 교체함 A6 A11-② B7 A21-① A21-③ A24 A26 A28-① C9 A37 B3
수크로오스 + ++ +++ ++ - + + ++ - + -
락토오스 + - + ++ - + ++ + - + +
만노오스 ++ ++ ++ + - - - +++ +++ + ++
람노오스 + + + ++ + - + ++ + + +
갈락토오스 - + ++ +++ + + ++ ++ + - +
프럭토오스 - ++ + ++ - + ++ + + + ++
말토오스 - - + ++ ++ - ++ + + + +
글리세롤 + ++ + - - - - +++ +++ ++ +
멜리비오스 - - - - - - - + - - -
자일로스 + +++ ++ + + + + +++ + + -
이노시톨 + ++ - + - - - ++ + - -
만니톨 + ++ +++ +++ + - - ++ + + ++
소르비톨 + ++ ++ +++ ++ + +++ +++ + + ++
아라비노오스 + + + +++ + + - ++ - + +
락테이트 - - - +++ - - - - - - -
그 결과, A11-2, A21-1, A28-1은 포도당 대신에 다른 탄소원 이용능이 뛰어나며, 일부 초산균들도 탄소원 종류에 따라 이용능에 차이가 있었다. 그러나 멜리비오스는 대부분의 초산균은 이를 이용하지 않았다. B7은 포도당 대신에 다른 탄소원 이용능이 뛰어나며, 일부 초산균들도 탄소원 종류에 따라 이용능에 차이가 있지만, 락토오스, 프럭토오스, 자일로오스, 이노시톨 및 락테이트 등의 이용능은 저조하였다.
<5-4> 선별한 초산균의 분자생물학적 특성 분석
선별한 초산균의 계통수(phylogenetic tree)를 작성하기 위하여 16S rDNA 염기서열을 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 4에서 선별된 초산균의 배양된 균체를 e-tube에 담고, gDNA prep kit(Genomic cell/tissue spin mini kit(Genotech))를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 하기 표 11의 서열을 가진 프라이머를 이용하여 PCR 전용 200 ㎕ tube 또는 96 웰 플레이트에 하기 표 12의 PCR master mix를 22.5 ㎕씩 분주한 다음, 균체로부터 추출한 gDNA(20 ng/㎕)를 2.5 ㎕씩 첨가하여, 하기 표 13의 조건으로 PCR을 수행하였다.
이름 서열 크기 서열번호
9F GAGTTTGATCCTGGCTCAG 19 서열번호 1
1512R ACGGCTACCTTGTTACGACTT 21 서열번호 2
구분 Stock 용액 농도 최종농도(tube) 1 tube 분량
완충용액 10× 1× 2.5 ㎕
MgCl2 25 mM 1.5 mM 1.5 ㎕
dNTPs 10 mM(각각 2.5 mM) 1 mM(각각 0.25 mM) 2.5 ㎕
pfu polymerase 5 U/ml 1.25 U 0.25 ㎕
Forward primer 10 μM 0.5 μM 1.25 ㎕
Reverse primer 10 μM 0.5 μM 1.25 ㎕
멸균 증류수 13.25 ㎕
Template DNA 20 ng/㎕ 50 ng 2.5 ㎕
전체량 25 ㎕
온도 반응 시간 사이클수
95℃ 전 변성(pre denaturation) 5분
95℃ 변성(denaturation) 45초 30 사이클
55℃ 결합(annealing) 45초
72℃ 신장(extension) 60초
72℃ 최종 신장(last extenxion) 10분
PCR 산물 2㎕에 로딩 완충용액 2㎕를 넣어 혼합한 후 1 내지 2%의 아가로오스 겔의 웰에 주입하여 200 V 전압(5 내지 20 V/cm)으로 10분 동안 전기영동 하였다. 전기영동으로 확인된 PCR 산물은 PCR production purification kit(Nucleogene)으로 정제하였다. 정제한 PCR 산물을 하기 표 14의 서열을 가진 프라이머를 이용하여 하기 표 15의 조건으로 PCR을 수행하고, 반응에 참여하지 않은 형광물질을 에탄올로 세척한 후 증류수 또는 HDF(Hi-Ki Formamide)에 녹여 ABI BigDye terminatorcycle sequencing ready reaction kit V3.1(ABI)을 이용한 cycle sequencing 방법으로 염기서열을 해독하였다.
이름 서열 크기 서열번호
ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 19 서열번호 3
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 20 서열번호 4
온도 반응 시간 사이클수
96℃ 전 변성(pre denaturation) 2분
96℃ 변성(denaturation) 10초 30 사이클
50℃ 결합(annealing) 10초
60℃ 신장(extension) 3분
결정된 염기서열의 상동성 검사는 National Center for Biotechnology Information(NCBI; www.ncbi.nlm.nih/gov/)에서 제공하는 BLAST를 통하여 수행하였으며 표준 균주(type strain)들과 관련 분류군의 16S rDNA 염기서열은 Genebank ribosomal DNA sequence와 비교하였다.
선별한 초산균의 계통도를 작성하기 위해, 염기서열 간의 상동성은 Clustal W 프로그램을 사용하여 염기서열들 간의 다중서열정렬(Multiple sequence alignment)을 진행하였으며 계통수의 작성에는 MEGA 4 프로그램을 사용한 neighbor-joining법과 Kimura-nei 모델을 사용하였다. 계통수의 안정성 검사를 위해 1,000번의 bootstrap resampling을 시행하였다(도 6).
그 결과, 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, 분리 균주의 대부분은 Acetobacter pasteurianus DSM 3509와 염기서열이 99.5% 일치하는 것으로 보아 A. pasteurianus에 속하는 것으로 확인되었다(표 16).
Figure pat00008
<실시예 6> 선별한 초산균을 이용한 종초 제조 및 제조한 종초의 산 생성능 평가
<6-1> 선별한 초산균을 이용한 종초 제조
상기 실시예 4에서 선별한 초산균 중 알코올 내성, 산 생성능 및 향기 생성능이 뛰어난 초산균 A26, A37 및 B7의 3종의 초산균을 선별하여 종초를 제조하고, 산 생성능이 우수한 최적배지, 온도, 알코올 농도, 발효기간의 최적조건을 확립하였다.
구체적으로, 아세트산 박테리아 액체배지(yeast extract 0.5%, 포도당 0.5%, 글리세린 1.0%, MgSO4ㆍ7H2O 0.02%, 아세트산 1.0%), 아세토박터 배지(yeast extract 0.5%, 포도당 2.0%, 펩톤 0.5%, Na2HPO4 0.27%, 아세트산 1.0%) 및 GYC broth(yeast extract 0.5%, 포도당 3.0%, 아세트산 1.0%)을 각각 알코올 농도 6, 7, 8%를 가진 에탄올로 첨가하여 배지를 제조한 후, 선발된 3종류의 초산균(A26, A37, B7)을 각각 접종하여 배양 온도별(20℃ 및 30℃)로 14일 동안 배양하면서 3일 간격으로 산도를 측정하였다(표 17 내지 표 19).
그 결과, 표 17 내지 표 19에 나타난 바와 같이, 3종류의 초산균 모두 20℃보다 30℃에서, 에탄올 농도가 높을수록 산 생성능이 우수했다. A26 초산균은 GYC broth에서, A37 및 B7 초산균은 아세트산 박테리아 액체배지에서 산 생성능이 우수하여 최적배지로 선정하였다. 또한, 최적 에탄올 농도는 8%로, 최적온도는 30℃로 확립하였다.
Figure pat00009
Figure pat00010
Figure pat00011
<6-2> 제조한 종초의 산 생성능의 정성적 및 정량적 평가
상기 실시예 6-2에서 확립한 최적배지 및 최적 알코올 농도, 20℃ 및 30℃에서 종초를 제조하고, 제조한 종초의 산 생성능의 정성적 및 정량적 평가를 수행하였다.
구체적으로, 3종의 초산균(A26, A37 및 B7)을 A26 초산균은 GYC broth에, A37 및 B7 초산균은 아세트산 박테리아 액체배지에, 알코올 농도 8%를 가진 에탄올을 첨가하여 배지를 제조하고 상기 실시예 6-1의 방법으로 종초를 제조하였다. 그 후, 상기 실시예 2-2의 방법으로 산 생성능을 정성적으로 평가하였다. 종초를 고체배지에 1 백금이 접종한 뒤, 30℃에서 120시간 동안 배양하여 투명환의 크기를 측정하였다. 대조군으로는 Acetobacter malorum을 사용하였다. 또한, 3종의 초산균으로 제조한 종초의 산 생성능을 정량적으로 평가하기 위해 상기 실시예 2-3에 기재된 방법 및 조건으로 산도를 정량적으로 평가하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 모든 시험군에서 대조군보다 산 생성능이 높은 것과, 20℃보다 30℃에서 산 생성능이 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, 20℃보다 30℃에서 산 생성능이 높은 것과, B7>A26>A37 초산균의 순서대로 산 생성능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 7> 꾸지뽕 발효식초 제조를 위한 꾸지뽕 착즙액 제조
꾸지뽕 열매 15 kg을 유수에 세척 및 물 빼기한 후, 균질하게 파쇄하여 총 원료(꾸지뽕 착즙액 15 L)에 180% (V/V)되게 가수(D.W. 27 L)하였다. 꾸지뽕 착즙액(42 L, 3.1°Brix으로 13%의 과실주를 제조하기 위해, 백설탕 8.7 kg을 첨가하여 24°Brix가 되게 보당하였다.
<실시예 8> 꾸지뽕 발효식초 제조를 위한 꾸지뽕 착즙액의 전처리
<8-1> 꾸지뽕 착즙액의 갈변 억제 처리
상기 실시예 7에서 제조한 꾸지뽕 착즙액에 여러 종류의 갈변 억제제를 처리하여 갈변 억제 효과가 가장 뛰어난 갈변 억제제를 선별하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 4종류 갈변 억제제인 PVPP(polyvinylpolypyrolidone), 아스코르브산, 벤토나이트 및 아황산나트륨(sodium sulfite)를 사용하여 갈변 억제 효과를 비교 및 분석하고자 처리 농도를 달리하여 갈변 억제제를 처리하지 않은 대조군(0%)을 포함한 0.05, 0.1, 0.15, 0.2%(w/v)로 조절한 후 각각 시료에 첨가하였다. 삼각 플라스크에 각 100 ㎖를 분주하였다. 갈변 억제제는 농도별(0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2%(w/v))로 분주한 후, 80℃에서 1시간 동안 열처리를 하였으며, 갈변도를 측정하기 위해 0.45 ㎛의 공극을 가진 막 필터를 이용하여 여과한 후, 420 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 갈변도를 확인하였다. 대조구로 사용된 3종류의 시판 꾸지뽕 즙(100%)은 A, B, C로 나타내었고, 본 연구에 사용한 꾸지뽕 착즙액은 S로 나타내었다.
그 결과, 도 9a 내지 도 9d에 나타난 바와 같이, 꾸지뽕 착즙액(S)은 아스코르브산을 0.2% 처리하였을 때, 대조군(Control, 0.373)보다 약 3배(0.130) 정도 갈변 억제율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. 갈변 억제제 처리에 따른 갈변도는 아스코르브산(0.130) > PVPP 0.2% (0.153) > 벤토나이트(trace) 순으로 나타났다. 따라서, 아스코르브산 0.2%를 처리하는 것을 최적조건으로 선정하였다.
<8-2> 꾸지뽕 착즙액의 청징화 효소 처리
꾸지뽕의 전처리조건으로 갈변 억제에 이어 청징화조건을 설정하기 위해, 셀룰라아제, 펙티나아제 및 셀룰라아제와 펙티나아제를 1:1로 혼합하여 이에 따른 청징화 효과를 확인하였다.
구체적으로, 셀룰라아제, 펙티나아제 및 셀룰라아제와 펙티나아제를 1:1로 혼합한 군을 대조군이 되는 0 ppm을 포함한 100, 200, 300 ppm(역가 : 12,000 U/g)으로 조절한 후, 각각의 시료에 첨가하여 사용하였다. 상기 실시예 8-1에서 설정한 갈변억제의 최적조건인 아스코르브산 0.2%(w/v)를 처리하고 80℃에서 1시간 열처리 시킨 꾸지뽕 착즙액에 셀룰라아제와 펙티나아제 그리고 혼합 효소제인 셀룰라아제:펙티나아제=1:1을 농도별(0, 100, 200, 300 ppm)로 분주하여 60℃에서 1시간 열처리하였다. 이어 탁도를 측정하기 위해, 0.45 ㎛ 막 필터에 여과한 후, 660 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 10a 내지 도 10c에 나타난 바와 같이, 복합효소(셀룰라아제:펙티나아제=1:1)를 처리한 시험구에서 대조구 A, B, C와 꾸지뽕 착즙액(S, 본 연구에서 개발한 꾸지뽕 식초)의 탁도가 모두 0.05 이하로 측정되어 청징화의 효과가 가장 크게 나타났다. 꾸지뽕 착즙액(S)의 경우, 셀룰라아제:펙티나아제=1:1 300 ppm 처리 시험구에서 탁도가 가장 낮게(0.038) 측정되어 청징화의 효과가 비교적 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 이에, 셀룰라아제:펙티나아제=1:1의 비율로 300 ppm 처리하는 조건을 꾸지뽕 착즙액 청징화를 위한 최적조건으로 설정하였다.
<실시예 9> 꾸지뽕 발효식초 제조를 위한 꾸지뽕 발효주 제조
<9-1> 꾸지뽕 발효주 제조
상기의 실시예 8의 최적조건(아스코르브산 0.2%, 셀룰라아제:펙티나아제=1:1 300 ppm)으로 전처리한 꾸지뽕 착즙액을 30℃로 냉각 후, 여과하여 삼각 플라스크에 각 250㎖씩 분주하였다. 이어 시판효모(송천효모)로 제조한 주모를 0.3%(v/v) 접종하고 온도별(18℃, 25℃, 30℃)로 정치발효하면서 발효기간(0, 3, 6, 9, 12일)별로 시료를 채취한 후, 하기와 같이 꾸지뽕 발효주의 pH, 당도, 산도, 유기산 함량, 유리아미노산 함량을 측정하여 꾸지뽕 발효주의 제조를 위한 최적조건을 탐색하고자 하였다.
<9-2> 제조한 꾸지뽕 발효주의 pH 및 산도 분석
상기 실시예 9-1에서 제조한 꾸지뽕 발효주의 pH 및 산도를 하기와 같이 분석하였다.
구체적으로, pH는 채취한 꾸지뽕 발효주 시료 10 ㎖을 pH meter(Orion 420A, USA)를 사용하여 측정하였으며, 당도는 시료 0.5 ㎖을 당도계(B626544, Atago, Japan)를 사용하여 측정하였다. 산도 측정은 시료를 1 ㎖ 페놀프탈레인 용액을 2~3방울 가한 후, 0.1N NaOH용액의 적정 소비량을 구해 아래의 방정식으로 계산하였다.
산도(%) =V×F×A×D×1/S×100
V : 0.1N-NaOH 용액의 적정 소비량(㎖)
F : 0.1N-NaOH 용액의 역가
A : 0.1N-NaOH 용액 1 ㎖에 상당하는 유기산의 양(초산=0.006)
D : 희석배수
S : 시료 채취량(㎖)
그 결과, 도 11a 내지 도 11c에 나타난 바와 같이, 초기산도는 4.4였고 발효가 진행되면서 3일차에 급격히 감소하여 발효온도에 따라 3.88∼3.92로 비슷한 수준을 나타내었으며 발효기간이 경과됨에 따라 차이는 미미하였고 발효 12일에 18℃와 25℃는 3.91, 30℃는 3.99로 발효가 종료되었다. 꾸지뽕 발효주의 산도는 초기 산도 0.14%에서 발효 3일차에 급격히 증가하여 18℃와 30℃는 0.42%, 25℃는 0.48%로 측정되었으며 발효기간이 경과됨에 따라 점차 감소하여 25℃와 30℃는 0.36%로 발효가 종료되었다. 그러나 발효 18℃일 때 발효 종료 시 0.54%로 25℃와 30℃보다 비교적 높은 산도를 나타내었다.
<9-3> 제조한 꾸지뽕 발효주의 당도 및 알코올 농도 분석
상기 실시예 9-1에서 제조한 꾸지뽕 발효주의 당도 및 알코올 농도를 하기와 같이 분석하였다.
구체적으로, 꾸지뽕 발효주의 알코올 함량은 채취한 시료 100 ㎖을 증류한 액 80 ㎖을 증류수로 100 ㎖ 정용 후, 밀도 측정기(AT/DMA500M, Anton paar, USA)를 이용하여 알코올 도수를 측정하였다. 당도는 시료 0.5 ㎖을 당도계(B626544, Atago, Japan)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 12a 내지 도 12c에 나타난 바와 같이, 당도와 알코올은 반비례하여 당이 소비되면서 알코올이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 꾸지뽕 발효주의 초기 당도는 24.2°Brix이며 18℃에서 12일 발효한 경우, 당도는 15.1°Brix이고 알코올은 8.86%로 분석되었다. 특히, 알코올 도수가 낮은 것은 발효온도가 저온이기 때문에 서서히 발효가 진행되고 있는 것을 알 수 있었다.
25℃에서는 발효 9일차의 알코올 농도는 12.38%이었으며 12일 발효를 종료하였을 때, 13.07%, 당도는 10.4°Brix로 분석되었다. 이들 그룹보다 온도를 더 높여 발효시킨 30℃에서는 발효 9일째 13.02%, 발효 종료 시 13.34%의 알코올 농도를 나타내 알코올 생성능이 높았으며 당도는 9.6°Brix를 나타내었다. 상기 결과는 발효 온도가 높을수록 알코올 생성능이 높음을 제시한다.
<9-4> 제조한 꾸지뽕 발효주의 갈변도 및 탁도 분석
상기 실시예 9-1에서 제조한 꾸지뽕 발효주의 갈변도 및 탁도를 하기와 같이 분석하였다.
구체적으로, 발효기간(0일, 3일, 6일, 9일, 12일)에 따라 채취한 시료를 0.45 ㎛ 공극을 가진 막 필터로 여과 후, 갈변도는 420 nm, 탁도는 660 nm에서 효소 분석기(AT/Twlster, Tecan, Austria)를 이용하여 흡광도로 측정하였다.
그 결과, 도 13a 내지 도 13c에 나타난 바와 같이, 발효온도에 따른 갈변도는 0.126∼0.128로, 탁도는 0.038∼0.04으로 나타나는 것으로 보아 18℃와 25℃에서는 알코올 발효 중에 갈변과 혼탁현상이 거의 나타나지 않는 것으로 보였다. 상기 실시예 9-3, 하기 실시예 9-5 및 9-6의 결과와 같이, 30℃에서 발효 9일의 알코올이 13.0% 이상으로 가장 우수한 발효력를 나타내고, 유기산 및 유리아미노산의 함량이 높지만, 과실주의 알코올 발효 특성 상 고온에서 발효를 진행하면 부패 취 및 이취 등이 발생하여 좋은 품질의 꾸지뽕 과실주를 얻을 수 없다. 따라서 갈변도와 탁도가 각 0.126과 0.04으로 발효기간에 따라 비교적 변화가 없으며, 발효 12일부터 13.0% 이상 알코올을 생산하며 유기산 및 유리아미노산의 함량도 비교적 높은 25℃에서 12일 동안 발효시키는 조건을 꾸지뽕 발효주를 제조하는 최적조건으로 확정하였다.
<9-5> 제조한 꾸지뽕 발효주의 유기산 분석
상기 실시예 9-1에서 제조한 꾸지뽕 발효주의 유기산을 하기와 같이 분석하였다.
구체적으로, 시료 10 ㎖을 취하여 0.2 ㎛ 공극을 가진 막 필터로 여과한 후, 유기산을 분석하였으며 분석 장비는 HPLC(LC-20A Prominence, Shimadzu Co., Tokyo, Japan)를 사용하고, 컬럼은 C18 (250×4.6 mm id, S-5 ㎛, 12 nm; YMC, Kyoto, Japan)을 사용하였다. 용매로 발효주에 0.1% 인산, 식초에 0.1% 포름산을 첨가하여 사용하였으며, 유속은 0.6 ㎖/min, 주입 부피는 20 ㎕로 분석하였다.
그 결과, 하기 표 20에 나타난 바와 같이, 발효온도를 달리한 꾸지뽕 알코올 발효물의 유기산 함량은 발효가 진행될수록 전체적으로 감소하는 경향을 나타내어, 발효 초기 1,180.98 mg/100 ㎖, 발효종료 18℃에서 288.89 mg/100 ㎖, 25℃에서 294.40 mg/100 ㎖ 및 30℃에서 441.34 mg/100 ㎖로 나타났다. 이는 발효온도가 높을수록 비교적 높은 유기산 함량을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 모든 발효온도별 조건에서 발효 3일에 총 유기산 함량이 급격히 감소하며, 18℃에서는 238.54 mg/100 ㎖, 25℃는 283.33 mg/100 ㎖ 그리고 30℃에서는 269.78 mg/100 ㎖로 나타나 발효종료(12일)까지 소폭 증가하거나 감소하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과는 상기 실시예 9-2에서 확인한 발효기간과 온도에 따른 pH 및 산도 분석 결과와 비교하여 발효 초기(0일) 4.4에서 발효 3일에 급격히 감소하며 발효 온도별로 3.88∼3.92로 나타나 발효 종료까지 미미한 차이를 나타낸 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 발효종료 시점인 12일에 발효온도 18℃ 조건에서는 아세트산 함량이 11.95 mg/100 ㎖, 25℃와 30℃에서는 젖산 함량이 각 158.77 mg/100 ㎖와 298.95 mg/100 ㎖로 가장 높게 측정되었다. 그 외 숙신산은 발효 초기 검출되지 않았지만 발효가 진행될수록 증가하는 경향을 나타내었다.
Figure pat00012
<9-6> 제조한 꾸지뽕 발효주의 유리아미노산 분석
상기 실시예 9-1에서 제조한 꾸지뽕 발효주의 유리아미노산을 하기와 같이 분석하였다.
구체적으로, 시료 5 ㎖을 0.45 ㎛ 공극을 가진 막 필터로 여과하여 분석에 사용하였으며, 아미노산 분석기는 Sykam의 S7130 amino acid reagent organizer, S5200 sample injector와 S2100 solvent delivery system을, 칼럼은 cation separation 칼럼 LCA K06/NA (250 mm x 4.6 mm)을, 이동상의 유속은 0.45 ㎖/min, ninhydrin은 0.4 ㎖/min의 조건으로 분석하였다.
그 결과, 하기 표 21에 나타난 바와 같이, 총 유리 아미노산 함량은 발효온도 30℃(0.521 mg/㎖) > 25℃(0.326 mg/㎖) > 20℃(0.151 mg/㎖) 순으로 나타나 발효 온도가 높을수록 높은 함량을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 온도가 높은 발효조건에서 감칠맛인 글루탐산과 리신, 단맛인 알라닌, 쓴맛인 류신, γ-아미노부티르산(GABA), 등의 함량이 높아지거나 새롭게 검출되는 경향을 나타내었다. 발효 온도별 공통적으로 나타난 주요 아미노산은 비필수 아미노산으로 티민의 이화작용에 생성된 최종산물인 b-아미노부티르산, 세린 생합성의 중간체로서 칼슘의 가용화와 흡수를 촉진하는 포스포세린, 단맛을 내는 프롤린 등이 있었으며, 25℃에서 감칠맛인 글루탐산과 리신 등, 30℃에서 감칠맛인 글루탐산과 리신, 단맛인 프롤린, 알라닌과 γ-아미노부티르산(GABA), 쓴맛인 아르기닌 등으로 나타났다. 이러한 결과로 꾸지뽕 발효주 제조 시, 발효 온도가 높을수록 유기산 함량을 높이고 다양한 종류의 유리 아미노산을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
Figure pat00013
<실시예 10> 꾸지뽕 발효식초 제조
<10-1> 종초 제조
상기 실시예 6에서 선별한 3종류의 초산균을 이용하여 꾸지뽕 발효식초 제조를 위한 종초를 제조하였다.
구체적으로, 상기 실시예 6-1에서 확립한 종초 제조의 최적조건을 이용하여 선별한 3종류의 초산균을 아세트산 박테리아 액체배지에 30℃에서 정치배양한 후, 알코올 농도 8%로 제성하고 상기 9-1에서 제조한 꾸지뽕 발효주에 초산균 배양액을 10%(v/v) 접종하고 30℃에서 12일 동안 정치배양하여 종초를 제조하였다.
<10-2> 꾸지뽕 발효식초 제조
상기 실시예 9-4에서 확립한 최적의 꾸지뽕 알코올 발효조건을 기반으로 제조한 꾸지뽕 발효주를 조여과하고 알코올 농도 8%로 제성한 후, 식용 구연산과 탄산칼슘을 이용하여 초기 산도를 pH 2, 3, 4로 조절하였다. 그 후 상기 실시예 10-1에서 제조한 종초 10%(v/v)를 접종하고 발효온도(20℃, 30℃, 35℃)별로 정치발효 시키면서 발효기간별(0, 6, 12, 18, 24, 30일)로 발효 술덧을 채취하여 하기와 같이 특성 및 기능성 성분을 분석하였다.
<10-3> 제조한 꾸지뽕 발효식초의 pH, 산도 및 색도의 분석
상기 실시예 10-2에서 제조한 꾸지뽕 발효식초의 pH, 산도 및 색도를 하기와 같이 분석하였다.
구체적으로, pH는 채취한 시료 10 ㎖을 pH meter (Orion 420A, USA)를 사용하여 측정하였으며, 산도는 시료를 1 ㎖ 채취한 뒤, 증류수 9 ㎖로 10배 희석하여 1% 페놀프탈레인 용액을 2∼3방울 가한 후, 0.1N NaOH 용액의 적정 소비량을 환산하여 나타내었다. 색도는 각 발효조건별로 시료 20 ㎖를 채취하여 색차계(UltraScan Pro, HunterLab, USA)를 이용하여 L(brightness), a(red value), b(yellow value) 값으로 나타내었다.
그 결과, 도 14a 내지 도 14c에 나타난 바와 같이, 초산균 A26은 0일차의 pH 2에서 1.90, pH 3에서 3.13, pH 4에서 3.71로, A37은 1.88, 2.81, 3.53, B7은 1.77, 3.11, 3.72로 나타났다. 이는 발효가 진행됨에 따라 초산생성으로 인해 pH가 점차 낮아지는 경향을 나타내지만, A26은 일정한 수준으로 유지되거나 초기산도 pH 4에서 발효가 진행되어도 pH가 감소하지 않는 것을 관찰할 수 있었다. 초산균 A37은 초기산도 pH 4, 발효 20℃에서 발효종료 시점인 30일 째 가장 낮은 pH인 2.45를 나타내며 가장 큰 폭의 차이를 확인할 수 있었다. 초산균 B7 또한 pH 4, 20℃에서 최종 pH가 2.43으로 측정되어 A37과 비슷한 수준으로 나타났다. 결론적으로 A37 초산균의 산 생성능은 pH 4, 20℃에서 발효 종료 시 6.24%를 나타내었고 B7 초산균 또한 동일한 발효조건에서 발효 종료(30일) 시 6.12%의 산 생성능을 나타냈다. 즉, 초산균 A26은 모든 시험조건에서 산 생성이 미미한 것을 확인하였고, A37, B7 초산균은 초기산도(pH 3과 pH 4) 및 발효온도(20℃와 30℃) 조건에서 발효 시 높은 산 생성능을 나타내었다. 이는 상기 실시예 6에서 종초 제조시 산 생성능을 측정하였을 때 A26 초산균의 산 생성능이 우수함을 나타낸 결과와 상반되는 것으로, A26은 꾸지뽕 발효식초 제조에는 적합하지 않으나, 상대적으로 산 생성능이 낮았던 A37 초산균은 꾸지뽕 발효식초 제조시 높은 산 생성능을 나타내어 꾸지뽕 발효식초 제조에 적합한 초산균임을 제시한다.
꾸지뽕 초산발효물의 발효기간 및 온도에 따른 색도 변화를 조사한 결과, 하기 표 22 내지 표 24에 나타난 바와 같이, 발효가 진행됨에 따라 전체적으로 L(brightness) 값이 낮아지고 b(yellow) 값이 증가하여 갈변도가 증가하고, 발효 온도가 낮아질수록 a(red) 값과 b(yellow) 값이 비교적 낮게 측정되어 갈변도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 갈변도가 억제되고 산 생성능이 우수한 20℃, pH 4의 조건에서 A37과 B7초산균을 사용하여 꾸지뽕 발효식초를 제조하는 조건을 최적조건으로 규명하였다.
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
<실험예 1> 꾸지뽕 발효식초의 기능성 성분 분석
<1-1> 꾸지뽕 발효식초의 총페놀성 화합물 함량 분석
식물에 많이 포함되어 있는 페놀성 화합물은 2차 대사산물의 한 가지로 다양한 구조를 이루며, phenolic hydroxyl(OH)기로 인해 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하고 항산화와 항암 등의 다양한 생리활성 기능을 가진다. 따라서 이와 같은 발효조건별 꾸지뽕 식초의 기능성 성분을 조사하기 위해, 총페놀성 화합물을 하기와 같이 분석하였다.
구체적으로, 총페놀성 화합물 함량 분석은 Folin-Denis법에 의해 비색 정량하기 위해 일정하게 희석한 시료 0.2 ㎖에 증류수 1.8 ㎖을 첨가하여 2N Folin-ciocalteu 페놀 시약(Sigma-Aldrich, USA) 0.2 ㎖을 혼합하여 6분간 반응한 후, 7% Na2Co3 2 ㎖을 첨가하여 어두운 곳에서 2시간 반응하였다. 반응물은 750 nm에서 흡광도를 측정하였고 gallic acid(Sigma-aldrich, USA)를 이용한 표준곡선으로 양을 환산하여 mg (GAE)/100 ㎖로 나타내었다.
그 결과, 도 15a 내지 도 15c에 나타난 바와 같이, 발효가 진행됨에 따라 총페놀성 화합물 함량이 감소하며 발효온도가 높을수록 큰 폭으로 감소되는 것을 확인하였다. 그러나 발효력이 우수한 초기산도 pH 4, 발효온도 20℃ 조건에서 초산균 A37은 4.65 mg/100 ㎖, B7은 5.90 mg/100 ㎖로 증가하였다. 상기 결과는 산 생성능이 우수할수록 총페놀성 화합물 함량이 높게 나타남을 제시한다.
<1-2> 꾸지뽕 발효식초의 총플라보노이드 함량 분석
노란색을 의미하는 flavus에서 유래된 플라보노이드는 플라본을 기본 구조로 가지는 식물색소를 지칭한다. 이는 식물에 다량 함유되어 생체 내에서 항산화작용을 하며 항균, 항암 및 항염증 등의 활성을 가지는데, 이러한 생리활성 성분을 조사하기 위하여 꾸지뽕 초산발효물의 총플라보노이드 함량을 하기와 같이 분석하였다.
구체적으로, Davis변법을 이용하여, 시료 0.4 ㎖에 90% 디에틸렌글리콜 4 ㎖을 첨가하여 반응시킨 후, 1 N NaOH를 40 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 420 nm에서 흡광도를 측정하였고 Catechin (Sigma-aldrich, USA)를 이용한 표준곡선으로 양을 환산하여 mg (CE)/100 ㎖로 나타내었다.
그 결과, 도 16a 내지 도 16c에 나타난 바와 같이, 꾸지뽕 식초가 가지는 기능성 성분인 총플라보노이드 함량을 분석한 결과, 산을 생성하지 않은 초산균 A26의 경우, 모든 시험조건에서 큰 변화를 나타내지 않았다. 다만, A37의 경우, 초기산도 pH 4, 발효온도 35℃ 조건에서 발효 종료 시 2.74 mg/100 ㎖로 총플라보노이드 함량이 가장 높았다. 초산균 B7은 초기산도 pH 3과 pH 4의 30, 35℃조건일 때, 발효 6일차부터 비교적 높은 증가량을 나타내었으며 pH 3, 35℃조건 12일차에 3.25 mg/100 ㎖, pH 4, 35℃조건 18일차에 3.70 mg/100 ㎖로 비교적 총플라보노이드 함량이 가장 높았다.
<실험예 2> 꾸지뽕 발효식초의 항산화능 분석
<2-1> DPPH 자유 라디칼 소거능 측정
천연소재로부터 항산화 물질의 함량을 측정하기 위해 많이 이용되고 있는 DPPH는 비교적 안정한 자유 라디칼로써 이를 통한 라디칼 소거능은 인체의 질병과 노화를 방지하는 역할을 가지기에 기능성 식품의 대상으로 관심을 받고 있다. 따라서 제조조건별 꾸지뽕 식초의 DPPH 라디칼 소거능을 하기와 같이 측정하였다.
구체적으로, 환원성 물질 분석 시약 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 환원력을 이용한 검정법으로 Blois방법을 응용하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. 시료 1 ㎖에 0.2 mM DPPH 에탄올을 2 ㎖ 첨가하여 진탕한 후, 30분간 상온에서 반응하였다. 반응물은 517 nm에서 흡광도를 측정하였고, 양성 대조구로는 0.1% 아스코르브산(Daejung, Korea)을 이용하여 라디칼 소거능을 아래의 식에 의해 백분율(%)로 산출하여 나타내었다.
DPPH 라디칼 소거 활성(%) = (1 - Sample O.D. / Control O.D.)×100
그 결과, 도 17a 내지 도 17c에 나타난 바와 같이, 초산균 A26과 B7은 발효가 진행됨에 따라 큰 차이를 나타내지 않았으나, A37은 산 생성이 우수한 초기산도 pH 3, 4와 발효온도 20℃ 조건을 제외한 조건에서 DPPH 소거능이 매우 낮게 측정되었다. pH 3, 4의 20℃ 조건에서 발효 종료 시 각각 82.42%, 74.83%로 DPPH 라디칼 소거능이 비교적 높게 나타났다.
<2-2> ABTS 양이온 라디칼 소거능 측정
ABTS 양이온 소거능은 DPPH를 이용하여 측정 가능한 수소공여 항산화제와 연쇄절단형 항산화제에 모두 반응하므로 더 민감하게 항산화능을 측정 가능한 것으로 알려져 있다. 따라서 ABTS 라디칼 소거능을 측정하였다.
구체적으로, 7 mM ABTS(2,2’(3-ethylbenzthia-zoline-6- sulfonic acid)) 용액에 2.45 mM 과황산 칼륨(potassium persulfate)를 혼합하여 23℃의 어두운 곳에서 16시간 동안 반응시켜 734 nm의 파장에서 흡광도가 0.700±0.005가 되도록 에탄올로 희석하여 농도를 조정한 후, 시료 0.1 ㎖과 혼합시약 3.9 ㎖을 23℃에서 6분간 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측정하였고 양성 대조구로는 0.1% 아스코르브산(Daejung, Korea)를 이용하여 라디칼 소거능을 아래의 식에 의해 백분율(%)로 산출하여 나타내었다.
ABTS+ radical scavenging activity(%) = (1 - Sample O.D. / Control O.D.) x 100
그 결과, 도 18a 내지 도 18c에 나타난 바와 같이, 초산균 A26과 A37, B7을 접종하여 초기산도 pH 2 조건에서 발효시킨 꾸지뽕 발효식초는 발효기간에 따른 큰 차이를 나타내지 않았으나, A37은 산 생성이 우수한 초기산도 pH 3, 4와 발효온도 20℃ 조건에서 라디칼 소거능이 증가하는 경향을 보이며 발효종료 시 각각 49.05%와 48.38%로 ABTS+ 라디칼 소거능이 비교적 높게 나타났다. 초산균 B7은 pH 3, 4 조건에서 발효가 진행됨에 따라 감소하였으며, 특히 발효온도 30℃조건일 때 가장 낮게 나타나 pH 4 조건에서 발효 종료 시 24.29%로 측정되었다. 그러나 pH 4의 20℃조건에서 발효 종료 시 39.62%로 나타나 ABTS+ radical 소거능이 비교적 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.
결론적으로 초기산도 pH가 높고 발효온도가 낮은 조건에서 산 생성능이 우수했던 초산균 A37과 B7은 총페놀성화합물을 비교적 높은 함량으로 유지하며, 항산화능 측정으로 나타낸 DPPH와 ABTS+ radical 소거능이 산 생성능이 낮은 발효조건보다 높은 값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 3> 꾸지뽕 발효식초의 유기산, 유리아미노산 및 휘발성 향기 성분 함량 분석
<3-1> 꾸지뽕 발효식초의 유기산 함량 분석
상기 실시예 10-2에서 제조한 꾸지뽕 발효식초의 유기산을 초산균 A26, A37 및 B7을 초기 산도 pH 4, 발효온도 20℃의 조건에서 상기 실시예 9-5와 동일한 방법 및 조건으로 분석하였다.
그 결과, 하기 표 25에 나타난 바와 같이, 초기 산도 pH 4로 조절하여 20℃에서 초산발효 시킨 각각 초산균의 초산 발효물은 발효가 진행됨에 따라 유기산 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 초산균 A37과 B7로 제조한 꾸지뽕 식초는 유기산 함량이 0일차로부터 약 10배 정도 증가하여, 발효 종료시(30일) A37은 3,866.86 mg/100 ㎖, B7은 4,166.29mg/100 ㎖로 유기산 함량이 증가되었다(표 25). 특히 초산균 A37과 B7를 이용한 초산발효 시, 발효 종료 시점인 30일에 아세트산이 각 3,734.09 mg/100 ㎖, 3,934.45 mg/100 ㎖로 가장 많은 함량을 나타내어 각각 꾸지뽕 식초의 주요 유기산으로 확인하였다. 다음으로 검출된 젖산은 식초제조를 위한 당질의 알코올 발효 초기 젖산균이 번식하여 생성된 것이라 보며, 이어 시트르산 > 숙신산 > 말산 순으로 나타났다. 발효력이 낮게 나타난 초산균 A26은 시트르산이 462.11 mg/100 ㎖로 가장 높게 측정되었다. 아세트산을 비롯한 유기산은 과일식초의 산미와 지미를 형성할 뿐만 아니라, TCA 회로를 활성화하여 젖산분해 촉진 등의 기능성을 가지기 때문에 유기산 구성의 차이로 식초의 생리활성에 차이가 나타날 것이라 짐작된다.
Figure pat00017
<3-2> 꾸지뽕 발효식초의 유리아미노산 함량 분석
상기 실시예 10-2에서 제조한 꾸지뽕 발효식초의 유리아미노산을 초산균 A26, A37 및 B7을 초기 산도 pH 4, 발효온도 20℃ 의 조건에서 상기 실시예 9-6와 동일한 방법 및 조건으로 분석하였다.
그 결과, 하기 표 26에 나타난 바와 같이, 총 유리 아미노산 함량은 초산균 A26(0.195 mg/㎖) > B7(0.132 mg/㎖) > A37(0.078 mg/㎖) 순으로 나타나 산 생성능이 우수한 균주가 비교적 낮은 함량을 나타내며 발효가 진행될수록 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 원료에서 주로 유래되는 아미노산은 종류에 따라 맛에 영향을 주는 것으로 알려져 있지만 초산발효 중 자화되어 38∼60%가 감소한다고 보고된 결과와 유사한 경향을 나타내는 것으로 확인할 수 있었다.
Figure pat00018
<3-3> 꾸지뽕 발효식초의 휘발성 향기성분 분석
식초는 원료, 발효방법, 숙성 등의 과정을 거치면서 초산 이외의 산, 알데히드, 알코올, 케톤, 에스테르 류 화합물이 상호 복합적으로 작용하여 향과 맛을 형성한다. 따라서 균주별로 제조한 꾸지뽕 식초의 향을 조사하고자, 휘발성 향기성분을 하기와 같이 분석하였다.
구체적으로, 시료 3 ㎖을 headspace glass vial에 넣고 내부 표준물질로 지정한 2-메틸-1-펜탄올을 주입하여 시료가 담긴 바이알을 35℃로 30분간 평형상태에 도달시킨 후, 5분간 SPME 파이버(DVB/CAR/PDMS)에 노출시켜 휘발성 향기성분을 포집하고 200℃의 GC/MS 주입기에서 5분간 탈착시켜 휘발성 향기성분을 분석하였다. 분석에 사용한 GC/MS는 GC-2010 Plus, GCMS-TQ 8030 (Shimadzu, Tokyo, Japan)을 이용하였으며, 컬럼은 DB-WAX (30 mm×0.25 mm id, 0.25 ㎛ 필름 두께, J&W, USA)를 이용하였다. 온도는 40℃에서 3분간 머무른 뒤, 5℃/min의 속도로 90℃까지 승온 시키고, 19℃/min의 속도로 230℃까지 승온 시킨 후 5분간 유지하였다. 주입기 온도는 250℃로 설정하였으며, 캐리어 기체는 헬륨을 사용하였고 유속은 1.0 ㎖/min으로 하였다(표 27).
아이템 조건
GC 기기 GC-2010 Plus, GCMS-TQ 8030 (Shimadzu, Japan)
컬럼 DB-WAX (30 mm×0.25 mm id, 0.25 ㎛ 필름 두께, J&W, USA)
분석 방법 40℃(3분)→90℃(5℃/분) →230℃(19℃/분)→230℃(5분)
캐리어 기체 헬륨(1 ㎕/분)
주입 부피 1 ㎕
MS 주입 온도 250℃
이온 소스 온도 230℃
인터페이스 온도 280℃
검출 전압 0.1 kV
이벤트 시간 0.03 ch, 15 eV
그 결과, 하기 표 28 내지 표 30에 나타난 바와 같이, 산 생성능이 6.24%로 가장 높았던 초산균 A37에서 12종의 휘발성 성분이 검출되어 3종류의 초산균 중 가장 다양한 성분을 나타내는 것으로 확인하였다. 또한 발효종료 시(30일) 산 생성능이 우수한 A37과 B7은 아세트산, 에틸 에스테르의 성분이 가장 높게 나타나 각 59.18%와 37.53%로 측정되었으며, 이는 자극취를 나타내는 산미로서 초산균에 의해 생성되는 산화 생성물로 식초의 주된 휘발성 성분으로 나타났다. 산 생성능이 낮은 A26의 경우, 아세트산, 에틸 에스테르가 20.77%로 나타나 비교적 낮게 측정되었으며, 에탄올이 24.1%로 가장 높게 나타났다. 초산균 A37과 B7로 제조한 꾸지뽕 식초에서 공통적인 휘발성분은 아세트산, 에틸 에스테르, 3-메틸-1-부탄올(이소아밀 알코올), 2-하이드록시 벤조산(살리실산), 에탄올, 데칸알(오렌지향+지방), 2-에틸헥산올 등으로 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 결론적으로 초산균 A37과 B7로 제조한 꾸지뽕 식초는 유기산 함량이 0일차로부터 약 10배 수준 증가하여 발효종료 시(30일) A37은 3,866.86 mg/100 ㎖, B7은 4,166.29 mg/100 ㎖로 나타났으며 총아미노산 함량은 A37에서 0.078 mg/㎖, B7에서 0.132 mg/㎖로 측정되었다. 또한 향기성분을 분석한 결과, 산 생성능이 우수한 A37과 B7에서 비교적 다양한 휘발성 성분을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
Figure pat00019
Figure pat00020
Figure pat00021
한국농용미생물보존센터 KACC92206P 20171030
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Acetobacter pasteurianus A37 and manufacturing method of fermented Kujippong vinegar using the same <130> 2019P-10-021 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9F <400> 1 gagtttgatc ctggctcag 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1512R <400> 2 acggctacct tgttacgact t 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS1 <400> 3 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4 <400> 4 tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (10)

  1. 수탁번호 KACC 92206P로 기탁된 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 산 생성능, 알코올 내성 및 향기 생성능으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이 우수한 것인, 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 꾸지뽕 발효식초 제조용인 것인, 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주.
  4. 1) 꾸지뽕 착즙액을 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)에서 제조한 꾸지뽕 착즙액을 전처리하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 전처리가 완료된 꾸지뽕 착즙액을 알코올 발효시켜 꾸지뽕 발효주를 제조하는 단계;
    4) 상기 단계 3)의 꾸지뽕 발효주에 수탁번호 KACC 92206P로 기탁된 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 접종하여 꾸지뽕 발효식초를 제조하는 단계; 를 포함하는, 꾸지뽕 발효식초의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단계 2)의 전처리는
    1) 아스코르브산 0.1 내지 0.3%(w/v)을 첨가하여 갈변을 억제하는 단계; 및
    2) 셀룰라아제 및 펙티나아제를 1:1의 비율로 200 내지 400 ppm을 첨가하여 청징화시키는 단계; 를 포함하는 것인, 꾸지뽕 발효식초의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 단계 3)의 알코올 발효는 20 내지 27℃에서 10 내지 14일 동안 정치 발효시키는 것인, 꾸지뽕 발효식초의 제조방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 단계 4)의 꾸지뽕 발효식초는 수탁번호 KACC 92206P로 기탁된 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 이용하여 제조된 종초를 접종하여 제조되는 것인, 꾸지뽕 발효식초의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 종초는 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 7 내지 9%의 알코올 농도를 가진 꾸지뽕 발효주에 접종하여 27 내지 32℃에서 10 내지 14일 동안 배양하여 제조되는 것인, 꾸지뽕 발효식초의 제조방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 단계 4)는 초기 pH 3 내지 5의 꾸지뽕 발효주에 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A37 균주를 접종하여 18 내지 23℃에서 20 내지 35일 동안 정치 발효시키는 것인, 꾸지뽕 발효식초의 제조방법.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법으로 제조된 저온발효 꾸지뽕 발효식초.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080114264A (ko) * 2007-06-27 2008-12-31 김성호 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 농축액 제조방법 및이를 이용한 발효식초의 제조방법
KR20170013637A (ko) * 2015-07-28 2017-02-07 대한민국(농촌진흥청장) 아세토박터 파스테우리아누스 kacc92047p로 발효한 복분자 식초의 제조방법
KR101778436B1 (ko) * 2016-04-12 2017-09-14 중앙대학교 산학협력단 우수한 초산 생성능을 가지는 신규한 아세토박터속 slv-7 균주 및 이의 용도
KR20170108289A (ko) * 2016-03-17 2017-09-27 신비의꾸지뽕열매식초 영농조합법인 꾸지뽕 열매를 이용한 식초음료 제조방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080114264A (ko) * 2007-06-27 2008-12-31 김성호 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 농축액 제조방법 및이를 이용한 발효식초의 제조방법
KR20170013637A (ko) * 2015-07-28 2017-02-07 대한민국(농촌진흥청장) 아세토박터 파스테우리아누스 kacc92047p로 발효한 복분자 식초의 제조방법
KR20170108289A (ko) * 2016-03-17 2017-09-27 신비의꾸지뽕열매식초 영농조합법인 꾸지뽕 열매를 이용한 식초음료 제조방법
KR101778436B1 (ko) * 2016-04-12 2017-09-14 중앙대학교 산학협력단 우수한 초산 생성능을 가지는 신규한 아세토박터속 slv-7 균주 및 이의 용도

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