CN104745503A

CN104745503A - 一种枯草芽孢杆菌及其在淡雅型白酒中的应用

Info

Publication number: CN104745503A
Application number: CN201510058118.4A
Authority: CN
Inventors: 杨华; 赵述淼; 余祥虎; 冯举耀; 邓德政
Original assignee: HUBEI CHUYUANCHUN WINERY Co Ltd
Current assignee: Hubei Chuyuanchun Winery Co ltd
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2035-02-04
Also published as: CN104745503B

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其在淡雅型白酒中的应用，申请人从酒曲中筛选出了一株耐高温的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） CYC18；保藏编号：CCTCC NO.M2015037。将该枯草芽孢杆菌发酵液按0.1%～1%（w/w）比例添加到酿酒大曲中，可明显缩短生产淡雅型白酒的发酵周期，同时提高多元醇的含量， 2,3-丁二醇、丙三醇、己六醇等多元醇大量生成，赋予产品绵甜甘爽的特点。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在淡雅型白酒中的应用

技术领域

本发明涉及微生物白酒发酵技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌的筛选分离及在淡雅型白酒中的应用。

背景技术

淡雅型白酒属于浓香型白酒的分支，是一种在香气上具有幽雅、飘逸、细腻、诱人的自然发酵的复合香气的香型白酒。淡雅型白酒在口感上表现为柔绵而不浓艳，细腻、圆润，有柔软而无骨之感；在风格上既淡又雅,是淡和雅的高度和谐、高度统一；在生理反应上酒既要上得慢，又要去得快。目前，淡雅型白酒的酒体设计上通常采用降低骨架成分的含量，相应地增加复杂成分的含量和种类的方式。

浓香型白酒的生产采用泥窖固态发酵，原料一般选用高粱、大米、糯米、小麦、玉米等含淀粉原料，经糖化发酵后蒸馏而得。淡雅型白酒要求香气淡雅，口感绵柔，而传统的浓香型白酒采用陈年老窖、混蒸续渣工艺，得到的白酒往往香气浓郁，口感甘冽，不符合“淡雅”的定位。因此目前淡雅型白酒的生产通常采用不同的香型酒来组合勾兑或者通过对原酒的生产控制来解决(包括原料、糖化发酵剂、生产设备、发酵工艺和微生态环境等方面)。

大曲是浓香型白酒的糖化发酵剂，通常以小麦、大麦为原料(少数加入一定比例的豌豆、玉米)，粉碎过后加水压成的砖块状曲坯。曲块自身原料中的微生物以及经人工接种或与自然环境接触到的微生物开始生长，之后给予曲块适宜的品温和湿度使微生物自然生长繁殖富集并产生多种多样的酶类。微生物群落的多样性和相互之间作用以及酶作用于原料形成的风味前驱物质，使得大曲不仅成为大曲酒酿造过程的原料，也成为酿酒生产过程的糖化剂、发酵剂、生香剂和酒化剂。目前尽管通过气相色谱、质谱分析等手段可检测成品白酒中的香气成分，但仍存在着香味成分的形成是由哪些微生物参与以及哪一种微生物起着主导作用等问题。楚园春大曲中微生物的数量大，种类多，且含有数量巨大的嗜热微生物，其中以耐高温的芽孢杆菌为最多。

科研人员在白酒风味物质产生菌方面已经做了一些研究，如中国专利文献CN102268397 A公开了酱香特征香高效产生菌株及其在中国白酒酿造中的应用，该发明利用从中国白酒高温大曲中选育的3株地衣芽孢杆菌单独或混合应用于酱香型白酒生产工艺中，生产的白酒品质得到提高，酒的特征香更突出且更持久。CN 103789131 A公开了一种环状芽孢杆菌在酱香型白酒生产中的应用。该应用是在酱香型白酒生产工艺不变的条件下再使用环状芽孢杆菌HG12菌株，将菌株液体或固体培养物接种到酱香型白酒蒸酒后的固体料醅中，入池发酵，制得发酵酒醅，将酒醅蒸馏，制得酱香型白酒酒液。CN 1390942 A公开了一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株及其在生产浓酱兼香型白酒中的应用。该菌株以大豆或麸皮为发酵基质能够产香，发酵底物中游离氨基酸含量较高，具有较好的耐热性能，适用于兼香型及酱香型固态法白酒发酵生产，能够为生产用高温大曲增香，提升浓酱兼香型白酒的典型风味，经济环保。

上述研究表明，从大曲中分离得到产香微生物，经过培养再应用到白酒生产过程中，可以提高白酒中风味物质的含量，使酒的质量得以提高。虽然一株或几株产香微生物应用于大曲白酒生产过程中不能产生大曲白酒的所有风味物质，但对于提高其质量却有重要作用。在实际生产中，由于不同地区自然条件及企业制曲工艺的差别，白酒风味物质产生菌的种类和数量也会有差别。

本发明通过分离纯化筛选出一株枯草芽孢杆菌，扩大培养后加入淡雅型白酒粮醅中参与微生物发酵，大量胞外酶系迅速水解粮醅中的淀粉、蛋白质、纤维素、脂肪等大分子有机物，加快分解过程，并产生多种香味前体物质，同时能提高粮食利用率，缩短淡雅型白酒发酵周期。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CYC18，该细菌已于2015年1月16日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CYC18；保藏编号：CCTCC NO.M2015037，地址中国武汉武汉大学。该细菌具有酶活力高、生长迅速、抗逆性强的特点，对淀粉、蛋白质和纤维素等大分子有机物有很强降解力。

本发明还有一个目的在于提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CYC18在淡雅型白酒生产中的应用，利用本发明中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CYC18制备的淡雅型白酒，出酒率高，发酵周期短，淡雅风格典型。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种枯草芽孢杆菌，通过以下步骤筛选得到：

1)从湖北楚园春酒业股份有限公司取酿酒大曲，在80℃水浴锅中处理15min以杀死非芽孢菌，适当稀释后涂平板，根据菌落形态挑取典型单菌落(菌落近圆形，3-4.5mm，无光泽，中央隆凸，边缘钝齿状，灰白色)，通过镜检粗筛出芽孢杆菌。

2)通过生理生化及16SrDNA序列鉴定，最终筛选到一株枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CYC18，该细菌已于2015年1月16日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名:枯草芽孢杆菌CYC18Bacillus subtilis CYC18；保藏编号：CCTCCNO.M2015037，地址中国武汉武汉大学。

CYC18菌株具体有典型的枯草芽孢杆菌生理生化特征：该菌株在营养琼脂(LB)培养基上繁殖生长形成的菌落为近圆形，3-4.5mm，无光泽，中央隆凸，边缘钝齿状，灰白色，通过镜检G+，菌体杆状，单个排列，芽孢柱状，次端生，孢囊不膨大。生理生化特征为：明胶液化。发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和麦芽糖，不发酵半乳糖、阿拉伯糖和海藻糖。V.P阳性，M.R.阳性，H₂S弱阳性，脲酶阴性，接触酶阳性，好氧，耐7％NaCl。最适温度28～32℃，最高温度50℃。石蕊牛奶反应产碱，胨化，还原。利用硝酸盐。

LB培养基的配方(1L)：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g；LA再加琼脂15g。

一种枯草芽孢杆菌CYC18在淡雅型白酒中的应用，其应用过程为：

将枯草芽孢杆菌CYC18发酵液，按0.1％～1％(w/w)比例添加到酿酒大曲中，接种粮醅发酵生产淡雅型白酒。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明提供一种枯草芽孢杆菌，该菌株适用于淡雅型固态法白酒发酵生产，能够为生产用高温大曲增香，提升淡雅型白酒的典型风味，经济环保。

2、利用本发明所述的枯草芽孢杆菌，可缩短发酵周期20d左右，同时酒醅中2,3-丁二醇、丙三醇、己六醇等多元醇大量生成，赋予产品绵甜甘爽的特点。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌CYC18菌落和显微照片(1000×)。

具体实施方式

本发明实施例中实验方法及条件如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：

菌株分离

从湖北楚园春酒业股份有限公司取酿酒大曲，在80℃水浴锅中处理15min以杀死非芽孢菌，适当稀释后涂平板，根据菌落形态挑取典型单菌落(菌落近圆形，3-4.5mm，无光泽，中央隆凸，边缘钝齿状，灰白色)，通过镜检粗筛出芽孢杆菌。

复筛及鉴定

通过生理生化及16SrDNA序列鉴定，最终筛选到一株枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CYC18，该细菌已于2015年1月16日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名:枯草芽孢杆菌CYC18Bacillus subtilis CYC18；保藏编号：CCTCCNO.M2015037，地址中国武汉武汉大学。

CYC18菌株具体有典型的枯草芽孢杆菌生理生化特征：该菌株在营养琼脂(LB)培养基上繁殖生长形成的菌落为近圆形，3-4.5mm，无光泽，中央隆凸，边缘钝齿状，灰白色，通过镜检G+，菌体杆状，单个排列，芽孢柱状，次端生，孢囊不膨大(图1所示)。生理生化特征为：明胶液化。发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和麦芽糖，不发酵半乳糖、阿拉伯糖和海藻糖。V.P阳性，M.R.阳性，H₂S弱阳性，脲酶阴性，接触酶阳性，好氧，耐7％NaCl。最适温度28～32℃，最高温度50℃。石蕊牛奶反应产碱，胨化，还原。利用硝酸盐。

实施例2：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CYC18的放大培养

按葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、、KH₂PO₄ 3g/L，以65％(V/V)装液量配制发酵液，经121℃高温蒸汽消毒30min，降温至30℃，向其中接种菌龄10h的枯草芽孢杆菌种子液1％(v/v)，在30℃培养，控制搅拌转速维持溶氧(DO值30％-90％)。发酵24h放罐，平板计数枯草芽孢杆菌CYC18活菌量为4.8×10⁹cfu/ml。

实施例4：

CYC18菌株酶活性检测

准备好淀粉、酪蛋白和纤维素琼脂平板(以上三种培养基均为市售青岛海博商品化培养基)，将CYC18菌株在PA瓶中复苏，取5μl点接于平板上，培养。观察酪素和纤维素平板是否有水解环，往淀粉平板点接菌的四周滴加碘液，观察是否有水解环，并测定水解环直径。

表1 CYC18菌株降解能力

降解平板	淀粉平板	酪蛋白平板	纤维素平板
				降解圈(mm)	24.5	30.6	21.2

实施例5：

CYC18菌株耐热性检测

热耐受能力：取枯草芽孢杆菌CYC18生长末期已完全形成芽孢的培养液离心，0.9％生理盐水洗涤两次后重新悬浮(活芽孢数1.0～2.0×l0⁹cfu/ml)于75、80、85、90、95℃水浴中处理15min后，迅速流水冷却，然后采用稀释平板法测定芽孢存活率。

表2 CYC18菌株在不同温度处理下的存活率

温度(℃)	75	80	85	90	95
						存活率(％)	100	90.5	72.6	41.4	28.2

实施例6：枯草芽孢杆菌CYC18在淡雅型白酒的应用

粮醅蒸熟后，摊凉至18-21℃，按不同比例加入实施例2制备的枯草芽孢杆菌CYC18，投入量分别为大曲量的0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％(质量比)，拌匀后入池发酵，与未投入菌种的4个窖池做对比。发酵40d开始，将投入菌株的5口窖池和1号、2号对照窖池开窖，检测酒醅水分、酸度、还原糖、淀粉、酒精含量及多元醇等指标；发酵60d后，在开3号、4号对照窖池，检测其指标。与前面7口窖池指标对比，结果如表3所示。

表3 枯草芽孢杆菌CYC18在淡雅型白酒的应用

结果显示：1、发酵周期在40d时，添加枯草芽孢杆菌CYC18的窖池比未添加的窖池发酵效果要好，添加枯草芽孢杆菌CYC18的窖池与基本已经完成发酵过程；2、添加枯草芽孢杆菌CYC18的窖池发酵40d时，与未添加枯草芽孢杆菌的窖池发酵60d时的各项指标非常接近，可缩短白酒发酵周期；3、添加量为0.6％时，窖池的综合指标达到最佳；4、添加枯草芽孢杆菌的窖池后，酒醅中2,3-丁二醇、丙三醇、己六醇等多元醇大量生成，赋予产品绵甜甘爽的特点。

实施例7：淡雅型白酒的感官评定

将在实施例6中，枯草芽孢杆菌CYC18添加量为0.6％制备的原酒释至酒精度数为52％(v/v)，在20℃的品评环境下进行品评，以生产工艺相同未使用CYC18菌株所制得的白酒作对照。按照GB/T 10345-2007白酒分析方法中的要求，从色、香、味、格四个方面进行打分品评：色(10分)、香(25分)、味(50分)、格(15分)。品评人员由楚园春酒业省级评酒委员组成，每个由三名品评人员分三次进行品评，感官品评结果见表4。

表4 淡雅型白酒的感官评定结果

	色泽	香气	口味	风格	总分
						实验组	10	23	45.5	15	93.5
对照组	10	21	43	15	89

从白酒品评结果可知，将枯草芽孢杆菌CYC18菌应用于淡雅型白酒生产中，制得的白酒品质明显提高，其风味更加突出。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北楚园春酒业有限公司

<120> 一种枯草芽孢杆菌及其在淡雅型白酒中的应用

<130> 一种枯草芽孢杆菌及其在淡雅型白酒中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1444

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 1

agcggtctaa tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg atgttagcgg 60

cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc 120

ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcaa acataaaagg tggcttcggc 180

taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag 240

gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc 300

agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc 360

aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa 420

gtaccgttcg aatagggcgg taccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac 480

gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa 540

gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc 600

attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga 660

aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac 720

gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780

aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa 840

gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg 900

cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg 960

acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg 1020

catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080

cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg 1140

gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc 1200

tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc acaaatctgt 1260

tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc 1320

ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac 1380

gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttta ggagccagcc gccgaagtga 1440

cggt 1444

Claims

1.一种分离的枯草芽孢杆菌，其特征在于：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） CYC18；保藏编号：CCTCC NO.M2015037。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在在淡雅型白酒发酵中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌在缩短淡雅性白酒发酵周期中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌在提高白酒发酵多元醇含量中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的多元醇为2,3-丁二醇、丙三醇、己六醇中的一种或多种。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌在同时缩短淡雅性白酒发酵周期和提高白酒多元醇中的应用。