CN102586125B - 高产酯的东方伊萨酵母菌、其组合物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株新的高产酯东方伊萨酵母菌，含该菌的酿酒菌剂组合物以及高产酯东方伊萨酵母菌及酿酒菌剂组合物在白酒酿造中的应用。本发明还提供制备酿酒菌剂组合物的方法。本发明公开的高产酯东方伊萨酵母菌不但耐高温，更重要的是具有高产酯率和高酒精产率。品酒分数在90-95。采用该菌株发酵可形成白酒独特风味。

Description

高产酯的东方伊萨酵母菌、其组合物和应用

发明所属领域： 

本发明属于白酒酿造领域，具体地说，本发明涉及高产酯的东方伊萨酵母菌、含该菌的酿酒菌剂组合物，及该酵母菌和其组合物在白酒酿造中的应用 

背景技术：

中国白酒香味物质种类繁多，包括醇、醛、酮、酸、酯、缩醛、芳香族化合物、含氮化合物、含硫化合物、醚类、内酯类等化合物达数百种之多（庄名扬，酿酒，2007，34（2）：109-113）。中国白酒风味物质的形成，是微生物代谢的产物，同时也是原料中基本组分及非基本组分，在各类生物酶的直接或间接催化下的生物合成、非酶促化学反应和热降解反应等多种因素共同作用结果。 

白酒的风味与酿造微生物及酿造工艺也有直接关系。酿造基酒质量的高低对产品的最终质量的好坏起决定性的作用。白酒酿造中的生香酵母又称产酯酵母，主要属于产膜酵母和假丝酵母，大多为异型汉逊酵母及少数小圆型酵母属，是白酒和黄酒发酵产香的重要菌种（熊子书，酿酒科技，2002，5：19-21）。浓香型白酒以己酸乙酯为主的复合香，是由梭状芽孢杆菌，俗称己酸菌的作用，产于泥质发酵老窖或人工培养泥窖中，发酵周期长；清香型白酒以醋酸乙酯为主体香，在小曲、麸曲或液态法白酒中添加生香酵母，在发酵过程中生成醋酸及其乙酯。酒精发酵过程中酯的产生量与特殊的酵母菌种类有密切关系。 

白酒发酵要求酿酒菌剂具有产酯率高、产酒精率高并耐高温。重量和质量相同的原料使用不同的酿酒菌剂，形成不同的酒精产量和酯含量。好的酿酒菌剂使同样的原料酒精产量高、富含酯类，并使白酒纯香。但传统大曲虽然产酯率高，产酒率却较低，特别是大曲构成成份复杂，使白酒质量不稳定；而单个酵母菌或酿酒菌剂组合物不耐高温，虽发酵产酒率高但产酯率低，白酒品质较差。 

酒精发酵过程中酯的产生量与特殊的酵母菌种类有密切关系。乙酸乙酯的产生量高低被普遍认为是依赖于酯的合成和酯的水解之间的平衡。在最新审定通过的中国兼香型白酒国家标准中，总酯含量（以乙酸乙酯计）是划分白酒等级的重 要指标，优级酒总酯含量比一级酒高1倍（熊小毛等，2009）。如何提高白酒中总酯含量，提高白酒等级是白酒企业和研究者面对的技术难题。 

在中国专利CN201010520135.2中公开了一株东方伊萨酵母菌Z1，核菌耐42℃高温，液体发酵乙酸乙酯产量达229.06毫克/升，液体发酵产物酒精度可达5.2%。但总酯含量和发酵产物酒精度仍然偏低，在品酒感觉中，采用100分制，品酒分数在75-88，口感不甚理想。 

发明技术内容： 

本发明的一个目的是提供一种新的高产酯东方伊萨酵母菌株，该菌株不但耐高温，更重要的是高产酯和发酵产物酒精度高，使用该菌株发酵生产白酒，具有高产酯率和高酒精产率，品酒分数在90-95，并形成浓酱兼香型白酒独特风味。 

本发明的另一个目的是提供一种含有东方伊萨酵母菌的酿酒菌剂组合物。 

本发明的再一个目的是提供制备酿酒菌剂组合物的方法。 

本发明的再一个目的是提供东方伊萨酵母菌株在白酒发酵中的应用。 

本发明的再一个目的是提供酿酒菌剂组合物在白酒发酵中的应用。 

本发明公开了一株新的高产酯东方伊萨酵母菌，其特征在于,该菌株为东方伊萨酵母Z19株（Issatchenkia orientalisZ19），保藏于湖北省武汉市武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2011499，保藏日期是2011年12月31日。东方伊萨酵母Z19株从湖北白云边酒池分离经筛选获得。该菌株有如下特征：东方伊萨酵母Z19株可耐42℃高温，液体发酵乙酸乙酯产量高达270.29毫克/升，液体发酵产物酒精度可达5.98%。即东方伊萨酵母Z19株不但具有耐高温性能，更具有乙酸乙酯产力强，且较强的产酒精能力。使用该菌株发酵生产白酒，具有高产酯率和高酒精产率，品酒分数在90-95，并形成浓酱兼香型白酒独特风味。 

东方伊萨酵母Z19株形态特征是：菌落乳白色、形状为规则圆形、表面较平坦、干燥，培养较长时间后，芽生孢子延长呈梳妆交错，假菌丝分支分布，细胞呈圆形或椭圆形。 

东方伊萨酵母Z19株生化特征是：可发酵利用果糖，蔗糖；不能发酵利用D-半乳糖，纤维二糖，绵子糖，D-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖，D-海藻糖，L-鼠李糖，L-山梨糖和D-木糖。 

东方伊萨酵母Z19株耐高温及生长特征与Z1相似：YPD平板上划线接种，分别在33℃至42℃下培养均生长良好。在37℃培养时，菌株Z19在YPD培养基中延迟期明显比生香产酯酵母菌短，在早期的生长中具有明显的优势，而市售生香产酯酵母菌——安琪生香活性干酵母具有较长的延迟期。 

东方伊萨酵母Z19株耐酒精能力特征是：接种菌种到酒精度0-14%的YPD液体培养基中，30℃摇床培养24小时，OD_630nm测定酵母菌的生长浓度，东方伊萨酵母Z19株最高耐受酒精度为10%，表明酵母菌Z19的耐酒精能力好。 

东方伊萨酵母Z19株26S rDNA D1/D2区域基因序列分析显示：东方伊萨酵母Z19株与东方伊萨酵母NRRLY-5396株的同源性超过99%。 

东方伊萨酵母Z19株可耐42℃高温，液体发酵乙酸乙酯产量高达270.29毫克/升，液体发酵产物酒精度可达5.98%。 

本发明还公开了一种含东方伊萨酵母菌的酿酒菌剂组合物，该酿酒菌剂组合物主要成份是东方伊萨酵母Z19株及胞外产物。 

优先地，本发明还公开了一种含东方伊萨酵母菌的酿酒菌剂组合物，其特征在于它含有下列组份，以活菌数比计： 

东方伊萨酵母Z19  60% 

酒精酵母         40% 

其中东方伊萨酵母为CCTCC M2011499，酒精酵母为AS 2.300。 

酒精酵母AS 2.300为常用普通微生物菌种，登载于中国普通微生物菌种保藏管理中心目录，处于公开状态，科学工作者可向中国普通微生物菌种保藏管理中心索取。 

本发明还公开了制备固态酿酒菌剂组合物的方法，该方法包括如下步骤： 

1)菌种活化：分别接种东方伊萨酵母Z19株和酒精酵母AS 2.300于灭菌的糖度为12巴林的麦芽汁或米曲汁三角瓶培养基中，28～30℃摇床培养18-24天； 

2)固体培养：固体培养的配料是麸皮70％、玉米面30％，用玉米糖化液润料，加1％浓硫酸，蒸煮冷散后，将1）中活化培养的2种酵母菌液按3：2体积比混合接种后装盒，保持室温20℃左右，品温25℃左右，培养发酵2天； 

3)真空干燥：对发酵后的固体样品在45℃进行真空干燥处理，样品含水率低于10%后真空包装。 

在对产品进行活菌计数时，东方伊萨酵母Z19株和酒精酵母AS2.300的比例是3：2。 

本发明还公开了新的高产酯东方伊萨酵母菌在白酒酿造中的应用。 

本发明还公开了酿酒菌剂组合物在白酒酿造中的应用。 

本发明的优点： 

1、本发明提供的东方伊萨酵母Z19株是一株新的菌株，该菌株不但可耐42℃高温，液体发酵乙酸乙酯产量高达270.29毫克/升，液体发酵产物酒精度可达5.98%，分别比东方伊萨酵母Z1提高18%和15%，即东方伊萨酵母Z19株不但耐42℃高温，更具有高乙酸乙酯产力和较强的产酒精能力。 

2）使用东方伊萨酵母Z19株发酵生产白酒，通过品酒，品酒分数在90-95，较高于东方伊萨酵母Z1的75-88，并形成浓酱兼香型白酒独特风味，优级酒率达到100% 

3、东方伊萨酵母Z19株与酒精酵母混合制备酿酒菌剂，在目前通用的白酒固态发酵物料中添加酿酒菌剂进行发酵制酒，与东方伊萨酵母Z1株制备酿酒菌剂对比出酒率提高了1.4%，同时原酒中总酯的含量增加了4.4%，改善口感作用明显。 

附图说明

图1是东方伊萨酵母菌Z19株26S rDNA D1/D2区序列系统发育树图 

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。 

在本发明中涉及的微生物菌种情况如下： 

东方伊萨酵母Z19株（Issatchenkia orientalisZ19），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2011499 

对照菌株---东方伊萨酵母Z1株，在中国专利CN201010520135.2中进行了公开，公开日2011年6月22日，任何符合要求的研究者可从保藏机构索取。 

酒精酵母AS 2.300为常用普通微生物菌种，登载于中国普通微生物菌种保藏管理中心目录，处于公开状态，科学工作者可向中国普通微生物菌种保藏管理中心索取。 

安琪耐高温酿酒酵母TRADY为市场流通商品。 

东方伊萨酵母Issatchenkia orientalis NRRL Y-5396和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeCCTCCAY92003为常用普通微生物菌种，分别登载于美国农业部菌种保藏中心和中国典型培养物保藏中心目录，处于公开状态，科学工作者可向保藏中心索取。 

实施例 

实施例1东方伊萨酵母Z19的分离与鉴定 

1.1样品、培养基与试剂 

样品：白云边酒厂酿造车间已经高温堆积，即将入池的酒醅。 

培养基：①曲汁培养基。配制方法，以配制200mL曲汁培养基为例）：取酒醅20g，加水200mL，煮沸30min，过滤，补水定容至200mL，加蔗糖4g，115℃灭菌30min。②牛肉膏蛋白胨培养基（YPD）。如配固体培养基则另外添加总重1.5%的琼脂粉。 

Taq DNA聚合酶和dNTP购自上海申能博彩公司。DL2000marker购自大连宝生物公司。PCR引物16S-27F，16S-1492R委托北京奥科生物技术公司合成。 

1.2东方伊萨酵母Z19株的分离：从白云边酒厂堆积发酵料，包括堆积后高温酒醅、刚混合的酒醅和堆积后中等温度的酒醅中取样，将样品活化后加入到pH4.5-5.0的YPD液体培养基中，转速200rpm，温度30℃时富集培养48小时，然后取100μl经过一定梯度稀释后的培养液涂布到YPD培养基固体平板上，30℃培养48小时后，挑取典型酵母形态的单菌落，再在相同培养基固体平板上重复划线纯化三次后，4℃保存。然后通过粮食水解液发酵实验检验这些分离出来的菌株在发酵过程中的乙醇产率、乙酸乙酯产率，最后根据发酵试验结果筛选出产酒精能力和产酯率均较高的菌株25株。本发明人将分离的一株新的东方伊萨酵母菌Z19株（Issatchenkia orientalisZ19）保藏于湖北省武汉市武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2011499。保藏日为2011年12月31日。 

1.3东方伊萨酵母菌Z19株的鉴定：通过形态特征观察、生理生化测定及26S rDNA D1/D2区域基因序列分析结果对Z19进行鉴定。在鉴定中，本实验选择安琪耐高温酿酒酵母TRADY、东方伊萨酵母Issatchenkia orientalis NRR  LY-5396，和AS 2.300菌株作为对照菌株。安琪耐高温酿酒酵母TRADY为市场 流通商品；东方伊萨酵母Issatchenkia orientalis NRRL Y-5396和酿酒酵母AS 2.300为常用普通微生物菌种，分别登载于美国农业部菌种保藏中心和中国普通微生物菌种保藏管理中心索取目录，处于公开状态，科学工作者可向保藏中心索取。 

1.3.1东方伊萨酵母菌Z19株形态特征观察：菌落乳白色、形状为规则圆形、表面较平坦、干燥，培养较长时间后，芽生孢子延长呈梳妆交错，假菌丝分支分布，细胞呈圆形或椭圆形。 

1.3.2通过26S rDNA D1/D2区域序列分析进行系统发育地位鉴定 

用酵母菌基因组DNA提取试剂盒（BioFlux杭州博日科技有限公司提供）提取Z19的全DNA,然后以提取出来的全DNA为模板，进行PCR扩增，正向引物NL1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，反向引物NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。按以下的反应条件共进行30个循环：94℃预变性5min，94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸5min。所得PCR产物由北京奥科生物技术公司进行纯化及序列测定。将测定出来的Z19的26S rDNA D1/D2区域与GenBank核酸序列数据库中的序列进行比对，采用ClustalX软件进行匹配排列（align），用MEGA4.0软件中的neighbor-joining分析法构建系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验，最后用TreeView软件显示系统树。 

实验得到570bp的基因序列，在Genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，Z19与Issatchenkia orientalis NRRL Y-5396的同源性超过99%，符合Kuttzman&Robnett所定的同种内不同菌株见差异不超过1%的标准。 

1.3.3：东方伊萨酵母菌Z19株的生理生化实验测定结果： 

（1）发酵试验： 

（2）东方伊萨酵母菌Z19株与酒精酵母耐高温能力比较结果 

将酵母菌株在YPD平板上划线接种，分别在33℃和42℃下培养。 

注：++表示生长良好；+-表示生长微弱；-表示不生长。 

1.3.4东方伊萨酵母菌Z19株与酒精酵母耐酒精能力比较结果： 

将Z19株以及作为对照菌株的酿酒酵母AS 2.300和安琪耐高温酿酒酵母 TRADY分别接种到酒精度0-14%的YPD液体培养基中，30℃摇床培养24h，以不加菌的空白液体培养基做对照，OD_630nm测定酵母菌的生长浓度，结果表明酵母菌Z19和Z1最高耐受酒精度达10%，与酿酒酵母AS 2.300和安琪耐高温酿酒酵母TRADY耐受酒精度能力相当，高于NRRLY-5396和安琪生香活性干酵母的耐酒精能力。NRRLY-5396和安琪生香活性干酵母的耐酒精能力均低于9%。 

实施例2Z19的白酒发酵及产物分析 

以白云边酒业公司提供的高粱为发酵原料，经粉碎、液化、糖化后分别接种纯种酵母菌株Z19，并以NRRLY5396，AS 2.300,TRADY及Z1为对照，进行液体酒精发酵。每个菌种接种2瓶重复。高粱淀粉浓度测定为68.96%，料水比为1：3.5，液化糖化，33℃静止发酵72小时。酒精蒸馏物用于气相色谱分析。 

酒精发酵能力测定结果见表1。Z19液体发酵产物酒精度可达5.98%高于Z1的5.2%。 

表1酵母菌酒精发酵能力测定结果 

对上述酒精蒸馏样品作气相色谱分析，每个样品作2次重复。结果见表2。由表中可以看出，酵母菌Z19的乙酸乙酯产量高达270.29mg/L，比酵母菌Z1提高18%。 

表2各酵母菌株酒精蒸馏样品气相色谱分析结果（单位mg/L） 

实施例3.白酒尝评时的评分采用顺位品评法，对尝评结果用分数表示。酒的评分，是评酒员对所评酒样，按规定的项目和分数，结合自己的品评判断，给与一定的分数。各个项目的得分之和为该酒的总分数，根据每种酒得分的多少，即可排出优劣的名次。白酒评比，采用100分制，色占10分，香占25分，味占50分，风格占15分。评酒时，评酒员根据自己的实际感受，对样品的色、香、味、格进行全面的鉴别，表4为实施例发酵产物品酒分数，Z1酵母菌品酒分在75-89，Z19酵母菌品酒分在90-95。Z19发酵产物比Z1发酵产物为优。 

表3单菌发酵产物品酒分数 

	分数
		AS2.300	50-65
Z1	75-88
		Z19	90-95
NRRL Y5396	65-75

实施例4酿酒菌剂组合物的制备方法 

4.1菌种活化：分别接种东方伊萨酵母Z19株和酒精酵母AS 2.300于灭菌的糖度为12巴林的麦芽汁或米曲汁三角瓶培养基中，28～30℃摇床培养18-24小时； 

4.2固体培养：固体培养的配料是：麸皮70％、玉米面30％，用玉米糖化液润料，加1％浓硫酸，蒸煮冷散后，将4.1活化培养的2种酵母菌液按3：2体积比混合接种后装盒，保持室温20℃左右，品温25℃左右，培养2天发酵完毕； 

4.3真空干燥：对发酵后的固体样品在45℃进行真空干燥处理，样品含水率低于10%后真空包装； 

4.4酵母菌制剂组合物测定结果：采用稀释平板测定实验室制备的生香活性干酵母的活菌数达到20亿/g左右。东方伊萨酵母Z19和AS 2.300活菌数比例是3：2 

实施例5.酿酒菌剂组合物的白酒发酵及发酵产物分析 

将东方伊萨酵母菌Z19株和酒精酵母AS 2.300以3：2活菌数比混合作发酵剂，并以安琪生香活性干酵母和Z1酿酒菌剂组合物作对照，结果见表4。 

表4酵母菌混合菌株酒精发酵结果 

无论是Z19还是Z1酿酒菌剂组合物发酵液酒精度都较高，与安琪生香活性干酵母相当。 

对上述混合发酵酒精蒸馏样品进行气相色谱分析，结果见表5。 

由色谱分析可以看出，本发明提供的的酿酒菌剂组合物发酵液样品中乙酸乙酯含量为286.23比Z1菌对照组发酵液样品中乙酸乙酯含量为235.12高21.74%。 

表5酵母菌混合菌株发酵酒精蒸馏样品分析(单位mg/L) 

对上述混合发酵酒精蒸馏样品进行品酒，结果见表6，本发明提供的Z19酿酒菌剂组合物发酵液样品品酒分数在90-98，在10份实验样品酒，优级酒率100%。 

表6混合菌剂组合物发酵产物品酒分数 

	分数
		AS2.300：Z19=2：3	90-98
AY92003：Z1=1：1	80-90
		TRADY	60-70

实施例6酿酒菌剂组合物在白酒发酵中的应用 

6.1试验方法 

酒酷蒸酒后配入900kg粉碎的高粱、清蒸稻壳后蒸料，摊凉后将大曲、生香活性干酵母撒入，搅拌均匀，入池发酵30天后出池蒸馏。大曲用量为投料量20%。实验组为Z19酿酒菌剂组合物，活性干酵母用量为投料量的0.1%。对照组是Z1酿酒菌剂组合物，活性干酵母用量与Z19相同，都是0.1%。 

有关酒醅、酒样的检测参见相关文献；酒的理化指标检测按GB10345-89的白酒试验方法检测；主要仪器：色谱分析仪。 

6.2发酵酒醅分析结果 

从表6可以看出：对照中出池酒醅的淀粉为含量8.6%。添加生香活性干酵母的处理淀粉含量为8.1%，低于对照酒醅的含量，而酒精度为4.8，比对照的酒精度高。说明了在原料中加入生香活性干酵母Z19可以更加充分地利用淀粉，发酵更彻底。 

表6出、入窖池酒醅理化分析结果 

6.3酒质理化色谱分析结果试验结果及分析 

由表7可以看出：实验组酒样总酸量比对照组相当，总酯和乙酸乙酯都比对照高。对出酒率情况统计表明，对照组的出酒率为47.8%，含Z19酿酒菌剂组合物活性干酵母的实验组出酒率为49.2%，出酒率提高了1.4%。同时原酒中总酯的含量增加了4.4%，对改善口感作用明显。 

表7主要理化指标及微量成分统计（单位：g/L） 

对上述添加Z1的对照组和Z19的实验组菌剂混合发酵酒精蒸馏样品进行品酒，结果见表8，本发明提供的Z19酿酒菌剂组合物发酵液样品品酒分数在95-100，在10份实验样品酒，优级酒率100%。 

感官品评对比为：对照组酒样分数在95-100，评语是绵甜醇厚、香味谐调、酒体丰满；实验组酒样分数在95-100，评语为味醇优美、幽雅细腻、酒体丰满。由于乙酸乙酯为白酒的主要香味成分，表明配合使用生香活性干酵母可以明显改善酒质，使酒中的香气更加协调，口感更佳。 

表8混合菌组合物发酵产物品酒分数 

Claims (6)

1.一株高产酯的东方伊萨酵母菌，其特征在于，该菌株为东方伊萨酵母Z19株（Issatchenkia orientalis Z19），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2011499。

2.一种含权利要求1中所述东方伊萨酵母菌的酿酒菌剂组合物。

3.根据权利要求 2中 所述的酿酒菌剂组合物，其特征在于它含有下列组份，以活菌数比计： 

          东方伊萨酵母Z19      60% 

  酒精酵母            40%

其中东方伊萨酵母为CCTCC M2011499，酒精酵母为AS 2.300。

4.制备权利要求3中所述的酿酒菌剂组合物的方法，包括如下步骤：

1）菌种活化：分别接种东方伊萨酵母Z19株和酒精酵母AS 2.300于灭菌的糖度为12巴林的麦芽汁或米曲汁三角瓶培养基中，28～30℃摇床培养18-24 天；

2）固体培养：固体培养的配料是麸皮70％、玉米面30％，用玉米糖化液润料，加1％浓硫酸，蒸煮冷散后，将活化培养的2种酵母菌液按3：2体积比混合接种后装盒，保持室温20℃左右，品温25℃左右，培养发酵2天；

3）真空干燥：对发酵后的固体样品在45℃进行真空干燥处理，样品含水率低于10%后真空包装。

5.权利要求 1 所述的东方伊萨酵母菌在白酒酿造上的应用。

6.权利要求 2或3中所述的任何一种酿酒菌剂组合物在白酒酿造上的应用。

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