CN111004752B - 一株耐乙醇植物乳杆菌及其在发酵食品中的应用 - Google Patents

一株耐乙醇植物乳杆菌及其在发酵食品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐乙醇植物乳杆菌及其在发酵食品中的应用。本发明的植物乳杆菌XH‑1，分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2019年8月16日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.18390。本发明的耐乙醇植物乳杆菌，其酒精的耐受度可达到17％(V/V)，并且具有高产γ‑氨基丁酸的特性，在MRS培养基中产γ‑氨基丁酸的能力达到170g/l，并将其应用于酒类和醋类酿造生产。该菌株能在酒类和醋类酿造的高浓度乙醇环境下正常生长繁殖并高产γ‑氨基丁酸，生产过程可控，操作简单、方便；并且提高成品酒和醋中乳酸、乳酸乙酯和苯乙醇的含量，可大大提高成品酒和醋的感官品质。

Description

一株耐乙醇植物乳杆菌及其在发酵食品中的应用
技术领域
本发明涉及一株耐乙醇植物乳杆菌及其在发酵食品中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
米酒是一种低度饮料酒，其酒精含量一般在3％～14％，属于低酒精发酵酒。现代营养学认为米酒的营养价值在于酒液中除水和乙醇外，还含有糖分、有机酸、蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等营养物质。由于这些功能物质的存在，造就了米酒具有促进血液循环，促进新陈代谢，延年益寿等功效。果酒是以水果为原料经过发酵而成的低度饮料酒，富含糖、有机酸、酯类及多种维生素，含有丰富的具有增强免疫功能的SOD。酒类产品有很广阔的市场，果酒因其营养丰富、酒度低、节约粮食，更是酿酒行业发展的方向，所以将水果加工成果酒是对水果充分利用、加工升值的好方法。黄酒作为我国宝贵的物质遗产，与啤酒、葡萄酒一起被称为世界三大古酒，享有“国酒”的美誉。黄酒至今已有5000年的历史，据《国语》和《吕氏春秋》两部史书记载，春秋战国时代南方越国已有酿酒与饮酒的习俗。经过五千年的发展，如今黄酒已经具有了独特的酿造工艺和源远流长的酒文化。醋，是由古代酿酒大师杜康的儿子黑塔发明而来，因黑塔学会酿酒技术后，觉得酒糟扔掉可惜，由此不经意酿成了“醋”。苹果醋营养成分丰富，富含醋酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、多种氨基酸、维生素及生物活性物质，且口感醇厚，能起到软化血管、降血压、促进体内糖代谢、分解肌肉中的乳酸和丙酮酸而清除疲劳等作用。
γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物体内主要的抑制性神经递质，具有多种生理功能，如安神、降血压和利尿等，目前已经报道了多种能合成GABA的乳酸菌，包括短乳杆菌，植物乳杆菌，副干酪乳杆菌，乳酸乳球菌和鸟肠球菌等。但已报道的乳酸菌的GABA合成能力普遍偏低(普遍低于50g/L)，限制了实际应用。
目前，已知微生物特别是乳酸菌对酒类、醋类酿造过程中风味物质及有机酸的形成起至关重要的作用，其中较常见的有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和短乳杆菌等，它们都可以促进酒类风味成熟，增加酒类风味，使醋的口感更加柔和醇厚，但它们一般只在乙醇溶度不足4％的条件下才能生长繁殖。高浓度乙醇是形成米酒、果酒、黄酒和苹果醋发酵的能力来源，然而，常见的乳酸菌不太适应高乙醇酒精发酵过程，因此，提供一株耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌显得尤为重要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一株耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌，其酒精的耐受度可达到17％(V/V)，在MRS培养基中产γ-氨基丁酸的能力达到170g/l，并将其应用于酒类和醋类酿造生产。该菌株能在酒类和醋类酿造的高浓度乙醇环境下正常生长繁殖并高产γ-氨基丁酸，还能提高成品酒和醋中乳酸、乳酸乙酯和苯乙醇的含量，可大大提高成品酒和醋的感官品质。
本发明的第一个目的是提供一株耐乙醇植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2019年8月16日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18390。
本发明的第二个目的是提供所述的植物乳杆菌在发酵食品中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述的植物乳杆菌在酒类酿造中的应用。
进一步地，所述的酒类为白酒、米酒、果酒或黄酒。
本发明的第四个目的是提供所述的植物乳杆菌在食醋或果醋酿造中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种包含所述的植物乳杆菌的微生物菌剂。
进一步地，所述的菌剂为液态菌剂或固态菌剂。
本发明的第六个目的是提供一种利用所述的植物乳杆菌发酵酒类的方法，所述的方法是在含有待发酵原料的发酵液中同时接种酿酒酵母和植物乳杆菌进行发酵。
进一步地，所述的酿酒酵母为活性酿酒干酵母，每千克发酵液添加0.1-0.3g活性酿酒干酵母和0.5-2×1010个植物乳杆菌。
本发明的有益效果是：
本发明的耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌，其酒精的耐受度可达到17％(V/V)，在MRS培养基中产γ-氨基丁酸的能力达到170g/l，并将其应用于酒类和醋类酿造生产。该菌株能在酒类和醋类酿造的高浓度乙醇环境下正常生长繁殖并高产γ-氨基丁酸，生产过程可控，操作简单、方便；并且提高成品酒和醋中乳酸、乳酸乙酯和苯乙醇的含量，可大大提高成品酒和醋的感官品质。
生物材料保藏
植物乳杆菌XH-1，分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2019年8月16日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18390。
附图说明
图1为本发明所述耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1在MRS固体培养基上的菌落特征。
图2为本发明所述耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1的菌体形态。
图3为本发明所述耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1基于16S rRNA基因发育树图和电泳图。
图4为本发明所述耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1与植物乳杆菌F在添加乙醇15％、17％MRS体系下菌体生长状况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：本发明耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1和植物乳杆菌F的获得
分别称取10g酒醪加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，加入灭菌的玻璃珠，在涡旋振荡器上充分振荡10min，使酒醪充分散开。将上清液进行10倍梯度稀释，稀释度为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，用移液枪吸取0.5mL样液，采用平板涂布法，将样液均匀涂布于不同乙醇浓度的MRS筛选培养基上，将制备好的平板倒置于36℃恒温培养箱中培养5d，观察记录菌落特征形态。挑取能够在12％和17％乙醇添加量的培养基上生长良好的菌株通过多次划线分离培养分离出单个菌落，在乙醇12％MRS平板上挑出一株植物乳杆菌F、在乙醇17％MRS平板上挑出一株植物乳杆菌XH-1，然后将其接种到MRS斜面培养基上，保藏于4℃冰箱中备用，植物乳杆菌XH-1的菌落形态、特征如图1和2所示。
实施例2：本发明耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1和植物乳杆菌F在添加不同浓度乙醇MRS体系下的对比
从图4可以看出，植物乳杆菌XH-1在添加了15％乙醇MRS液体培养基中OD600nm达到4.42，在17％乙醇下OD600nm达到3.82，生长良好。而植物乳杆菌F在添加15％和17％乙醇的MRS液体培养基下OD600nm仅为0.21和0.18，生长严重受到高浓度乙醇的抑制，基本生长不出来。
实施例3：本发明耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1的16S rRNA鉴定实验
采用16S rDNA基因法对分离筛选的菌进行分子生物学的鉴定。根据原核生物体16S rDNA基因序列的高度保守性设计通用引物，以分离菌的DNA为模板扩增出细菌的16SrDNA基因片段，测定分离菌的16S rDNA基因序列，同GenBank中的基因序列进行同源性比对，以此确定分离菌的种属。
用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取耐乙醇植物乳杆菌XH-1(Lactobacillusplantarum XH-1)的全基因组DNA，采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，PCR扩增体系(25μL)：10×PCR Buffer 2.5μL，25mM MgCl2 2μL,2.5mM dNTP 1μL,10mΜ引物各0.5μL，模板(基因组)2.5μL，5U/μL TapDNA聚合酶0.2μL，加ddH2O至25μL。
PCR扩增程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35各循环；72℃延伸5min，降温至4℃，取出产物。
序列测定工作由扩增后的PCR产物送样测序，测序由上海生工生物科技有限公司完成。
所分离筛选的菌株基于16S rRNA基因发育树图和电泳图如图3所示，根据其形态特征、生理生化指标以及16S rDNA基因序列在NCBI中blast比对结果显示它与Lactobacillus plantarum有99.5％的相似度，故而鉴定菌株XH-1为耐乙醇植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2019年8月16日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.18390。
实施例4：利用高效液相色谱法(HPLC)鉴定发酵液中γ-氨基丁酸的含量的色谱条件
泵：四元梯度泵，流速0.45ml/min～0.8ml/min。
HypersilAA-ODS(2.1mm*200mm)色谱柱：柱温40℃。
流动相：A相为1.36gNaAC·3H2O、500ml纯净水、90μlTEA、1.5mlTHF、PH7.2；B相为1.36gNaAC·3H2O、100ml纯净水、PH7.2，200ml甲醇、500ml乙腈。
检测波长338nm。
实施例5：本发明耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1在米酒酿造中的应用
(1)蒸饭：以大米为原料，筛选除去碎米与杂质进行洗米，用清水洗至无白浊为止，然后浸米一段时间，将浸泡后的大米沥干，100℃蒸煮20-30min。
(2)接种：米饭蒸煮后用冷开水淋饭至室温，在步骤(1)得到的米饭中按重量比(g/kg)加入接种活性酿酒干酵母0.2g/kg和耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-11010个/kg，搅拌均匀。
(3)糖化：将步骤(2)得到的米饭转移到发酵罐内，并在饭中央挖井搭窝，将发酵罐置于30℃糖化6-8h。
(4)发酵：在糖化好的米中加入原料米质量的1.5倍质量的消毒蒸馏水，在30℃下发酵6-8d。
(5)米酒：将步骤(4)得到的发酵液过滤，灭菌，包装，即可得到米酒。
实施例6：本发明耐乙醇植物乳杆菌XH-1在果酒酿造中的应用
(1)猕猴桃汁制备：挑选完整，新鲜的猕猴桃2kg，清洗，去皮，破碎，榨汁，向汁液中加入水1kg和蔗糖0.1kg，混合后按重量比(g/kg)加入酶活20万U/g的果胶酶0.50g/kg，在55℃条件下酶解4h，得到猕猴桃汁；
(2)酒精发酵：在步骤(1)得到的猕猴桃汁按重量比(g/kg)加入活性酿酒干酵母0.2g/kg和耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1 1010个/kg，置于29℃条件下发酵7天获得猕猴桃发酵液；
(3)猕猴桃酒制备：发酵液过滤，灭菌，包装，即可得到猕猴桃酒。
实施例7：本发明耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1在黄酒酿造中的应用
(1)蒸饭：以大米为原料，筛选除去碎米与杂质进行洗米，用清水洗至无白浊为止，然后浸米一段时间，将浸泡后的大米沥干，100℃蒸煮20-30min。
(2)接种：米饭蒸煮后用冷开水淋饭至室温，在步骤(1)得到的米饭中转移至发酵罐内，加入等重量的清水，并按重量比(g/kg)加入2％麦曲、活性酿酒干酵母0.2g/kg和耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1 1010个/kg，搅拌均匀。
(3)发酵与搅拌：发酵温度为28℃，落料完成后开始计时，每隔8h进行搅拌，至48h时共搅拌6次。发酵6-8天，检测酒精度指标不再升高时结束发酵。
(4)压榨：发酵结束后，发酵醪液过板框过滤机进行压榨得到清酒。
(5)煎酒：清酒过煎酒灭菌机85℃灭菌30min。
(6)陈酿：煎酒后清酒入陈酿罐陈酿6个月。
(7)灭菌灌装：过灭菌机，85℃灭菌30min，热灌装。
实施例8：本发明耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1在苹果醋酿造中的应用
(1)苹果汁制备：选完整，新鲜的苹果2kg，清洗，去皮及去籽，破碎，榨汁，向汁液中加入水1kg和蔗糖0.1kg。
(2)酶解：在步骤(1)得到的苹果汁中按重量比(g/kg)加入酶活20万U/g果胶酶0.30g/kg和淀粉酶0.30g/kg，在55℃下酶解4-5h，得到苹果汁。
(3)灭菌：在步骤(2)得到的苹果汁在105℃下灭菌5min。
(4)酒精发酵：在步骤(3)得到的苹果汁转移到发酵罐内，按重量比(g/kg)加入活性酿酒干酵母0.2g/kg和耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1 1010个/kg，置于30℃条件下发酵5-7天。
(5)醋酸发酵：在步骤(4)得到的苹果酒中按重量比(g/kg)接入巴氏醋杆菌1010个/kg，置于30℃，200-300r条件下发酵3-4天。
对比例1：
该对比例与实施例4使用的原料种类及发酵条件均相同，仅在对比实施例中的步骤(2)中不添加耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1。
对比例2：
该对比例与实施例5使用的原辅料种类、添加数量及发酵条件均相同，仅在对比实施例中的步骤(2)中不添加耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1。
对比例3：
该对比例与实施例6使用的原辅料种类、添加麦曲及发酵条件均相同，仅在对比实施例中的步骤(2)中不添加耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1。
对比例4：
该对比例与实施例7使用的原辅料种类、添加数量及发酵条件均相同，仅在对比实施例中的步骤(4)中不添加耐乙醇及高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌XH-1。
表1米酒感官指标评分标准
Figure BDA0002346208870000061
表2果酒感官指标评分标准
项目 感官评价 评分
色泽(10分) 澄清，透明，猕猴桃酒呈深绿色，悦目适宜 9-10分
无明显的悬浮物，透明，猕猴桃酒呈绿黄色 6-8分
微混，猕猴桃酒呈微黄色 3-5分
失光，浑浊，无猕猴桃特征颜色 3分以下
滋味(10分) 酒体协调，醇香浓厚，酸甜爽口，回味无穷 9-10分
酒质平衡，口感柔和，甜酸适当 6-8分
酒质平衡，不够怡雅，略微苦涩 3-5分
酒体寡淡，不协调，有异味 3分以下
香气(10分) 果香、酒香浓郁优雅，香味纯正协调 9-10分
果香、酒香不突出，香味欠佳 6-8分
果香、酒香不足，或不悦人 3-5分
香气不良，或有其他异味，使人厌恶 3分以下
表3黄酒感官指标评分标准
Figure BDA0002346208870000071
表4果醋感官指标评分标准
Figure BDA0002346208870000081
实施例4-6与对比例1-3制备的酒，其品质分析如下表：
表5酒感官指标评分表
Figure BDA0002346208870000082
实施例7与对比例4制备的醋，其品质分析如下表：
表6醋感官指标评分表
Figure BDA0002346208870000091
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (9)

1.一株耐乙醇植物乳杆菌（lactobacillus plantarum ） ，其特征在于，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年8月16日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18390。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌在发酵食品中的应用。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌在酒类酿造中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的酒类为白酒、米酒或果酒。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌在食醋或果醋酿造中的应用。
6.一种包含权利要求1所述的植物乳杆菌的微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂为液态菌剂或固态菌剂。
8.一种利用权利要求1所述的植物乳杆菌发酵酒类的方法，其特征在于，所述的方法是在含有待发酵原料的发酵液中同时接种酿酒酵母和植物乳杆菌进行发酵。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的酿酒酵母为活性酿酒干酵母，每千克发酵液添加0.1-0.3g活性酿酒干酵母和0.5-2×1010个植物乳杆菌。
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