CN111363699A - 一株兼具生物胺降解活性和生物降酸活性的植物乳杆菌及其在果酒中的应用 - Google Patents

一株兼具生物胺降解活性和生物降酸活性的植物乳杆菌及其在果酒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株兼具生物胺降解活性和生物降酸活性的植物乳杆菌及其在果酒中的应用。该菌种是一株植物乳杆菌，分离自果皮，命名为Lactobacillus plantarum ZZ46，简称ZZ46，保藏号为CGMCC No.19241。本发明获得的植物乳杆菌ZZ46能高效降解果酒中的组胺、酪胺和尸胺，对高酒精度、低pH值、高SO2的酒体环境适应良好，能迅速降解果酒中的苹果酸，安全性高。本发明为我国水果产区生产高品质、安全的果酒产品提供了技术支持。获得该菌株经过了生物胺降解活性筛选、生物降酸活性筛选、耐受性筛选等多个步骤，为获得同类功能菌株提供了筛选方法与路径。

Description

一株兼具生物胺降解活性和生物降酸活性的植物乳杆菌及其 在果酒中的应用
技术领域
本发明涉及一株兼具生物胺降解活性和生物降酸活性的植物乳杆菌及其在果酒中的应用。
背景技术
果酒是以水果为原料经完全或部分酒精发酵后获得的饮料，以葡萄酒为典型代表。果酒具有营养丰富、节约粮食、酒精含量低、适用人群更广等优点，是国家提倡发展的一类酒产品。生物胺是一类含氮的低分子质量化合物的总称，在富含蛋白质的食品和含酒精的发酵饮料中广泛存在，主要经由氨基酸脱羧反应生成。果酒中的生物胺主要有组胺、酪胺、尸胺、腐胺、苯乙胺等，其中组胺的毒性最大，含量也较高，过量摄入时可导致人体出现头痛、心悸、血压升高、消化障碍等中毒反应。酪胺的毒性次之，易引起偏头痛和血压升高等不适症状。尸胺可以与亚硝酸盐反应产生致癌物质亚硝基胺，而且能抑制组胺和酪胺代谢酶的活性，从而增加组胺和酪胺的毒性。因此，某些欧盟国家已经设定部分生物胺在葡萄酒中的最大限量值，以确保葡萄酒的饮用安全。
果酒作为一种健康饮品，是国民经济中增长较快、最具活力的产业之一。但是目前我国果酒的生产存在若干重大的问题，如产品存在质量缺陷、存在安全隐患、产品同质化严重等，已严重影响到行业的健康发展。降低果酒的生物胺含量、消除安全隐患是提高果酒质量水平和竞争力的一个关键措施。在食品体系中加入能够降解生物胺的微生物是近几年来新兴起的方法，兼具高效性和经济性。利用带有生物胺分解活性的微生物来降解生物胺已经在某些食品中得到了初步应用，如香肠、鱼酱、乳制品等，但是在果酒中的尝试仍比较有限，这是因为果酒天然的“恶劣”环境(高乙醇浓度、低pH、高SO2浓度)能显著抑制生物胺分解微生物的活性，导致其作用效果大幅降低。来源于果酒自身的乳酸菌在此方面具有明显优势，这是基于乳酸菌具有不损害果酒营养组成、无二次污染、不产生新的毒性物质的优点，因此筛选和应用乳酸菌在降低果酒中生物胺的应用具有重大的实用价值。
此外，在果酒酿造过程中，通常面临着降酸问题，这是由生态条件、酿造原料的品种特性及栽培方式所决定的。对果酒而言，适量的有机酸可以赋予果酒醇厚感和清爽感，抑制病菌的活动，但是当果酒中的有机酸含量较高时，会给人以酸涩、粗糙的感觉。现代降酸工艺的研究和发展方向主要是生物降酸法，其典型代表是苹果酸-乳酸发酵(MLF)，这是酿造果酒过程中除了酒精发酵外非常重要的二次发酵过程，即在乳酸菌的作用下，将L-苹果酸转化为L-乳酸，并释放出CO2的过程，具有改善果酒的口感，降低酸度和涩度，增强微生物的稳定性、增加风味复杂性等作用。
我国独特复杂的地理、气候条件决定了我国的果酒产区存在着优良的自然乳酸菌株，但是多功能乳酸菌株，即兼具生物胺分解能力与有机酸降解能力的优异菌株鲜有报道，因此筛选出适合我国果酒生产的优良乳酸菌株，实现资源的开发利用，对保障果酒的品质和安全意义重大。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一株兼具生物胺降解活性和生物降酸活性的植物乳杆菌，能高效降解果酒中的组胺、酪胺和尸胺的同时迅速降解果酒中的苹果酸，改善果酒的风味，提高果酒的安全性，且酒体环境适应性良好。
具体技术方案如下：
一株兼具生物胺降解活性和生物降酸活性的植物乳杆菌，其保藏编号为CGMCCNo.19241。
该菌种是一株植物乳杆菌，命名为Lactobacillus plantarum ZZ46，简称ZZ46，已保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.19241。
ZZ46菌株对高酒精度、低pH值、高SO2的酒体环境适应良好，可实现对果酒中的组胺、酪胺和尸胺的高效降解，并能迅速降解果酒中的苹果酸，安全性高。
本发明的试验所用的出发菌株，采集自山东烟台、青岛、日照等多县市的果园，来源包括葡萄、蓝莓、樱桃、桑葚。
本发明的第二个目的在于提供上述菌株YJ04在果酒中的应用。
所述的应用包括在果酒中生物胺的降解和果酒的降酸。
所述生物胺包括组胺、酪胺和尸胺中的一种或多种，所述降酸包括苹果酸的降解。
本发明中的菌株YJ04的筛选方法包括如下步骤：
(1)乳酸菌株的筛选：利用生理盐水提取水果表皮的微生物，涂布于MRS分离培养基，静置培养，分离得乳酸菌。
具体方法如下：
向1mL生理盐水中加入5g水果表皮，振荡后得到微生物粗提液，而后对该粗提液进行梯度稀释，梯度分别是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，吸取0.1～0.2mL不同梯度的稀释液涂布于MRS分离培养基上，30℃静置培养3～7天，观测菌落形成情况。挑取产生透明圈的菌落，反复进行划线分离直至获得纯菌落。
所述的MRS培养基在其原基础成分上添加50mg/L万古霉素、50mg/L放线菌酮和5g/L碳酸钙。
其中，MRS固体培养基的组成为：牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，吐温-80 1.0g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，琼脂20g/L，pH 6.4。
通过革兰氏染色、过氧化氢酶试验等检测技术，发现所有菌株均无芽孢、革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性、无运动性；显微镜下观察细胞呈现杆状或球状，因此初步鉴定为乳酸菌。
(2)兼具生物胺降解活性和生物降酸活性乳酸菌株的筛选：
a.筛选具有生物胺降解活性的菌株：将步骤(1)分离得的乳酸菌接种于含生物胺的MRS培养基，定时进行生物胺含量检测。
具体为：将筛选获得的乳酸菌株按107cfu/ml接种量加入含组胺、酪胺、尸胺各50mg/L的MRS培养基中，每隔24h进行生物胺含量检测。生物胺浓度检测参照《GB 5009.208-2016食品中生物胺含量的测定》执行。
b.筛选不具备氨基酸脱羧酶活性的菌株：具有氨基酸脱羧酶活性的乳酸菌可作用于果酒中的氨基酸从而产生生物胺，为降低生物胺含量，需使用不具备氨基酸脱羧活性的乳酸菌株。将步骤(2a)获得的菌株接种于含组氨酸、酪氨酸、赖氨酸的MRS培养基，定时进行生物胺含量检测。
具体为：分别配置含组氨酸、酪氨酸、赖氨酸2g/L的MRS培养基，灭菌冷却后接入候选菌株，接种量为107cfu/ml，每隔24h进行生物胺含量检测，以不接种的含上述氨基酸的MRS培养基为空白。生物胺浓度检测参照《GB 5009.208-2016食品中生物胺含量的测定》执行。
c.筛选具有生物降酸活性的菌株：将步骤(2b)分离得的乳酸菌接种于含苹果酸的MRS培养基，通过纸层析检测获得具备降酸能力的菌株。
具体的，将筛选获得的乳酸菌株按107cfu/ml接种量加入含2g/L苹果酸的MRS培养基中，每隔24h进行纸层析监测。观察苹果酸和乳酸斑点的变化，以层析纸上乳酸斑点扩大和苹果酸斑点消失所持续的时间来判断生物降酸进程。
d.筛查菌株的耐受性:将步骤(2c)获得的菌株接种于含有乙醇、SO2的酸性MRS培养基，获得高抗性菌株。
具体的，将步骤(2c)分离得的乳酸菌进行复筛，筛选标准为能够较好的耐受酒体“恶劣”环境(低pH、高乙醇浓度、高SO2浓度)且能够正常增殖。实验包含单因子抗性实验(pH、SO2、乙醇)和复合因子抗性实验。pH包括3.0、3.4、3.8三个因素；SO2浓度包括30mg/L、50mg/L、60mg/L三个因素；酒精度包括10％、13％、15％(v/v)三个因素。复合因子筛选同时含有以上3个单因素。
将菌体纯培养物按107cfu/mL的接种量接入含有单因子或复合因子的MRS培养基中，30℃静置培养3～7天，用比浊法对菌密度进行测定(OD600nm)。7天后菌密度仍小于5×107CFU/mL为不生长。
实验结果表明，随着选择压的不断增大，各乳酸菌株的生长量均明显减小。ZZ46能够较好的耐受各种抗性因子，生长不受抑制，而且能够分解快速降解三种生物胺，快速分解苹果酸。
基于以上优势，选定ZZ46作为苹果酸乳酸发酵菌株，并对其进行分子生物学鉴定。
本发明还提供了低产或不产生物胺果酒的制备方法，制备过程中使用菌株ZZ46。
使用植物乳杆菌ZZ46作为苹果酸乳酸发酵菌株的果酒酿造步骤如下：
酿造水果→去梗、破碎→果实预处理(调整SO2、总糖)→添加果胶酶→接种酿酒酵母→酒精发酵→接种植物乳杆菌ZZ46→苹果酸-乳酸发酵，生物胺降解→下胶澄清→冷冻→过滤→灌装
具体为：
酿造水果采摘后，去梗、破碎，输入发酵罐中，加入50mg/L SO2抑制果浆氧化，再加入30mg/L果胶酶反应6～12h。添加酿酒酵母之前，必须调整果浆中的总糖浓度(≥160g/L)，然后接种酿酒酵母，并于24～28℃持续发酵7～8天。
酒精发酵过程中，监测总糖和酒精度的变化，定期搅拌循环。当醪液中总糖小于4g/L时，除去酿酒酵母和其它果渣，终止酒精发酵。
接下来以106～108cfu/mL接种量接入植物乳杆菌ZZ46，启动MLF(苹果酸-乳酸发酵)并监测苹果酸的变化。
植物乳杆菌ZZ46在接种前需要活化，方法为从冻藏管里取出适量ZZ46，转接至MRS液体培养基中，30℃静置培养1～3天，离心后取菌体，并用无菌水洗涤2～3次。
MLF在20～25℃持续约14～21天，在此过程中三种生物胺(组胺、酪胺、尸胺)的含量均会显著降低。
发酵结束后，除去酒渣，并加入80～100mg/L SO2。
而后进行下胶处理，7～10天后转罐。
采用硅藻土过滤除去悬浮物，并将果酒置于-2～5℃下冷处理7～10天，再用板框过滤机精滤，最后罐装。
【生物保藏说明】
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册编号：CGMCCNo.12941；
参椐的生物材料(株)：ZZ46；
上述请求保藏的生物材料(株)附有建议的分类命名：植物乳杆菌、Lactobacillusplantarum。
该生物材料(株)已于2019年12月25日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收到，并登记入册。
该生物材料(株)的存活性经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心于2019年12月25日检测，结果是存活。
本发明的有益效果如下：
本发明获得的植物乳杆菌ZZ46能高效降解果酒中的组胺、酪胺和尸胺，对高酒精度、低pH值、高SO2的酒体环境适应良好，能迅速降解果酒中的苹果酸，安全性高。本发明为我国水果产区生产高品质、安全的果酒产品提供了技术支持。获得该菌株经过了生物胺降解活性筛选、生物降酸活性筛选、耐受性筛选等多个步骤，为获得同类功能菌株提供了筛选方法与路径。
附图说明
图1为植物乳杆菌ZZ46的菌落形态；
图2为ZZ46的16S rDNA基因扩增电泳图；
图3为ZZ46的recA基因扩增电泳图；
图2中，泳道1和2为16S rDNA基因扩增产物；泳道3为3000bp DNA分子量标准；
图3中，泳道1为3000bp DNA分子量标准；泳道2为recA基因扩增产物。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例中使用的果胶酶活力单位为120～180U/g，干酿酒酵母的活酵母数大于1010cfu/g。
实施例1菌株ZZ46的筛选分离与鉴定
一、菌株的筛选分离
(1)乳酸菌株的筛选：
向1mL生理盐水中加入5g水果表皮，振荡后得到微生物粗提液，而后对该粗提液进行梯度稀释，梯度分别是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，吸取0.2mL不同梯度的稀释液涂布于MRS分离培养基上，30℃静置培养3～7天，观测菌落形成情况。挑取产生透明圈的菌落，反复进行划线分离直至获得纯菌落。
所述的MRS培养基在其原基础成分上添加50mg/L万古霉素、50mg/L放线菌酮和5g/L碳酸钙。
其中，MRS固体培养基的组成为：牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，吐温-80 1.0g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，琼脂20g/L，pH 6.4。
通过革兰氏染色、过氧化氢酶试验等检测技术，发现所有菌株均无芽孢、革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性、无运动性；显微镜下观察细胞呈现杆状或球状，因此初步鉴定为乳酸菌。
(2)兼具生物胺降解活性和生物降酸活性乳酸菌株的筛选：
a.筛选具有生物胺降解活性的菌株：将步骤(1)分离得的乳酸菌株按107cfu/ml接种量加入含组胺、酪胺、尸胺各50mg/L的MRS培养基中，每隔24h进行生物胺含量检测。生物胺浓度检测参照《GB 5009.208-2016食品中生物胺含量的测定》执行。
b.筛选不具备氨基酸脱羧酶活性的菌株：分别配置含组氨酸、酪氨酸、赖氨酸2g/L的MRS培养基，灭菌冷却后，将步骤(2a)获得的菌株接种于其上，接种量为107cfu/ml，每隔24h进行生物胺含量检测，以不接种的含上述氨基酸的MRS培养基为空白。生物胺浓度检测参照《GB 5009.208-2016食品中生物胺含量的测定》执行。
c.筛选具有生物降酸活性的菌株：
降酸活性筛选：将步骤(2b)分离得的乳酸菌株按107cfu/ml接种量加入含2g/L苹果酸的MRS培养基中，每隔24h进行纸层析监测。观察苹果酸和乳酸斑点的变化，以层析纸上乳酸斑点扩大和苹果酸斑点消失所持续的时间来判断生物降酸进程。
d.筛查菌株的耐受性:将步骤(2c)获得的菌株接种于含有乙醇、SO2的酸性ATB和MRS培养基，获得高抗性菌株。
具体的，将步骤(2c)分离得的乳酸菌进行复筛，筛选标准为能够较好的耐受酒体“恶劣”环境(低pH、高乙醇浓度、高SO2浓度)且能够正常增殖。实验包含单因子抗性实验(pH、SO2、乙醇)和复合因子抗性实验。pH包括3.0、3.4、3.8三个因素；SO2浓度包括30mg/L、50mg/L、60mg/L三个因素；酒精度包括10％、13％、15％三个因素。复合因子筛选同时含有以上3个单因素。
将菌体纯培养物按107cfu/ml的接种量接入含有单因子或复合因子的MRS培养基中，30℃静置培养3～7天，用比浊法对菌密度进行测定(OD600nm)。7天后菌密度仍小于5×107CFU/mL为不生长。
实验结果表明，随着选择压的不断增大，各乳酸菌株的生长量均明显减小。ZZ46能够较好的耐受各种抗性因子，生长不受抑制，而且能够分解快速降解三种生物胺，快速分解苹果酸。
基于以上优势，选定ZZ46作为苹果酸乳酸发酵菌株，并对其进行分子生物学鉴定。菌株ZZ46在MRS培养基上的生长情况如图1所示。
二、菌株的鉴定
选定ZZ46作为降酸菌株，并对其进行分子生物学鉴定。
采用天根生化科技有限公司的细菌DNA提取通用试剂盒提取菌株的基因组DNA。
使用乳杆菌16S rDNA基因通用引物(Scarpellini,M.,Mora,D.,Colombo,S.,Franzetti,L.Development of genus/species-specific PCR analysis foridentification of Carnobacterium strains.Curr.Microbiol.2002，45(1):24-29.)和recA基因(Torriani,S.,Felis,G.E.,Dellaglio,F.Differentiation of Lactobacillusplantarum,L.pentosus,and L.paraplantarum by recA gene sequence analysis andmultiplex PCR assay with recA gene-derived primers.AppliEnviron.Microbiol.2001,67(8):3450-3454.)的特异性引物扩增，引物序列如表1所示。
表1 16S rDNA基因和recA基因的PCR扩增引物和条件
Figure BDA0002415972560000101
通过对菌株ZZ46的16S rDNA基因和recA基因进行PCR扩增，分别获得了大小为1475bp和319bp的基因片段，如图2、3所示。
图2中，泳道1和2为16S rDNA基因扩增产物；泳道3为3000bp DNA分子量标准；
图3中，泳道1为3000bp DNA分子量标准；泳道2为recA基因扩增产物。
所得扩增产物纯化后测序，输入GenBank中进行同源性比对，结果显示菌株的recA基因片段与植物乳杆菌均达到97％以上，由此可判定ZZ46为植物乳杆菌。
实施例2植物乳杆菌ZZ46在蛇龙珠葡萄酒中的应用
使用菌株ZZ46参与蛇龙珠葡萄酒酿造：
以蛇龙珠葡萄为原料，酿造水果采摘后，去梗、破碎，输入发酵罐中，加入50mg/LSO2抑制果浆氧化，再加入30mg/L果胶酶反应12h。添加酿酒酵母之前，添加蔗糖至总糖浓度达到210g/L。
然后接种酿酒酵母Lalvin D254(300mg/L果浆)，并于26℃持续发酵8天。酒精发酵过程中，监测总糖和酒精度的变化，定期搅拌循环。当醪液中总糖小于4g/L时，酒精发酵已进行了8天，除去酿酒酵母和其它果渣，终止酒精发酵。
接下来以107cfu/ml接种量接入植物乳杆菌ZZ46，启动MLF(苹果酸-乳酸发酵)并监测苹果酸的变化。植物乳杆菌ZZ46在接种前需要活化，方法为从冻藏管里取出适量ZZ46，转接至MRS液体培养基中，30℃静置培养1天，离心后取菌体，并用无菌水洗涤2次。
MLF(苹果酸-乳酸发酵)在22℃持续21天，在此过程中三种生物胺(组胺、酪胺、尸胺)的含量均会显著降低。发酵结束后，离心除去酒渣和乳酸菌，并加入100mg/L SO2。
而后使用皂土进行下胶处理，7天后转罐。冷冻前采用硅藻土过滤除去葡萄酒的悬浮物，去除率达到96％，之后置于-1℃下冷处理7天，再用0.22微米板框过滤机精滤，工作压力为0.2～0.3MPa，最后罐装。
实验例1准备实施例2的空白对照：
进行自然苹果酸-乳酸发酵的蛇龙珠葡萄酒。除不使用菌株ZZ46、MLF时间延长至37天外，空白对照的所用方法与参数均与实施例2相同。
实验例2准备实施例2的菌株对照：
采用商业化酒类酒球菌Viniflora，该菌株为低产生物胺乳酸菌，但不能降解酒体中已有的生物胺。除使用球菌Viniflora替代菌株ZZ46外，菌株对照的所用方法与参数均与实施例2中相同。
实验1：实施例2、实验例1、实验例2中苹果酸-乳酸发酵过程中乳酸菌的检测。
MLF(苹果酸-乳酸发酵)过程中定时取样，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释，并涂布于MRS菌落计数固体培养基上(在MRS中添加50mg/L制霉菌素)，30℃静置培养7天，观测菌落形成情况，并对菌落进行计数。
实验结果表明，接种植物乳杆菌ZZ46和商业化乳酸菌Viniflora的葡萄酒都能快速启动发酵过程，效率较高。ZZ46和Viniflora仅需要2天适应葡萄酒的酒体环境，而后进入对数生长期；待发酵进行14和16天时，ZZ46和Viniflora的细胞数分别达到最高，为3.41×108cfu/mL和6.27×108cfu/mL；随后ZZ46以较快的速度衰亡，而Viniflora衰亡的较慢。在接种ZZ46和Viniflora的葡萄酒中，苹果酸的降解分别从第2天和第3天开始，均持续了21天。而进行自然MLF的葡萄酒则需要37天才能完成降酸过程。
实验2：发酵结束、离心除去酒渣乳酸菌后，对实施例2、实验例1、实验例2葡萄酒的理化指标、生物活性组分以及生物胺含量进行测定。
检测结果如表2和表3所示。
表2葡萄酒酒体成分
Figure BDA0002415972560000121
接种ZZ46的葡萄酒未引起挥发酸的显著性升高，而且较好的萃取和保留了葡萄中总酚和单宁类化合物，能够赋予葡萄酒更鲜艳的颜色和更丰满、完整的口感，感官品质更佳。接种Viniflora的葡萄酒的多项指标与ZZ46相似，而进行自然苹乳发酵的葡萄酒呈现出较高的挥发酸浓度，总酚和单宁类化合物的浓度也较低，品质不及ZZ46和Viniflora。
表3葡萄酒中的生物胺含量
Figure BDA0002415972560000131
植物乳杆菌ZZ46酿制的葡萄酒的生物胺含量大幅降低，组胺、酪胺、尸胺含量仅有空白对照的21.1％、38.7％和50.2％，是菌株对照葡萄酒的56.4％、55.6％和45.4％，说明ZZ46具备降解酒体中的生物胺的能力。
实施例3植物乳杆菌ZZ46在樱桃酒中的应用
使用菌株ZZ46参与樱桃酒酿造：
以大紫樱桃为原料，酿造水果采摘后，去梗、破碎，输入发酵罐中，加入50mg/L SO2抑制果浆氧化，再加入30mg/L果胶酶反应12h。添加酿酒酵母之前，添加蔗糖至总糖浓度达到210g/L。
然后接种酿酒酵母Lalvin D254(300mg/L果浆)，并于26℃持续发酵7天。酒精发酵过程中，监测总糖和酒精度的变化，定期搅拌循环。当醪液中总糖小于4g/L时，除去酿酒酵母和其它果渣，终止酒精发酵。
接下来以107cfu/ml接种量接入植物乳杆菌ZZ46，启动MLF(苹果酸-乳酸发酵)并监测苹果酸的变化。植物乳杆菌ZZ46在接种前需要活化，方法为从冻藏管里取出适量ZZ46，转接至MRS液体培养基中，30℃静置培养1天，离心后取菌体，并用无菌水洗涤2次。
MLF(苹果酸-乳酸发酵)在25℃持续16天，在此过程中三种生物胺(组胺、酪胺、尸胺)的含量均会显著降低。发酵结束后，离心除去酒渣和乳酸菌，并加入80mg/L SO2。
而后使用皂土进行下胶处理，7天后转罐。冷冻前采用硅藻土过滤除去葡萄酒的悬浮物，去除率达到96％，之后置于-1℃下冷处理7天，再用0.22微米板框过滤机精滤，工作压力为0.2～0.3MPa，最后罐装。
实验例3准备实施例3的空白对照：
进行自然苹果酸-乳酸发酵的大紫樱桃酒。除不使用菌株ZZ46、MLF时间延长至28天外，空白对照的所用方法与参数均与实施例3相同。
实验例4准备实施例3的菌株对照：
采用商业化酒类酒球菌Viniflora，该菌株为低产生物胺乳酸菌，但不能降解酒体中已有的生物胺。除使用球菌Viniflora替代菌株ZZ46外、MLF时间延长至17天外，菌株对照的所用方法与参数均与实施例3中相同。
实验3：实施例3、实验例3、实验例4中苹果酸-乳酸发酵过程中乳酸菌的检测。
MLF(苹果酸-乳酸发酵)过程中定时取样，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释，并涂布于MRS菌落计数固体培养基上(在MRS中添加50mg/L制霉菌素)，30℃静置培养7天，观测菌落形成情况，并对菌落进行计数。
实验结果表明，接种植物乳杆菌ZZ46和商业化乳酸菌Viniflora的樱桃酒都能快速启动苹果酸乳酸发酵，效率较高。ZZ46和Viniflora仅需要1天适应大紫樱桃酒的酒体环境，而后进入对数生长期；待发酵进行9天时，ZZ46和Viniflora的细胞数分别均达到最高，为5.22×108cfu/mL和3.95×108cfu/mL；随后ZZ46以较快的速度衰亡，而Viniflora衰亡的较慢。在接种ZZ46和Viniflora的樱桃酒中，苹果酸的降解均从第2天开始，分别持续了16和17天。而进行自然苹乳发酵的樱桃酒则需要28天才能完成降酸过程。
实验4：发酵结束、离心除去酒渣和乳酸菌后，对实施例3、实验例3、实验例4樱桃酒的理化指标、生物活性组分以及生物胺含量进行测定。
检测结果如表4和表5所示。
表4樱桃酒的酒体成分
Figure BDA0002415972560000151
接种ZZ46的樱桃酒未引起挥发酸的显著性升高，而且较好的萃取和保留了樱桃中总酚类化合物，能够赋予樱桃酒更鲜艳的颜色和更立体口感，感官品质更佳。
表5樱桃酒的生物胺含量
Figure BDA0002415972560000152
植物乳杆菌ZZ46酿制的樱桃酒的生物胺含量大幅降低，组胺、酪胺、尸胺含量仅有空白对照的30.5％、47.5％和21.6％，是菌株对照樱桃酒的59％、44％和44.6％，再次证明ZZ46优异的生物降解能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一株兼具生物胺降解活性和生物降酸活性的植物乳杆菌，其保藏编号为CGMCCNo.19241。
2.一种权利要求1所述的生物降酸用植物乳杆菌在果酒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，应用于果酒降酸。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，应用于果酒中生物胺的降解。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生物胺包括组胺、酪胺和尸胺中的一种或多种。
6.一种权利要求1所述的生物降酸用植物乳杆菌的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)乳酸菌株的筛选：利用生理盐水提取水果表皮的微生物，涂布于MRS分离培养基，静置培养，分离得乳酸菌；
(2)兼具生物胺降解活性和生物降酸活性乳酸菌株的筛选：
a.筛选具有生物胺降解活性的菌株：将步骤(1)分离得的乳酸菌接种于含生物胺的MRS培养基，通过生物胺含量检测筛选具有生物胺降解活性的菌株；
b.筛选不具备氨基酸脱羧酶活性的菌株：将步骤(2a)获得的菌株接种于含组氨酸、酪氨酸、赖氨酸的MRS培养基，通过生物胺含量检测筛选不具备氨基酸脱羧酶活性的菌株；
c.筛选具有生物降酸活性的菌株：将步骤(2b)分离得的乳酸菌接种于含苹果酸的MRS培养基，通过纸层析检测获得具备降酸能力的菌株；
d.筛查菌株的耐受性:将步骤(2c)获得的菌株接种于含有乙醇、SO2的酸性MRS培养基，获得高抗性菌株。
7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，MRS分离培养基均在其原基础成分上添加50mg/L万古霉素、50mg/L放线菌酮和5g/L碳酸钙。
8.一种果酒的制备方法，使用如权利要求1所述的生物降酸用植物乳杆菌，其特征在于，在酒精发酵结束后接种所述的生物降酸用植物乳杆菌进行苹果酸乳酸发酵。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的生物降酸用植物乳杆菌的接种量为以反应体系计106～108cfu/mL，20～25℃进行苹果酸乳酸发酵14～21天。
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Assignee: Yantai Tongxin Wine Co.,Ltd.

Assignor: LUDONG University

Contract record no.: X2022370000020

Denomination of invention: A Lactobacillus plantarum with both biogenic amine-degrading activity and bio-acid-reducing activity and its application in fruit wine

Granted publication date: 20220715

License type: Common License

Record date: 20220905