CN108676736B - 一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌及其应用 - Google Patents

一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108676736B
CN108676736B CN201810360764.XA CN201810360764A CN108676736B CN 108676736 B CN108676736 B CN 108676736B CN 201810360764 A CN201810360764 A CN 201810360764A CN 108676736 B CN108676736 B CN 108676736B
Authority
CN
China
Prior art keywords
citric acid
pichia pastoris
fruit wine
strain
degrading
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810360764.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108676736A (zh
Inventor
李二虎
钟武
潘思轶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN201810360764.XA priority Critical patent/CN108676736B/zh
Publication of CN108676736A publication Critical patent/CN108676736A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108676736B publication Critical patent/CN108676736B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/165—Yeast isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/84—Pichia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G3/00—Preparation of other alcoholic beverages
    • C12G3/02—Preparation of other alcoholic beverages by fermentation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌(Pichia fermentans strain)JT‑1‑3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2018146。本发明还公开了一种降解果酒柠檬酸的方法，它是向果汁中接种所述的毕赤酵母菌JT‑1‑3，然后进行发酵处理，制得低柠檬酸含量的果酒。本发明提供的菌株不仅具有更加优异的降酸能力，而且具有对多种物质的耐受能力，能更广泛地应用于果酒的发酵降酸。

Description

一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌及其应用
技术领域
本发明属于食品饮料和生物技术领域，涉及一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌(Pichia fermentans strain)，本发明还涉及该菌株在降解果酒柠檬酸中的应用。
背景技术
以柑橘、猕猴桃和蓝莓等鲜果汁经发酵酿成果酒，既在一定程度上保留了果实特有的芳香，并且较大程度地保留了果实中的有机酸、维生素、黄酮类物质和多酚等多种活性成分，具有增进食欲、促进消化、抗氧化和改善心脑血管功能等保健功能，并且可以避免因鲜果未及时消耗而造成的浪费。但由于其中较高的有机酸含量会使得果酒酸味过重、汁液失光浑浊，降低了消费者的购买欲。
猕猴桃属果酒中的有机酸组成以柠檬酸为主，目前生产上常用的降酸方法是化学方法，添加碳酸钙、碳酸氢钾等化学试剂虽降酸效果明显，但会引入大量金属离子，降低果酒风味和品质，也会影响到后期储藏的稳定性。张铎等于2017年5月报导了一种降解柠檬酸的菌株，为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，它是从柠檬酸厂废水废渣中经富集培养，分离纯化得到的的菌株，该菌株能降解柠檬酸培养基中约84％的柠檬酸，但是该菌株对高糖、高酸、高酒精度的果汁耐受能力很差，从而限制了它在果酒中的应用，而且该菌株的降酸能力仍有待于进一步提高。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的缺陷，提供一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌，该菌株不仅具有更加优异的降酸能力，而且具有对多种物质的耐受能力，能更广泛地应用于果酒的发酵降酸。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
申请人以新鲜的、未经防腐处理的柑橘、柠檬表皮和采自橘园的土壤为原料进行可降解柠檬酸酵母菌的分离和筛选，得到一株在以柠檬酸为唯一碳源的WL营养液体培养基中，降酸率＞80％的菌株，通过鉴定，确认该菌株为毕赤酵母菌(Pichia fermentansstrain)，将其分类命名为Pichia fermentans strain JT-1-3，并于2018年3月22日保藏于位于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M2018146。
毕赤酵母菌JT-1-3可耐受SO2含量280mg/L；酒精度(v/v)8％；pH2～4；葡萄糖浓度300g/L；柠檬酸浓度17.5g/L，在该SO2含量、pH、葡萄糖浓度和柠檬酸浓度条件下，毕赤酵母菌JT-1-3依然具有很好的生长情况，说明其耐性远大于实验设置条件，因此能更广泛地应用于果酒中。
一种降解果酒柠檬酸的方法，该方法是向果汁中接种以上所述的毕赤酵母菌JT-1-3，然后进行发酵处理，制得低柠檬酸含量的果酒。
优选地，所述毕赤酵母菌JT-1-3的接种量为果汁重量的2-5％，最佳接种量为3％。酵母接种量越大，降酸效果会相应增加，所需时间也会相应缩短，但是酵母的过度添加会导致果酒内营养物质的大量消耗，以及次级代谢产物的大量积累，从而导致负面影响。
优选地，所述发酵的条件是：温度为26～28℃，搅拌速度为60～80r/min。毕赤酵母降解柠檬酸时需要氧气的参与，氧气浓度较高虽然可以促进酵母的生长，但是对其酒精发酵会有一定的抑制作用，因此采用低转速进行搅拌，在进行酒精发酵的同时也能促进柠檬酸的降解，转速过高会对酒精发酵产生抑制作用，并且会加大果酒中酒精的挥发。
本发明的有益效果是：
(1)在柠檬酸含量较高的果汁中，可能会同时具有高糖、高酸和低pH的环境，因此发酵菌株需要对高糖、高酸和低pH具有较高的耐受性。同时，在发酵过程中，酵母菌自身会利用葡萄糖，转化成酒精，并且会人为添加SO2防止氧化和抑制杂菌，因此所选发酵菌株还需要对于酒精和SO2也应具有较高的耐受性。本发明提供的菌株具备以上条件，因此能更加广泛地应用于果酒发酵及降酸。
(2)本发明提供的毕赤酵母菌能在发酵第5d将柠檬酸浓度从10g/L降至1g/L以下，发酵第9d时可将柠檬酸的浓度降至0.63g/L，因此具有更加优异的降酸能力。
(3)由于果酒成分复杂，发酵环境也比人工发酵液更复杂，因此在发酵液中能成功降酸，并不代表在果酒中也能成功应用，本发明通过猕猴桃和蓝莓果酒的生物降酸实验，验证了该菌株在果酒中也具有很好的降酸效果。
(4)采用本发明提供的菌株对果汁进行发酵和降酸处理，得到的果酒能增进香气，改善风味和营养，提高储藏稳定性，同时还具有工艺简单，周期短，成本低等优点。
附图说明
图1为基于菌株JT-1-3的26S rDNA序列同源性构建的系统发育树。
图2为实施例2降酸前后的柠檬酸含量测定高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1菌株的筛选和鉴定
(1)菌株的分离
以新鲜的、未经防腐处理的柑橘、柠檬表皮和采自橘园的土壤为原料，于无菌条件下加入到一定体积的生理盐水中，于26℃，120r/min摇床中震荡20min，取5ml上清液，加入到含有1000mg/L链霉素的100ml YPD培养基中，于28℃，120r/min震荡培养24h进行富集培养，将得到的培养液进行梯度稀释，梯度分别为10-1～10-8，依次取1ml各个梯度的稀释菌液与尚未凝固的以柠檬酸为唯一碳源的WL营养固体培养基充分混匀，待其凝固后倒置于28℃恒温培养箱中静置培养3～4d，根据酵母菌的形态特征挑取疑似菌落镜检，通过在PDA平板上划线分离，得到纯化菌种，共获得纯菌种24株。
(2)菌株的筛选
将得到的纯化菌种无菌条件下接种到以柠檬酸为唯一碳源的WL营养液体培养基中，于28℃，120r/min摇床中震荡培养6d，测其OD600，并利用HPLC分析其残留柠檬酸浓度，分析降酸率，确定降酸率＞80％的菌株为待选菌株。降酸率的计算方法为(初始柠檬酸浓度-残留柠檬酸浓度)/初始柠檬酸浓度。
(3)菌株的初步鉴定
将降酸率可达到80％的菌株挑取少量在PDA固体平板上进行划线分离，培养2～3d，对其菌落形态和显微形态进行观察，与酵母菌图谱进行比对，初步确定为酵母菌。
(4)菌株的最终鉴定
为了进一步确认待选菌株的种属，将菌株接种到8ml含有氨苄的YPD培养基中，于28℃，120r/min震荡培养24h，4500r/min离心20min得到菌体沉淀，使用GBC酵母DNA提取试剂盒提取完整DNA，再用26S rDNA引物从基因组DNA中PCR扩增得到1条650bp左右的条带，对所得PCR扩增产物测序，将所获得的序列在NCBI上进行同源序列检索，结果显示该菌株与Pichia fermentans strain的26S rDNA序列同源性超过98％，因此，所得菌株在分子系统发育分类学上属于毕赤酵母菌(Pichia fermentans strain)。
(5)菌株的环境耐受试验
无菌条件下，将JT-1-3菌株分别等量接种到额外添加酒精、葡萄糖、柠檬酸、SO2以及pH2～10的WL营养液体培养基，培养温度设置为26℃，将所得数据进行统计分析，考察各菌株对酒精、葡萄糖、柠檬酸、pH和SO2的耐受性。结果显示，JT-1-3菌株可耐受SO2含量280mg/L；酒精度(v/v)8％；pH2～4；葡萄糖300g/L；柠檬酸17.5g/L。
实施例2菌株的生物降酸实验
发酵液的制备：
4g/L酵母浸粉、5g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖、10g/L柠檬酸，储液A40ml/L，储液B1ml/L。
储液A：磷酸二氢钾5.5g，氯化钾4.25g，氯化钙1.25g，硫酸镁1.25g，定容至400ml，
储液B：氯化铁0.25g，硫酸锰0.25g，定容至100ml。
将发酵液121℃15min灭菌之后备用；将于冰上解冻的JT-1-3菌株冻存液1ml置于100ml YPD培养基中，28℃，120r/min震荡培养24h，得到酵母活化液，将酵母活化液以4000r/min对活化液进行离心20min，使用无菌生理盐水冲洗得到的菌体沉淀，再对得到的菌悬液4000r/min离心20min，重复上述操作直至得到无异味的菌体沉淀，再将菌体沉淀全部洗进待发酵液中，接种量为3％(重量)，26～28℃下120r/min低速搅拌。发酵9d结束后经高效液相色谱测得柠檬酸含量为0.63g/L。
实施例3：猕猴桃果酒的生物降酸实验
将新鲜的猕猴桃经挑选之后，洗净去皮，榨汁后添加果胶酶进行酶解处理，然后过滤取其上清液，巴氏灭菌后待用。经高效液相色谱测的初始柠檬酸含量为12.85g/L。
将于冰上解冻的JT-1-3冻存液1ml置于100ml YPD培养基中，28℃，120r/min震荡培养24h，得到酵母活化液，将酵母活化液以4000r/min对活化液进行离心20min，使用无菌生理盐水冲洗得到的菌体沉淀，再对得到的菌悬液4000r/min离心20min，重复上述操作直至得到无异味的菌体沉淀，再将菌体沉淀全部洗进待猕猴桃果酒中，接种量为3％(重量)，26～28℃下60～80r/min低速搅拌。发酵结束后经高效液相色谱测得柠檬酸含量为10.89g/L。
实施例4：蓝莓果酒的生物降酸实验
将新鲜的蓝莓经挑选之后，洗净去皮，榨汁后添加果胶酶进行酶解处理，然后过滤取其上清液，巴氏灭菌后待用。经高效液相色谱测的初始柠檬酸含量为0.81g/L。
将于冰上解冻的JT-1-3冻存液1ml置于100ml YPD培养基中，28℃，120r/min震荡培养24h，得到酵母活化液，将酵母活化液以4000r/min对活化液进行离心20min，使用无菌生理盐水冲洗得到的菌体沉淀，再对得到的菌悬液4000r/min离心20min，重复上述操作直至得到无异味的菌体沉淀，再将菌体沉淀全部洗进蓝莓果酒中，接种量为3％(重量)，26～28℃下60～80r/min低速搅拌。发酵结束后经高效液相色谱测得柠檬酸含量为0.52g/L。

Claims (5)

1.一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌(Pichia fermentans)JT-1-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2018146。
2.权利要求1所述的毕赤酵母菌JT-1-3在降解果酒柠檬酸中的应用。
3.一种降解果酒柠檬酸的方法，其特征在于：向果汁中接种权利要求1所述的毕赤酵母菌JT-1-3，然后进行发酵处理。
4.如权利要求3所述降解果酒柠檬酸的方法，其特征在于：所述毕赤酵母菌JT-1-3的接种量为果汁重量的2-5％。
5.如权利要求3所述降解果酒柠檬酸的方法，其特征在于：所述发酵的条件是：温度为26～28℃，搅拌速度为60～120r/min。
CN201810360764.XA 2018-04-20 2018-04-20 一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌及其应用 Active CN108676736B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810360764.XA CN108676736B (zh) 2018-04-20 2018-04-20 一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810360764.XA CN108676736B (zh) 2018-04-20 2018-04-20 一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108676736A CN108676736A (zh) 2018-10-19
CN108676736B true CN108676736B (zh) 2020-05-19

Family

ID=63801535

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810360764.XA Active CN108676736B (zh) 2018-04-20 2018-04-20 一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108676736B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109852555B (zh) * 2019-02-21 2022-04-26 仲恺农业工程学院 一种耐酸酵母及其应用
CN110903932B (zh) * 2019-10-28 2023-01-17 山东农业大学 一种半干型树莓酒的生产方法
CN110885731A (zh) * 2019-11-15 2020-03-17 山东省林业科学研究院 一种树莓酒降酸的实现方法
CN111019847B (zh) * 2019-12-21 2021-11-05 黑龙江彤生食品科技有限公司 一株陆生伊萨酵母菌及其在柠檬酸降解中的应用
CN111334441B (zh) * 2020-02-24 2021-06-08 华中农业大学 一种降酸酵母菌株及其应用
CN112226374B (zh) * 2020-06-10 2022-11-04 山东凯普菲特生物科技有限公司 一株用于果酒全过程绿色生产的库德里阿兹威毕赤酵母及其应用
CN112143659B (zh) * 2020-06-10 2022-11-04 南京万拓生物科技有限公司 一株用于果酒全过程绿色生产的克鲁维毕赤酵母及其应用
CN114196557B (zh) * 2021-11-18 2024-03-22 常州大学 一种蓝莓天然酵母Bob1及其筛选方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015528312A (ja) * 2012-09-14 2015-09-28 ミリアント・コーポレイションＭｙｒｉａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 低ｐＨ条件下での発酵による有機酸の生産
KR101523203B1 (ko) * 2014-02-26 2015-05-28 한국식품연구원 미생물을 이용하여 파라돌 함량을 증가시키는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CN108676736A (zh) 2018-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108676736B (zh) 一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌及其应用
CN111378605B (zh) 一株高产挥发性酯类化合物的生物降酸用植物乳杆菌及其在果酒中的应用
CN106520451A (zh) 一种红曲果酒及其制备方法
CN113717867B (zh) 一种不产乙醇的产香库德里阿兹威毕赤酵母及其应用
CN109182156B (zh) 一株适于酿造红芯火龙果酒的酿酒酵母及其应用
CN111363699B (zh) 一株兼具生物胺降解活性和生物降酸活性的植物乳杆菌及其在果酒中的应用
CN112980646A (zh) 一种开菲尔源复合益生菌发酵梨汁燕麦活菌醋饮及其制备方法
CN114231381A (zh) 一种混菌复合发酵刺梨果醋的制备方法
CN113412893A (zh) 一种低糖高纤梨汁饮品的制备方法
CN109593627B (zh) 一种沙棘枸杞保健果酒的电场强化酿造工艺
CN113308419B (zh) 一株发酵用的谷糠乳杆菌及其应用
CN107057928B (zh) 一种猕猴桃果酒及其制备工艺
CN112553124B (zh) 一种植物乳杆菌菌株及其应用
CN111334441B (zh) 一种降酸酵母菌株及其应用
Nouska et al. Saccharomyces cerevisiae and Kefir Production using Waste Pomegranate Juice, Molasses, and Whey.
CN113773977A (zh) 一种低产乙醇高产香的酵母菌株及其应用
KR102088696B1 (ko) 베리류 와인 제조를 위한 바이오제닉 아민 비생성 사카로마이세스 세레비지애 ba34 균주 및 이의 용도
KR102088693B1 (ko) 베리류 와인 제조를 위한 바이오제닉 아민 비생성 사카로마이세스 세레비지애 ba31 균주 및 이의 용도
US9382507B2 (en) Malolactic fermentation of wine
Ngwang The usage of banana (Musa Acuminata) for Novel beverage production
CN111150057A (zh) 一种酒糟酵素及其制备方法
CN109536349B (zh) 一种功能草莓果酒的制备方法
CN115141774B (zh) 醋化醋杆菌及获取方法、复合冻干发酵剂的制备方法及其在制醋中的应用
CN112741242B (zh) 一种含高渗蓝莓脱水糖浆的益生菌饮料及其制备方法
CN110106029B (zh) 一种陈皮柑果肉洗涤剂及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant