CN111334441B - 一种降酸酵母菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降酸酵母(Meyerozyma caribbica)L‑3菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 20191069。通过检测果汁中酒石酸、草酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸的含量，发现L‑3菌株处理后的果汁中各有机酸的含量均显著降低，因此可应用于降低果汁酸度。本发明能够提供了一种有效的降酸菌株和果汁降酸方法，可用于改善果汁风味品质，增加产品的附加值，具有广阔的应用前景。

Description

一种降酸酵母菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种降酸酵母(Meyerozyma caribbica)菌株，本 发明还涉及该菌株在降低果汁酸度中的应用以及降低果汁酸度的方法。
背景技术
果汁营养价值高，具有抗氧化、降低胆固醇等多种保健功效，因此大受消费者的欢迎，如红树莓(red raspberry)含有原花青素、鞣花酸、酚酸类、黄酮类、苯乙烯、木脂 素、三萜和甾醇等多种活性成分，对人体健康众多方面都十分有益，并且含有丰富的矿 物质、维生素、抗氧化物质、膳食纤维等，被誉为“黄金水果”。但是树莓货架期较短， 鲜果不易保藏，不能够满足市场的全年供需需求，因此利用树莓鲜果开发加工制品显得 尤为重要。但树莓鲜果有机酸含量高，直接榨汁得到的树莓果汁也由于高酸度而难以被 消费者接受，因此很少有将其榨汁饮用。
目前已报导的果汁降酸方法有化学法、物理法和生物法，相比于物理化学方法，生物降酸能够避免对果汁口感、色泽等带来的不利影响，减少果汁营养价值的损失，能够 保持口感、色泽的稳定，改善风味品质等，是最有发展前景的一种处理方法。
申请人曾经以新鲜的、未经防腐处理的柑橘、柠檬表皮和采自橘园的土壤为原料，通过分离和筛选得到一株降酸菌株，分类命名为毕赤酵母Pichia fermentans strain JT-1-3， 该菌株已于2018年4月20日申请中国发明专利，公开号为CN 108676736 A。但是申 请人在对JT-1-3菌株进行后期应用研究中发现，该菌株仅对柠檬酸具有较好的降解作 用，而对果汁中的其它有机酸如酒石酸、苹果酸、草酸等降解能力很差，导致在应用中 受到很大局限，不能很好应用于树莓等果汁的降酸处理中。
发明内容
本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种新的降酸菌株，即降酸酵母(Meyerozymacaribbica)L-3菌株，该菌株与申请人前期提供的毕赤酵母JT-1-3相比，最大的区别在 于能降解柠檬酸、酒石酸、苹果酸、草酸等多种有机酸，因此能更广泛地应用于果汁的 降酸处理中，从而改善果汁的酸味口感。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
申请人首先从轻微腐烂的水果中分离纯化培养得到六种能够在含有柠檬酸的培养基 中生长且对树莓果汁没有不良感官影响的非酿酒酵母，经鉴定其中L-2、L-3、L-6、L-7为Meyerozyma caribbica，L-4和L-8为Kodamaea ohmeri，接着申请人将6种酵母加入 到树莓果汁中，经培养并测定pH，结果发现L-3菌株相比于其它菌株具有更为显著的 降酸效果。
最后，通过检测树莓果汁中酒石酸、草酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸的含量，发现L-3菌株处理后的树莓果汁中各有机酸的含量均显著降低，因此可应用于降低果汁酸度。
申请人将获得的L-3菌株进行鉴定，将其分类命名为Meyerozyma caribbica L-3，并 与2019年12月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO：M 20191069。
本发明进一步提供一种降低果汁酸度的方法，该方法包括在果汁中接种所述的降酸 酵母L-3菌并进行发酵的步骤。
优选地，所述降酸酵母L-3菌的活菌数为107-1011CFU/mL，所述接种量为果汁体积的1-10％。
进一步优选地，所述降酸酵母L-3菌的活菌数为1010CFU/mL，所述接种量为果汁体积的5％。
优选地，所述果汁为树莓果汁。
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种对酒石酸、草酸、苹果酸、柠檬酸等多种有机酸都具有很好降解能力的非酿酒酵母，能更广泛地应用于果汁的降酸处理中， 从而降低果汁的酸味口感使其更容易被消费者接受。本发明所提供的酵母应用于树莓果 汁的降酸处理中，还能显著改善树莓果汁的风味品质，增加产品的附加值，同时具有处 理方法简单，成本低等优点。
附图说明
图1不同非酿酒酵母菌株发酵树莓果汁的pH测定结果。
图2不同非酿酒酵母菌株模版DNA的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
图3树莓果汁在不同pH下的颜色。
图4树莓鲜果与水的榨汁比例对降酸处理后果汁pH的影响。
图5酵母菌株接种量对处理后果汁pH的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1菌株的筛选分离
以轻微腐烂的脐橙、木瓜为实验原料，带皮切碎加入9倍体积的无菌水后，于恒温摇床在转速150r/min、温度28℃条件下，培养50min。
在液体沙氏培养基接入10％(v:v)培养好的样液，于150r/min、温度28℃条件下，培养24-48h，观察直至发酵液浑浊。
利用20％柠檬酸原液将固体沙氏培养基pH调整至4，采用涂布法将10-4、10-5、10-6、10-7的稀释梯度的发酵液均匀涂布于平板上，28℃恒温培养48-96h，直至出现菌落。
将分离得到的菌落编号并进行扩大培养，挑取少量菌落接种于液体沙氏培养基，于 150r/min、温度28℃条件下在摇床活化培养12h，并在重复活化一次，按树莓汁(全果：水＝1:1)体积的5％接种菌悬液并混匀，150r/min、温度28℃条件下培养，筛选对果汁 感官品质没有不良影响的非酿酒酵母。
经筛选得到L-2、L-3、L-4、L-6、L-7、L-8这六种菌株对果汁的品质没有不良影响，其中L-2、L-3菌株从木瓜中筛选出来，菌落形态为圆形乳白色菌落，表面湿润光滑， 轻微隆起，为酵母菌菌株常见菌落形态。L-4菌株从脐橙中筛出，表面有轻微菌丝，偏 干燥，菌落颜色呈乳白色。L-6、L-7菌株从木瓜中筛出，L-8菌株从脐橙中筛出，菌落 形态相似，为黄色菌落，其中L-6菌株、L-8菌株菌落颜色偏浅黄色，L-7菌株菌落颜 色偏深黄色，形状为圆形，表面湿润光滑，轻微隆起。
实施例2菌种降酸效果试验
首先对获得的6种菌株整体降酸效果进行评价，具体方法如下：
树莓果汁的制备:将树莓鲜果与水按质量1:1配好，利用榨汁机(300W)匀速榨汁1min，再利用匀浆机(10000rpm)匀浆5min，得到均匀的树莓全果汁。然后密封进行 巴士灭菌，条件为80℃，15min。
将上述6种非酿酒酵母进行活化扩大培养，以5％体积分数加入到上述果汁中，在28℃恒温动态培养至72h，期间每12h测定一次pH，结果如图1所示。
从图1可知，在果汁中接种非酿酒酵母后36h开始，接种L-2和L-3菌株的果汁pH 开始上升，且L-3菌株相比于其他菌株具有更为显著的降酸效果。
接着对6种菌株处理后的树莓果汁有机酸的含量进行测定，具体方法如下：
样品处理：取200μL样品，12000r/min离心8min，取上清，过0.22μm水相微孔 滤膜至样品瓶中，待测。
高效液相色谱(HPLC)检测条件：色谱柱：Zorbax SB-Aq，4.6mmID×250mm(5μm)；流动相：1％乙腈/99％20mmol/L Na2HPO4，使用磷酸调pH至2.0；流速：0.5mL/min； 柱温35℃；紫外检测器波长：210nm；进样量10mL。
表1树莓果汁降酸前后有机酸的测定
Figure BDA0002390570880000041
Figure BDA0002390570880000051
注：对照处理指的是用申请人前期开发的毕赤酵母JT-1-3(CCTCC NO：M2018146)对树莓果汁进行处理。
由表1数据分析可知，树莓中含有酒石酸、草酸、苹果酸、柠檬酸等多种有机酸， 利用L-3菌株处理后，对以上各种有机酸均有很好的降解效果，而其它6种菌株同时降 解各种有机酸的能力较差。因此最终选择L-3菌株进行后续试验。
实施例3菌种的鉴定
1.DNA的提取
(1)取待测菌液1mL于10000r/min的转速下离心2min，取沉淀加入400μL DNA 提取缓冲液，然后置于沸水中煮沸10min，随即拿出冰浴10min，然后65℃水浴10min。
(2)向其中加入250μL 6mol/L的NaCl溶液和等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，混 匀10min，于离心机13000r/min离心5min。
(3)取离心后的上清液加入两倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，静置5min，于离心机13000r/min离心5min。
(4)弃上清液，沉淀用500μL 70％乙醇洗涤1次，于离心机13000r/min离心3min。
(5)小心吸弃上清液，室温干燥3min后，加入50μL无菌水溶解DNA沉淀得到菌 株的DNA。
2.降酸菌株ITS区的PCR扩增
以提取所得的菌株基因组DNA为模版，采用ITS区的通用引物进行扩增，扩增中 所用的2种引物为ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。
PCR反应条件为：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s，循环30 次，72℃延伸5min。
PCR反应体系为：10×Pfu buffer 10μL，dNTPs 5μL，ITS1 2μL，ITS4 2μL，模版DNA2μL，PfuDNA聚合酶2μL，ddH2O 28μL，共50μL。
3.菌株目的基因片段回收
(1)取得到的PCR产物，并加入三倍体积的Binding Buffer混匀，后转移至片段 回收专用柱中静置2min,然后10000r/min离心2min，弃去下清液。
(2)向柱中加入700μL SPW wash Buffer，10000r/min离心1min，弃去下清液， 重复1次。
(3)在10000r/min下离心2min，弃去收集管。
(4)在65℃恒温烘箱中，将吸附柱开口放置，烘5min。
(5)将收集管换成1.5mL离心管，并将烘干的吸附柱置于其上，在其膜的中心加 入50μL ddH2O，静置2min。
(6)在10000r/min下离心2min，弃去吸附柱，将收集管于低温保存，送至武汉 擎科创新生物科技有限公司进行测序。
电泳图如下，根据图2分析，菌株L-2、L-3、L-7、L-8的基因片段长度约为500-750bp， 菌株L-4、L-6的基因片段长度约为250-500bp。
将可疑片段送至武汉擎科创新生物科技有限公司进行测序后，片段碱基序列与将测 序结果所得的ITS区序列在NCBI上进行分析处理，结果显示该菌株与Meyerozymacaribbica的26S rDNA序列同源性超过98％，因此，所得菌株在分子系统发育分类学上 属于酵母菌(Meyerozyma caribbica)。
实施例4降酸条件的优化
如图3所示，由于树莓果汁pH高于5会使果汁的颜色产生不良的感官变化，若低 于3.5果汁过酸则导致口感不良。因此降酸果汁的pH应控制4左右。
1)鲜果与水的比例的优化方法如下：
榨汁时按全果与水的质量比为1:1、1:1.5、1:2、1：2.5制备果汁，接种果汁体积5％的活化好的L-3菌悬液(活菌数为1010CFU/mL)，接种后从24h开始每12h测一次pH， 结果如图4所示。
由图4分析可知，在比例为1:1时果汁在pH为4的时停留时间范围长，易于生产 控制，因此全果与水的质量为1:1是最佳榨汁比例。
2)菌液接种量的优化方法如下：
在巴氏灭菌后的果汁中接种L-3菌悬液(活菌数为1010CFU/mL)，接种量为果汁 体积的0％、1％、5％、10％，接种后从24h开始每12h测一次pH，结果如图5所示。
由图5可知，不同的接种浓度都能够起到降酸的效果，10％接种前期由于菌种数量多而增势较猛，但后期降酸效果不如1％和5％接种量的果汁。5％的降酸效果及降酸速 度优于1％的接种浓度，因此5％的接种浓度为最佳的接种浓度。
实施例5降酸处理前后树莓果汁的感官鉴评
将活化好的六种菌液接种于树莓果汁中得到6种不同菌株处理方式的树莓果汁，同 时用未经过降酸处理的果汁作为对照，随机挑选6位品评者对7个样品进行评分，打分规则具体参照表2。
表2树莓果汁的感官评价标准
Figure BDA0002390570880000071
根据以上感官鉴评标准得到的品评结果如表3所示，经过六种菌株的处理后果汁的 色泽、香气和滋味发生了不同程度的变化。经过处理后的果汁色泽虽不如处理前的果汁， 但L-3对果汁色泽影响较小，且L-3菌株处理的果汁其香气和滋味均得到提升。经过L-3菌株处理后的树莓果汁品评得分最佳，具有良好的提高树莓果汁感官品质的作用。
表3树莓饮品的品评结果
Figure BDA0002390570880000072
Figure BDA0002390570880000081
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种降酸酵母菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 627
<212> DNA
<213> Meyerozyma caribbica
<400> 1
tttttccttc cccgcttttg atatgcttaa gttcagcggg tattcctacc tgatttgagg 60
tcaaacttgt ttggttgttg taaggccggg ccaacaatac cagaaatatc ccgccacacc 120
attcaacgag ttggataaac ctaatacatt gagaggtcga cagcactatc cagtactacc 180
catgccaata cttttcaagc aaacgcctag ttcgactaag agtatcactc aataccaaac 240
ccgggggttt gagagagaaa tgacgctcaa acaggcatgc cctctggaat accagagggc 300
gcaatgtgcg ttcaaagatt cgatgattca cgaaaatctg caattcatat tacttatcgc 360
atttcgctgc gttcttcatc gatgcgagaa ccaagagatc cgttgttgaa agttttgaag 420
attaattcaa aatttgacta tcaataaaaa taattaaatt gtgttttgtt aaacctctgg 480
cccaacctat ctctaggcca aaccaaagca agagttctgt atcaaaaaga cactgtgtgt 540
aaggtttttc gccgcgcagt taagcgctgg caaaagaata ctgtaatgat ccttccgcag 600
tcccccctta acgaaaagaa ggatcaa 627

Claims (5)

1.一种降酸卡利比克迈耶氏酵母菌（Meyerozyma caribbica）L-3菌株，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20191069。
2.权利要求1所述的L-3菌株在降低树莓果汁酸度中的应用。
3.一种降低树莓果汁酸度的方法，其特征在于包括向树莓果汁中接种权利要求1所述的L-3菌株并进行发酵的步骤。
4.如权利要求3所述降低树莓果汁酸度的方法，其特征在于：所述L-3菌株的活菌数为107-1011 CFU/mL，接种量为树莓果汁体积的1%-10％。
5.如权利要求4所述降低树莓果汁酸度的方法，其特征在于：所述L-3菌株的活菌数为1010CFU/mL，接种量为树莓果汁体积的5％。
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