CN112391297B - 一种降解展青霉素的产朊假丝酵母、生物制剂及其应用 - Google Patents

一种降解展青霉素的产朊假丝酵母、生物制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)ANSY176(CGMCCNo.18279)及其所制备的生物制剂，同时提供该产朊假丝酵母及生物制剂在展青霉素生物降解方面的应用。为食品和饲料中展青霉素的生物脱毒提供菌种资源，该菌株的应用可降低展青霉素对人和动物的危害，提高食品安全。

Description

一种降解展青霉素的产朊假丝酵母、生物制剂及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，主要涉及一种降解展青霉素的产朊假丝酵母、生物制剂及其应用。
背景技术
展青霉素又称棒曲霉素，化学名称为4-羟基-4-氢-呋喃(3,2-C)骈吡喃-2(6-氢)酮，是由曲霉属、青霉属和丝衣霉属真菌产生的有毒次级代谢产物。食品和饲料生产中展青霉素的污染相当普遍，展青霉素广泛存在于苹果、葡萄、橘子、菠萝等水果及其制品中，以及常用的谷物、玉米、奶酪和动物饲料等产品中展青霉素的污染也非常高。中国预防医学科学院等单位对我国水果及水果制品中展青霉素污染调查报告指出：我国原汁、原酱等水果制品半成品中展青霉素检出率高达76.9％，含量为18～953μg/kg，水果制品成品中展青霉素检出率达19.6％，含量为4～262μg/kg。水果制品中展青霉素污染不仅降低产品品质，还会严重威胁消费者健康。欧盟对食品中展青霉素含量做出了严格规定，其中果汁及水果原汁中展青霉素含量不得超过50μg/L，苹果肉产品、苹果蜜饯及苹果泥等固态苹果制品中展青霉素含量不得超过25μg/kg。
展青霉素能够导致人和动物急性和慢性中毒，展青霉素进入细胞后能够和谷胱甘肽等含有巯基的蛋白质和酶结合，干扰正常生物学功能。此外，展青霉素能够诱导p53蛋白入核，同时造成DNA分子交联形成核质桥，形成微核，造成细胞复制延迟，激活有丝分裂蛋白酶原,导致纺锤体加倍。基于展青霉素对人和动物的潜在危害，世界上很多国家都对果汁产品中展青霉素的最大限量做了规定，EU、USFDA规定果汁产品中的展青霉素的最大限量为50μg/kg，婴幼儿产品中最大限量为10μg/kg。
传统化学脱毒方法是利用重亚硫酸钠、次氯酸钠、臭氧等处理受霉菌毒素污染的果汁和饲料，虽然能起到较好的脱毒效果，但是该方法破坏饲料营养成分，对食品和饲料的感官品质和风味造成不良影响，同时还伴随着化学药品的残留，产生食品安全等问题，因此很难实际推广。物理脱毒方法主要是利用一些高比表面的多孔固体对霉菌毒素进行吸附，常用的霉菌毒素吸附剂包括酵母细胞壁、水合硅铝酸盐、活性炭等。吸附剂在饲料和果汁中霉菌毒素脱毒应用较为广泛，但是存在脱毒不彻底，在吸附毒素的同时还吸附饲料和果汁中的维生素和微量元素，与吸附剂结合的霉菌毒素随粪便排出可能造成二次污染。生物脱毒方法包括微生物通过酶促反应将毒素转化成无毒或低毒降解产物，生物降解可以在温和条件下进行，对饲料和果汁的营养价值和适口性影响小，同时还具有安全、高效和环保等优点，成为国内外霉菌毒素脱毒的研究热点。
目前科研人员已经从自然界中筛选到一些能够降解展青霉素的细菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和乳酸菌(Lactobacillus)等，也筛选到了一些能够在体外降解展青霉素的酵母菌，包括卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)、奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri)、海洋红酵母(Rhodosporidium paludigenum)等。但是大部分微生物清除展青霉素的效率不高，且局限于清除水溶液或培养液中的展青霉素，很少应用到食品和饲料中展青霉素的脱毒实践中。本发明旨在筛选能高效降解展青霉素的有益微生物，并将其用于食品和饲料中的展青霉素的生物脱毒。最终，本发明克服上述缺点，筛选到一株对展青霉素降解效果高，适合于果蔬及饲料中展青霉素降解的产朊假丝酵母ANSY176，该菌有望作为新的菌种资源用于食品和饲料工业中展青霉素的生物脱毒。
发明内容
本发明的目的是提供一株产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)ANSY176，该菌株已于2019年07月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.18279。
所述产朊假丝酵母具有以下特性：
(1)菌落特征：在YPD平板培养基上，30℃，培养24h，菌落乳白色，平滑，有或无光泽，边缘整齐或菌丝状。在显微镜下，细胞呈圆形、椭圆形或腊肠形，大小为(3.5-4.5)μm×(7-13)μm。
(2)分子特性：该菌株26S rDNA D1/D2基因序列与Cyberlindnera jadinii CBS839和Cyberlindnera jadinii JM-1的26S rDNA D1/D2基因序列同源性为100％，被鉴定为产朊假丝酵母菌(Cyberlindnera jadinii)。
(3)展青霉素胁迫下的生长特性：在0～9h之间展青霉素对产朊假丝酵母ANSY176生长具有明显抑制作用；随着培养时间延长，该抑制作用减弱；在6～22h之间，毒素胁迫组产朊假丝酵母ANSY176补偿生长，生长速度大于正常对照组；22h时两个处理酵母生物量一致；30h之后，毒素胁迫组和正常组酵母生物量趋于稳定。
(4)在含25μg/mL展青霉素的水溶液中，产朊假丝酵母ANSY176降解展青霉素最适反应温度为28℃，反应24h后对展青霉素的降解率为95％。
(5)最适pH值偏酸性：产朊假丝酵母ANSY176降解展青霉素最适pH值为5，反应24h其对展青霉素的降解率为91％。
(6)毒素耐受性：当体系中展青霉素浓度不超过25μg/mL时，反应24h后，产朊假丝酵母ANSY176对体系中展青霉素的降解率大于90％。
本发明还提供一种制备用于清除展青霉素的产朊假丝酵母CGMCC No.18279的生物制剂，是将产朊假丝酵母CGMCC No.18279活化培养后离心获得产朊假丝酵母菌体，洗涤后收集菌体得到产朊假丝酵母菌生物制剂。或者，将收集得到的菌体再用保护剂重悬达到浓度108CFU/mL，将悬浮液培养一段时间后进行冷冻干燥得到产朊假丝酵母菌粉生物制剂。
所述的保护剂可以为脱脂奶粉、蔗糖、玉米蛋白粉、大豆浓缩蛋白粉、麸皮、淀粉中的一种或几种。
所述产朊假丝酵母CGMCC No.18279具有以下用途：
(1)制成清除展青霉素的生物制剂；
(2)用来清除水果、蔬菜、果汁及其加工副产品、食品、饲料和饲料原料中的展青霉素。
本发明的产朊假丝酵母CGMCC No.18279具有耐酸性，对展青霉素有良好的耐受能力，能够耐受起始浓度为25μg/mL的展青霉素溶液。并且对展青霉素有较强的清除作用，能够显著降低苹果汁、发霉苹果渣、各种水果汁及食品和饲料中展青霉素的含量。所述的产朊假丝酵母CGMCC No.18279用于去除食品或饲料中的展青霉素，具有非常广泛的应用前景。
本发明进一步提供了一种产朊假丝酵母Cyberlindnera jadinii CGMCCNo.18279生物制剂在降解果汁中展青霉素中的应用，具体为利用产朊假丝酵母生物制剂与苹果汁混合，孵育24h后测定苹果汁中的展青霉素含量，试验结果表明产朊假丝酵母生物制剂可降解苹果汁中90％以上的展青霉素。
本发明还提供一种产朊假丝酵母Cyberlindnera jadinii CGMCC No.18279在降解青贮饲料中展青霉素中的应用，具体为在苜蓿草粉中接种产展青霉素的扩展青霉素孢子，然后再接种1％产朊假丝酵母CGMCC No.18279，在28℃下保温发酵4天，从而使产朊假丝酵母降解苜蓿草粉中的展青霉素，其降解效率大于87％。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果:
本发明提供的分离得到的产朊假丝酵母Cyberlindnera jadinii CGMCCNo.18279，是一种酵母菌，具有降解食品和饲料中展青霉素的良好技术效果，通过将该菌种制成的生物制剂与苹果汁发酵反应，并通过将菌种与霉变青贮饲料进行固体发酵反应，验证其在实际应用中具有良好的降解展青霉素的效果，获得降解食品和饲料中展青霉素显著的技术效果。
生物保藏说明
ANSY176，分类命名：产朊假丝酵母，Cyberlindnera jadinii，于2019年07月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18279。
附图说明
图1为产朊假丝酵母ANSY176 26SrDNA D1/D2区PCR扩增电泳图；
图2为产朊假丝酵母ANSY176在正常(实线)和展青霉素胁迫下(虚线)的生长曲线；
图3为温度对产朊假丝酵母ANSY176降解展青霉素的影响；
图4为pH值对产朊假丝酵母ANSY176降解展青霉素的影响；
图5为毒素浓度对产朊假丝酵母ANSY176降解展青霉素的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1降解展青霉素酵母菌分离与筛选
将5g肉鸡盲肠内容物溶解在50mL蛋白胨水(0.1％w/v)中，通过涡旋充分混合并搅拌30min。用无菌蒸馏水将样品从10-1稀释至10-7，并将每个梯度稀释液(100μL)涂布在含有5μg/mL展青霉素(PAT)的YPD固体培养基上，28℃培养48h。将长出的单菌落在YPD平板上划线获取纯化的菌株。
将上一步纯化的酵母菌株接种到50mL YPD液体培养基中，28℃180rpm培养24h，离心收集菌体，调整菌悬液细胞浓度为1×108/mL。在20mL含有10μg/mL PAT的YPD液体培养基中加入400μL菌悬液，28℃180rpm培养36h。用无菌蒸馏水替代菌悬液作为对照组。通过测定培养基中PAT残留量来计算降解率，从而筛选出能够降解展青霉素的酵母菌株。
最终从肉鸡盲肠食糜中分离纯化出一株对PAT的降解效率较高的酵母菌，命名为ANSY176，菌株ANSY176与PAT反应36h对其降解率达到98％。
实施例2降解展青霉素酵母菌ANSY176的26S分子鉴定
根据酵母基因组DNA提取试剂盒说明书提取酵母基因组DNA，采用通用引物NL-1(50-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-30)和NL-4(50-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-30)扩增26SrDNA的D1/D2区域，扩增序列经过琼脂糖凝胶电泳纯化回收和测序，通过NCBI数据库进行BLAST比对。
结果表明，采用通用引物NL-1/NL-4PCR扩增酵母ANSY176 26S rDNA D1/D2区部分序列，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。切胶回收目的片段进行测序，将序列在NCBI上进行BLAST比对分析，结果如表1所示，ANSY176 26S rDNA D1/D2基因序列与Cyberlindnerajadinii CBS 839和Cyberlindnera jadinii JM-1的26S rDNA D1/D2基因序列同源性为100％，因此鉴定菌株ANSY176为产朊假丝酵母菌(Cyberlindnera jadinii)。
表1 ANSY176 26S rDNA D1/D2区序列BLAST比对分析
Figure BDA0002165160420000061
实施例3展青霉素对产朊假丝酵母ANSY176生长的影响
将活化好的100μL产朊假丝酵母ANSY176种子液接种到20mL含有25μg/mL PAT的YPD液体培养基中，28℃180rpm培养，同时以不添加毒素的培养基作为对照，每隔3h取样，采用分光光度计测定不同时间点发酵液酵母生物量，绘制酵母生长曲线。
结果表明，在0～9h之间展青霉素对产朊假丝酵母ANSY176生长具有明显抑制作用；随着培养时间延长，该抑制作用减弱；在6～22h之间，毒素胁迫组产朊假丝酵母ANSY176补偿生长，生长速度大于正常对照组；22h时两个处理酵母生物量一致；30h之后，毒素胁迫组和正常组酵母生物量趋于稳定(图2)。
实施例4温度对产朊假丝酵母ANSY176降解展青霉素的影响
将培养好的产朊假丝酵母ANSY176种子液4℃、4000rpm离心10min，菌体沉淀用PBS洗涤3次，最后重溶于含有25μg/mL PAT的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(100mM，pH＝5)中，并调整菌悬液菌体浓度为1×108/mL,在细菌瓶中加入2mL菌悬液，180rpm摇床培养，反应温度分别为18、23、28、33和38℃。在细菌瓶中加入含有毒素的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为对照，培养24h后测定降解率。
结果表明，在含25μg/mL展青霉素的水溶液中，产朊假丝酵母ANSY176降解展青霉素最适反应温度为28℃，反应24h对毒素的降解率为95％；在23到33℃范围内，对展青霉素降解率大于73％(图3)。
实施例5 pH值对产朊假丝酵母ANSY176降解展青霉素的影响
将培养好的产朊假丝酵母ANSY176种子液4℃、4000rpm离心10min，菌体沉淀用PBS洗涤3次，最后重溶于含有25μg/mL PAT的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(100mM，pH 2、3、4、5、6)中，并调整菌悬液菌体浓度为1×108/mL,在细菌瓶中加入2mL菌悬液，28℃、180rpm孵育24小时后测定降解率。其中对照组为含有展青霉素的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
结果表明，产朊假丝酵母ANSY176降解展青霉素最适pH值为5，反应24h后，菌株对PAT的降解率为91％(图4)。
实施例6毒素浓度对产朊假丝酵母ANSY176降解展青霉素的影响
将培养好的产朊假丝酵母ANSY176种子液4℃、4000rpm离心10min，菌体沉淀用PBS洗涤3次，最后重溶于含有不同浓度PAT(10、25、50、100和200μg/mL)的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(100mM，pH＝5)中，并调整菌悬液菌体浓度为1×108/mL,在细菌瓶中加入2mL的菌悬液，28℃、180rpm孵育24小时后测定降解率。其中对照组为含有展青霉素的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
结果表明，当体系中展青霉素浓度不超过25μg/mL时，反应24h，产朊假丝酵母ANSY176对体系中展青霉素降解率大于90％；随着毒素浓度进一步增加，降解率下降，当体系中展青霉素浓度为200μg/mL时，24h后展青霉素降解率仅为14％(图5)。
实施例7制备用于清除展青霉素的产朊假丝酵母CGMCC No.18279生物制剂
将产朊假丝酵母CGMCC No.18279以2％接种量接种于YPD培养基，在温度为28-30℃，摇床转速为180-200r/min的摇床中培养18-24h后，经5000r/min，10min离心获得产朊假丝酵母菌体，将离心后的菌体用0.85％生理盐水清洗3次后离心，得到产朊假丝酵母CGMCCNo.18279生物制剂。
或者，将菌体再用保护剂重悬达到浓度1×108CFU/mL。所述的保护剂为150g/L脱脂奶粉和100g/L蔗糖。将该悬浮液在温度30℃的条件下预培养60min，再在-20℃预冻2-5h，最后进行冷冻干燥得到产朊假丝酵母CGMCC No.18279菌粉生物制剂。
实施例8制备用于清除展青霉素的产朊假丝酵母CGMCC No.18279生物制剂
将产朊假丝酵母CGMCC No.18279以2％接种量接种于YPD培养基，在温度为25-30℃，摇床转速为150-200r/min的摇床中培养20-24h后，经5000r/min，10min离心获得产朊假丝酵母菌体，将离心后的菌体用0.85％生理盐水清洗3次后离心，得到产朊假丝酵母CGMCCNo.18279生物制剂。
或者，将菌体再用保护剂重悬达到浓度1×108CFU/mL。所述的保护剂为120g/L玉米蛋白粉和100g/L大豆浓缩蛋白粉。将该悬浮液在温度35℃的条件下预培养60min，再在-20℃预冻2-5h，最后进行冷冻干燥得到产朊假丝酵母CGMCC No.18279菌粉生物制剂。
实施例9产朊假丝酵母CGMCC No.18279生物制剂降低苹果汁中展青霉素的含量
以超市售苹果汁为溶剂，加入展青霉素(PAT)，调整PAT浓度为20μg/mL，加入1×108CFU/mL产朊假丝酵母CGMCC No.18279生物制剂，混匀后于25℃，转速为150r/min的摇床中孵育24h。然后提取苹果汁中的PAT，用高效液相色谱测定其含量。同时设没加入产朊假丝酵母CGMCC No.18279生物制剂的空白组。具体提取方法如下：
取5-10mL含PAT的苹果汁，加入20mL的乙酸乙酯，振摇2min，静止分层后收集上层有机相，重复以上步骤2次，合并3次有机相，将提取后的净化液倒入100mL的梨形瓶中，于40℃水浴上旋转蒸发至1～2mL，将浓缩液移至离心管中，40℃氮气吹干，以1.0mL pH 4.0的乙酸水溶液溶解残留物，经0.22μm的滤膜过滤后，供液相色谱测定。
试验结果表明，产朊假丝酵母CGMCC No.18279能显著降低苹果汁中展青霉素的含量，可将苹果中展青霉素的含量从20μg/mL降到2μg/mL，清除率达94.37％。
实施例10产朊假丝酵母CGMCC No.18279降低发霉青贮饲料中展青霉素的含量
称取一定量的苜蓿草粉，放入平皿中，用牛皮纸包好，高压蒸汽灭菌；苜蓿草粉灭菌冷却后，按接种量2-5％接入能够产展青霉素的扩展青霉素孢子悬浮液，搅拌混合均匀；将无菌水按料水比1:0.5～1加入苜蓿草粉中，搅拌均匀混合后平均分装到已灭菌平皿中，其中三个平皿中分别接种1-2％产朊假丝酵母CGMCC No.18279，空白平皿中不加入产朊假丝酵母，将接种产朊假丝酵母的平皿与未接入产朊假丝酵母的空白平皿在25-35℃的温度下保温发酵3-6天，发酵完后，提取苜蓿草粉中的展青霉素，提取方法如实施例9。提取后用高效液相色谱检测展青霉素的含量。
试验结果表明，在发霉的苜蓿草粉中加入产朊假丝酵母CGMCC No.18279可以有效降低展青霉素的含量，将苜蓿草粉中展青霉素的量从332.65μg/kg降到42.34μg/kg，降解率达87％。
上述讨论和实施案例仅供说明本发明具体实施方案，绝非限制其实际范围，本发明的保护范围以权利要求保护范围为准。

Claims (10)

1.一种产朊假丝酵母（Cyberlindnera jadinii）ANSY176，该菌株已于2019年07月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18279。
2.一种应用权利要求1所述产朊假丝酵母ANSY176制备展青霉素生物降解剂的方法，其特征在于，将所述产朊假丝酵母ANSY176菌活化培养后离心获得产朊假丝酵母菌体，洗涤后收集菌体得到产朊假丝酵母活菌制剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步将收集得到的菌体用保护剂重悬达到细胞浓度108CFU/mL，将悬浮液培养一段时间后进行冷冻干燥得到产朊假丝酵母菌粉生物制剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的保护剂为脱脂奶粉、蔗糖、玉米蛋白粉、大豆浓缩蛋白粉、麸皮、淀粉中的一种或几种。
5.一种含有权利要求1所述的产朊假丝酵母ANSY176的生物制剂。
6.权利要求1所述的产朊假丝酵母ANSY176菌株或权利要求5所述的产朊假丝酵母ANSY176的生物制剂在展青霉素生物降解方面的应用。
7.权利要求1所述的产朊假丝酵母ANSY176菌株或权利要求5所述的产朊假丝酵母ANSY176的生物制剂在去除食品和饲料中展青霉素的应用方法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述食品包括但不限于苹果、山楂、西红柿、葡萄、桃子、橙子的各种水果及其加工产品和坚果及其加工产品。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述饲料包括但不限于苹果渣发酵饲料、青贮饲料、玉米及其加工副产物的各种动物用饲料原料及配合饲料。
10.权利要求1所述的产朊假丝酵母ANSY176菌株或权利要求5所述的产朊假丝酵母ANSY176的生物制剂在制备食品和饲料添加剂中的应用。
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