CN111979146B - 糖多孢菌及其在食品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了糖多孢菌及其在食品中的应用，属于食品发酵技术领域。本发明从麦曲中筛选到了江西糖多孢菌J3，该菌株已于2020年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020104。本发明将该菌株应用于食品发酵体系，结果显示，菌株不会影响到食品的正常发酵，并具有在发酵酒精饮品、发酵食品和发酵调味品中降低生物胺含量的作用，在酿造食品领域具有广阔的应用前景。

Description

糖多孢菌及其在食品中的应用
技术领域
本发明涉及糖多孢菌及其在食品中的应用，属于食品发酵技术领域。
背景技术
黄酒是一种酿造酒，一般以糯米、玉米和黍米为原料，添加麦曲、酵母作为糖化剂、发酵剂，经蒸煮、加曲、糖化发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、勾兑而成。黄酒中除含有水、乙醇主要成分外，还含有18种氨基酸，其中包括8种必需氨基酸，这8种氨基酸比同量葡萄酒、啤酒中多数倍，经常饮用黄酒有益于身体健康；黄酒中含有丰富的抗氧化物质，如多酚、多糖、多肽等，具有抗氧化活性。黄酒酿造不同于啤酒和葡萄酒，采用开放型发酵工艺，发酵体系中氨基酸含量丰富，微生物种类复杂数量繁多，细菌群落结构复杂，参与发酵的细菌主要有醋酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌、糖多孢菌等。但是微生物的代谢产物在给黄酒带来独特风味的同时也会使黄酒中含有一些有害物质，如生物胺等。
生物胺是一种含氮有机碱性小分子化合物，由氨基酸脱羧形成，普遍存在于动植物和微生物体内，适量生物胺能够促进生长、清除自由基、增强代谢活性、增强免疫力，在人体内具有重要的生理功能，但过量生物胺的摄入则会引起动脉、血管和微血管的扩大，导致腹泻、头痛、腹部痉挛、呕吐等不良生理反应，甚至会导致死亡。生物胺广泛存在于多种食品中，在酸奶、黄酒、白酒、料酒、酱油、食醋和葡萄酒等发酵食品中含量尤为丰富。
发酵食品中的生物胺主要是由微生物代谢产生的氨基酸脱羧酶作用于游离氨基酸形成的。发酵过程中微生物代谢产生蛋白酶和羧肽酶作用于谷物中的蛋白质，分解产生低分子肽和氨基酸，为生物胺的生成提供了丰富的前体物质，在氨基酸脱羧酶，将会造成生物胺的大量生成。
目前，国内外研究中尚未有关于将糖多孢菌应用于食品发酵及降生物胺方面的报道。因此，利用现代生物技术，筛选优良性能的微生物对于生产高质量、高产量、风味独特优质发酵食品，以及提高发酵食品的安全性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于解决现有传统酿造食品中生物胺含量较高的问题，提供性能优良的菌株江西糖多孢菌J3应用于酒类(黄酒和料酒)、鱼、食醋的发酵过程进行生物强化，以降低发酵食品中的生物胺含量，提高食品的口感和风味，更好的发挥放线菌在传统发酵食品中的应用。
本发明的第一个目的是提供一株江西糖多孢菌S.jiangxiensis J3，所述糖多孢菌已于2020年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2020104。
本发明的糖多孢菌，具有如下优良的性能：
(1)应用于食品发酵体系，不会影响到食品的正常发酵；
(2)该菌株制作的纯种麦曲适用于黄酒的发酵，不仅可以促进酒精产生速率而且可以提高黄酒中氨基酸含量；
(3)生物胺产生量均小于2.5mg/L，生物胺检出量极少；
(4)对酪胺、组胺、腐胺、尸胺均有降解作用；
(5)可以适用于臭鳜鱼发酵、料酒发酵和食醋发酵，并且具有降生物胺的能力。
本发明的第二个目的是提供含有江西糖多孢菌J3的微生物菌剂。
在一种实施方式中，所述每克或每毫升发酵剂中的S.jiangxiensis J3的数量≥1×106CFU。
本发明的第三个目的是提供含有S.jiangxiensis J3的微生物复合菌剂。
在一种实施方式中，所述每克或每毫升发酵剂中的S.jiangxiensis J3的总数量≥1×106CFU。
本发明的第四个目的是提供应用所述菌株S.jiangxiensis J3制备的纯种麦曲。
在一种实施方式中，所述麦曲的制备方法为：向破碎后的小麦中加入清水进行润麦，再将润麦后的物料蒸煮灭菌，接种所述糖多孢菌J3发酵制备麦曲。
在一种实施方式中，所述麦曲的制备方法包括如下步骤：
(1)碾麦：小麦破碎程度为每粒3-5片，带少量粉末，使麦粒组织破碎，淀粉外露；
(2)润麦：向步骤(1)处理后的物料中加入物料质量30-45％的清水，搅拌15-25min，使其充分均匀的吸收水分；
(3)蒸煮灭菌：将步骤(2)处理后的物料蒸煮灭菌；
(4)接种：待步骤(3)的物料降温至低于40℃后，接种活化菌种，接种量为105-107CFU/mL。
(5)发酵。
在一种实施方式中，所述步骤(5)的发酵包括如下步骤：
a)孢子发芽期：曲料进盘6小时后，品温缓慢上升至34-35℃左右，自控模式启动小风量间接通风，每次5-10分钟，间隔2小时，使品温降到32℃，要求均匀吹透；
b)菌丝生长期：间歇通风3-5次后，菌丝开始生长，品温升至35℃以上，曲料开始结块，此时应连续通风，维持品温35±2℃；
c)菌丝繁殖期：接种后12小时，品温上升较快，此时应视第一次结块情况进行翻曲，翻曲前，先升起测温探头，开启翻曲机，后摊平，放下测温头，开启通风及喷雾系统；
d)第一次翻曲后，品温保持在36-37℃之间，保持通风喷雾顺畅，约20小时后，曲料再次结块，眼观曲料发白，温度控制在37℃以下，进行第二次翻曲，二次翻曲过后，品温应控制在35±2℃。
本发明的第五个目的是提供所述菌株S.jiangxiensis J3的纯种麦曲制备方法及其在食品发酵中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是指用于发酵食品领域。
在一种实施方式中，所述应用是用于制备发酵食品、饮品或调味品。
在一种实施方式中，所述食品包括但不限于鱼类的发酵或半发酵食品。
在一种实施方式中，所述饮品包括但不限于黄酒或料酒。
在一种实施方式中，所述调味品包括但不限于食醋。
在一种实施方式中，所述应用是采用菌株制作成纯种麦曲与酿酒原料混合后进行发酵。所述发酵食品包括但不限于黄酒、料酒、食醋、鱼类等。
在一种实施方式中，所述方法是将纯种麦曲按照10～16％的接种量在发酵罐中与米饭、酒母等原料混匀后进行发酵，发酵采用传统发酵工艺。
在一种实施方式中，所述黄酒的发酵包括如下过程：
a)酵母活化培养：将酵母菌接种于YPD培养基中，于30℃，150r/min条件下活化培养24h；
b)酒母的制作：取600g蒸熟的米饭，加入1600mL清水，60g生麦曲，800U/g米饭的糖化酶进行糖化，糖化的温度控制在55-65℃，时间3-4小时，糖化结束后外观糖度不低于12°Bx后，115℃灭菌15min，灭菌后冷却至24～31℃，将步骤a)中培养成熟的酵母培养液按照5％的接种量接入，培养温度不超过30℃，在150r/min条件下培养时间18～24h，培养成熟后即得酒母。
c)按照传统黄酒发酵的原料配比进行落料和发酵，麦曲添加量为40～50g/L；前四天为前酵阶段，温度控制在28～30℃，发酵4d，前4d每天开耙不少于1次，头耙时间8-10h；后酵阶段，温度为13～15℃，每天搅拌开耙一次，持续发酵10～15d。
在一种实施方式中，所述料酒的制备方法为：将江西糖多孢菌用于黄酒的发酵，向发酵获得的黄酒中加入按质量计5～15％的食盐，于85～100℃灭菌、热灌装。
在一种实施方式中，所述食醋的制备方法为：将大糠、麸皮、黄酒按照1:4:10的质量比拌匀，接入5％的醋醅，接种后前2天内每天从物料表面翻醅，保持温度为35-42℃。到6-8天时翻到物料底部。第8-12天，每天从底部翻醅，温度自然下降。从醋醅中分离后得生醋，在经过85℃灭菌30min后陈酿12个月。
在一种实施方式中，发酵臭鳜鱼的制备方法包括如下步骤：
(1)样品预处理：鳜鱼去内脏，称重3kg；
(2)发酵液制备：取鳜鱼等质量饮用水，以此为100％计，加入6％盐、1％大葱、0.6％姜、0.1％八角、0.05％茴香、0.05％孜然、0.01％辣椒、0.01％花椒、300000U中性蛋白酶，混匀，得发酵液；
(3)接种：以10％接种量向步骤(2)的发酵液中接种活化的江西糖多孢菌J3菌种，菌液浓度为107cfu/mL；
(4)发酵：将鳜鱼浸于步骤(3)的发酵液中，最上层用石头压实，20℃下发酵6天，得臭鳜鱼。
本发明的第六个目的是提供所述江西糖多孢菌J3在鱼类发酵、黄酒、料酒、食醋中降生物胺的应用。
在一种实施方式中，所述生物胺包括但不限于酪胺、组胺、腐胺、尸胺。
在一种实施方式中，所述酿造黄酒、料酒和食醋是先利用所述糖多孢菌制成纯种曲，添加到酒类和食醋的发酵中。
本发明的有益效果：
(1)本发明的菌株应用于食品发酵体系，不会影响到食品的正常发酵；
(2)用本发明的菌株制作的纯种麦曲可用于黄酒发酵，不仅可以促进酒精产率而且可以提高黄酒中氨基酸含量；S.jiangxiensis J3纯种发酵黄酒中氨基酸含量与对照组相比无显著差，添加复合菌剂发酵黄酒中氨基酸的含量最高；菌株的添加对传统黄酒风味影响均不明显；添加S.jiangxiensis J3的样品组相比较对照组生物胺含量降低了35.09％，提高了黄酒中氨基酸态含量和营养价值，达到了提高黄酒中氨基酸和挥发性物质含量和提升黄酒品质目的。
(3)S.jiangxiensis J3的生物胺产生量小于2.5mg/L，生物胺检出量极少，基本不产生生物胺。S.jiangxiensis J3对酪胺的降解率分别达到81.55％，对组胺的降解率均达到100％，对腐胺的降解率分别达到51.8％，对尸胺的降解率分别达到40.01％，对总生物胺的降解率分别达到69.09％，说明菌株均有良好的降生物胺的能力。
(4)糖多孢菌S.jiangxiensis J3具有降生物胺效果，将其应用于黄酒发酵中，添加S.jiangxiensis J3发酵后黄酒中的生物胺含量为16.88±1.41mg/L，比对照组降低了36.90％；添加S.jiangxiensis J3的臭鳜鱼生物胺含量比对照组下降了23.24％；添加S.jiangxiensis J3的料酒中相比较对照组生物胺含量降低了18.91％；添加S.jiangxiensis J3的食醋相比较对照组生物胺含量降低了27.61％。
(5)糖多孢菌复合菌剂具有降生物胺效果，将其应用于黄酒发酵中，添加复合菌剂Mix发酵后黄酒中的生物胺含量为15.57±0.44mg/L，比对照组降低了41.79％。
生物材料保藏
江西糖多孢菌(Saccharopolyspora jiangxiensis)J3，分类命名为江西糖多孢菌(Saccharopolyspora jiangxiensis)J3，已于2020年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2020104。
披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsute)J2，分类命名为披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsute)J2，已于2020年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2020103。
附图说明
图1为江西糖多孢菌J3的系统发育树。
图2为黄酒发酵过程中理化指标的变化；(A)酒精度；(B)还原糖；(C)可滴定酸；(D)氨基酸态氮。
图3为黄酒发酵样品风味物质的主成分分析。
具体实施方式
黄酒理化指标的检测：酒精度、氨基酸态氮和总酸的测定按照GB/T 13662-2018进行测定。生物胺含量风味物质采用高效液相(HPLC)和气质联用仪器(GC-MS)进行检测。还原糖含量测定采用DNS方法。
实施例1：糖多孢菌的筛选及鉴定
(1)样品的采集及预处理
麦曲样品采自浙江省绍兴市某黄酒厂，采集的麦曲置于密封的无菌塑料袋中4℃保存。称取5g麦曲于50mL离心管中，添加30mL蒸馏水放入30℃摇床培养箱中培养30min。
(2)菌株的平板筛选
放线菌筛选培养基：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.2-7.4(25℃)。
在无菌操作环境下，用无菌移液枪吸取1mL样品置于15mL无菌离心管中，加无菌水至10mL，充分混匀，制成10-1的样品匀液。用无菌移液枪吸取10-1样品匀液1mL于15mL无菌离心管中，加无菌水至10mL，充分混匀，制成10-2的样品匀液。按上述操作，以此制成10-1～10-6十倍递增系列麦曲、米浆水、发酵醪稀释匀液。
分别吸取麦曲、发酵醪、米浆水各稀释度菌液100μL涂布于放线菌筛选培养基，28℃培养1～7d。在菌落密度适中的平板上挑取单个乳白色、菌落薄、有隆起或凸面、略皱的菌落，分别划线接种到放线菌筛选培养基上，反复划线确定纯菌落，并保存筛选菌株。
(3)菌株鉴定
提取筛选菌株的基因组，并对筛选菌株进行16S rDNA扩增测序。
PCR扩增引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。
PCR扩增体系(50μL)为：2×Taq PCR Master Mix 25μL，上下引物各1μL，模板1μL，加无菌水22μL补充至50μL。
PCR扩增程序：94℃预变性3min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃延伸8min。
PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并送交基因测序公司测序，其16S rDNA结果如下：
GGGTTGGGCCATGGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCATGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCACGGGGTCGAGTTGCAGACCCCGATCCGAACTGAGACCGGCTTTAAGGGATTCGCTCAACCTCACGATCTCGCAGCCCTCTGTACCGGCCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGGCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCCCCCACGAGTCCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATAGGGCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACCACGAAGCTGACGACAGCCATGCACCTACCTGTACACCAACCACAAAGGGAAACCCCCTCTCAGGGGCTGTCTAGTGCATGTCAAACCMAGGTAAGGTTYTTCGCGTTGCATSGAATTAATCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCGCTTAATGCGTTTAGCTACGGCACGGAAACAGTGGAACCCATCCCCACACCTAGCGCCCAACGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTATCGGCCCAGAGACCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGAACTCAAGTCTGCCCGTATCCACCGCAAGCCAGGAGTTAAGCTCCCGGTTTTCACGATAGACGCGACAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTTAGCCGGTGCTTTCTTCTACACCTTACTCGTCAACCCYAAAGGGGCCTTCGTCGATGTCGAAAGTAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCCCACGCGGCGTTGCTGCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGCAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTAGGCCATCACCCCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTGCACCGCCGGAACTTTCCACACACGAAGATGCCTCCATGTGTCCTATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAAGGCTTATCCCAGAGTGCAGGGCAGATTACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTCATCCACACCCGAAAGTG。
根据返回的测序结果(如SEQ ID NO.1所示)，通过NCBI官网进行BLAST序列比对，用所得的16S rDNA序列进行BLAST比对，并进行了系统发育分析，结果如图1所示，菌株J3的核苷酸序列与糖多孢菌属S.jiangxiensis(GenBank相似序列号：MG255179.1)的同源相似性在98.84％以上，将该菌株命名为江西糖多孢菌J3。
(4)菌株生物胺代谢能力的分析
菌种活化：将保藏的江西糖多孢菌J3接种到放线菌液体培养基中，接种量10％，30℃摇床培养48h，得一级种子液。将活化的菌株接种到放线菌液体培养基中，接种量10％，摇床培养48h，转速150r/min，温度30℃。
样品预处理：将菌种分别接种于检测生物胺产生培养基和检测生物胺降解培养基中，28℃摇床培养5d，12000r/min离心5min收集上清液。
放线菌液体培养基：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，pH值7.2-7.4(25℃)。
检测生物胺产生培养基：放线菌液体培养基中添加L-酪氨酸0.4g/L，L-组氨酸1g/L，L-赖氨酸1g/L，L-鸟氨酸1g/L，5′-磷酸吡哆醛0.05g/L。
检测生物胺降解培养基：放线菌液体培养基中添加50mg/L生物胺(包括组胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亚精胺、色胺、β-苯乙胺)，调节pH至6.0-6.2。
生物胺含量测定方法：准确量取1mL待测液于15mL离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，混匀，加入2mL丹磺酰氯(5mg/mL丙酮)试剂，混匀后置于65℃恒温水浴锅中黑暗衍生30min，室温静置后，加入0.5mL饱和NaCl溶液，混匀后加入5mL乙醚，涡旋振荡20s，静置分层后，转移上层有机相于15mL离心管中，下层水相再萃取一次，合并两次萃取液，50℃水浴下氮气吹干。加入1mL乙腈振荡混匀，溶解残留物，过0.22μm滤膜，通过高效液相色谱法(HPLC)测定。
江西糖多孢菌J3降生物胺效果分析：在生物胺前体存在的培养基中培养后的江西糖多孢菌J3的各类生物胺产生量均小于2.5mg/L，生物胺检出量极少，表明基本上没有检测到生物胺的含量，因此认为不产生生物胺。江西糖多孢菌J3对酪胺的降解率分别81.55％，对组胺的降解率分别达到100％，对腐胺的降解率分别达到51.8％，对尸胺的降解率分别达到40.01％，对总生物胺的降解率达到69.09％。说明该菌株具有良好的降生物胺的能力。
实施例2：江西糖多孢菌S.jiangxiensis J3的菌种活化培养
放线菌液体培养基：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，pH值7.2-7.4(25℃下测定)。
PDA培养基：马铃薯粉6.0g/L；葡萄糖20.0g/L，琼脂20.0g/L，pH 5.4-5.8，121℃高压灭菌15min；固体培养基在此基础上添加。
MRS培养基：牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏0.5g/L，葡萄糖20g/L，吐温800.10g/L，醋酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.28g/L。
将实施例1筛选的江西糖多孢菌J3接种到放线菌液体培养基中，接种量10％，30℃摇床培养48h，得一级种子液。将活化的菌株接种到放线菌液体培养基中，接种量10～15％，摇床培养48h，转速150r/min，温度30℃，获得菌浓数量级为105～107cfu/mL的菌液，待培养成熟后用于纯种麦曲的制备。
将保藏的黄曲霉(Aspergillus flavus)和米曲霉(Aspergillus oryzae)接种到PDA平板上，28℃培养3～5天；然后用无菌水清洗孢子液，再次转接到PDA茄形瓶中，温度28℃培养3～5天，获得菌浓数量级为105～107cfu/mL的菌液，待孢子成熟后用于纯种麦曲的制作。
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)接种到MRS培养基中，接种量10％，37℃恒温厌氧培养24h，得到一级种子培养液，将活化的种子液再次接种到MRS液体培养基中，接种量为10％，37℃恒温厌氧培养24h，获得菌浓数量级为105～107cfu/mL的菌液，菌种培养成熟后用于纯种麦曲制作。
实施例3：糖多孢菌纯种麦曲的制备
(1)碾麦：小麦破碎程度为每粒3-5片，带少量粉末，使麦粒组织破碎，淀粉外露；
(2)润麦：向步骤(1)处理后的物料中加入约35～45％的清水，搅拌20～25min，使其充分均匀的吸收水分；
(3)蒸煮灭菌：将步骤(2)处理后的物料于121℃灭菌30min；
(4)接种：待步骤(3)的物料降温至36℃后，接种活化菌种，接种菌液浓度为105～106cfu/mL，接种量为4‰-20％。
(5)曲料进盘后保持适当品温及室温，静置培养6小时，再按如下步骤处理：
a)孢子发芽期：曲料进盘6小时后，品温缓慢上升至34-35℃左右，自控模式启动小风量间接通风，每次5-10分钟，间隔2小时，使品温降到32℃，要求均匀吹透；
b)菌丝生长期：间歇通风3-5次后，菌丝开始生长，品温升至35℃以上，曲料开始结块，此时应连续通风，维持品温35℃左右；
c)菌丝繁殖期：接种后12小时，品温上升较快，此时应视第一次结块情况进行翻曲，翻曲前，先升起测温探头，开启翻曲机，后摊平，放下测温头，开启通风及喷雾系统；
d)第一次翻曲后，品温保持在36-37℃之间，保持通风喷雾顺畅，约20小时后，曲料再次结块，眼观曲料发白，温度控制在37℃以下，进行第二次翻曲，二次翻曲过后，品温应控制在35℃左右。
(6)出曲：培养75～100h；培养结束后，将麦曲置于4-7℃冰柜中储藏备用。
按照以上方法分别制备获得菌体数量级为1015CFU/g江西糖多孢菌J3纯种麦曲、披发糖多孢菌J2纯种麦曲。
实施例4：糖多孢菌麦曲在黄酒发酵中的应用
(1)本实施例所选取的传统黄酒发酵的原料配比(以每升发酵体积计)为：
蒸熟的米饭：500g；清水417L；酒母：38g；
(2)传统黄酒酿造过程
a)酵母活化培养：将甘油保藏管的酵母菌，在无菌操作台进行转接到YPD培养基中，30℃，150r/min条件下培养24h；然后转接到制备好的酒母中，将转接好的酵母在30℃，150r/min条件下，进行培养18-24h，备用。
b)酒母的制作：取600g蒸熟的米饭，加入1600mL清水，60g生麦曲，800U/g米饭的糖化酶进行糖化，糖化的温度控制在55-65℃，时间3-4小时，糖化结束后外观糖度不低于12°Bx后，115℃灭菌15min，灭菌后冷却至24～31℃，接入成熟的酵母种子培养液5％，培养温度不超过30℃，培养时间24h，培养成熟后即得酒母。
c)按照步骤(1)所述的传统黄酒发酵的原料配比进行落料和发酵。
实验组：糖多孢菌数量级为1×1015CFU/g的纯种麦曲：45.3g；对照组：生麦曲：39.3g；熟麦曲：6.0g。
前四天为前酵阶段，温度控制在28～30℃，发酵4d，前4d每天开耙不少于1次，头耙时间8-10h；后酵阶段，温度为13～15℃，每天搅拌开耙一次，持续发酵10～15d。
对照组(TF Control)是将本实施例中(3)的纯种麦曲调整为工厂取样的生麦曲39.3g/L和熟麦曲6.0g/L。
复合菌剂组(Mix)按照菌体数量1:1的比例添加披发糖多孢菌J2纯种麦曲和江西糖多孢菌J3纯种麦曲，添加量共45.3g。
黄酒发酵过程中理化指标的变化：为了进一步验证糖多孢菌在黄酒发酵中的作用，对比了传统麦曲和纯种麦曲发酵过程中理化指标(酒精度，还原糖，可滴定酸和氨基酸态氮)的变化(图2)。麦曲发酵组共分为5组，分别为A.flavus(黄酒发酵中的常用菌),A.oryzae(日本清酒酿造中的常用菌),Mix(江西糖多孢菌J3和披发糖多孢菌J2混合麦曲发酵组)，S.jiangxiensis J3和L.plantarum。这5种纯种麦曲分别与酿酒酵母采用本实施例步骤2中a)～c)的传统酿造方法共同发酵。至发酵结束，除L.plantarum组外，其他各组酒精度、酸度和氨基酸态氮含量均达到黄酒国家标准。L.plantarum组可滴定酸含量迅速增加到17.50g/L，样品出现明显的酸败。
黄酒发酵样品中氨基酸含量：采用HPLC方法对发酵黄酒中的氨基酸含量进行了分析，Mix，A.flavus和A.oryzae实验组的氨基酸含量相差不大，但是均显著高于对照组(TFControl)；而添加S.jiangxiensis J3实验组的总氨基酸含量则与对照组相差不大，部分氨基酸含量显著超出对照组。
表1黄酒发酵样品中的氨基酸含量分析
Figure BDA0002631180970000101
注：gaga为γ-氨基丁酸。
(3)糖多孢菌降生物胺效果分析
江西糖多孢菌J3和复合菌剂(Mix组)降生物胺效果分析：将发酵所得的黄酒用高效液相法检测生物胺含量，添加江西糖多孢菌J3的样品组相比较对照组降低了35.09％；添加披发糖多孢菌J3的样品组相比较对照组降低了21.71％；添加披发糖多孢菌J2组和江西糖多孢菌J3的复合菌剂(Mix组)相比对照组降低了42.17％。
(4)纯种发酵与传统发酵风味分析
采用主成分分析法对纯种和传统发酵样品中风味成分的变化和相似性进行了分析。所有样本的biplot分析表明，前两个主成分的方差累积贡献率为83.6％，这可以解释大多数发酵样本的风味差异。从图3可以看出，传统发酵组与Mix组和江西糖多孢菌J3组聚在一起，与曲霉(A.flavus和A.oryzae)组和L.plantarum组明显分离。这说明糖多孢菌参与了大多数风味物质的合成，并在黄酒发酵中起主导作用。
实施例5：糖多孢菌菌剂在黄酒发酵中的应用
以实施例4中的传统黄酒落料配方进行黄酒发酵，实验组分别设置Mix组和江西糖多孢菌J3组，区别在于，麦曲接种比例均为10％；江西糖多孢菌J3组接种江西糖多孢菌J3组纯种麦曲；Mix组接种应用江西糖多孢菌J3和披发糖多孢菌J2混合菌液按照实施例3的方法制备的复合菌种麦曲。黄酒酿造工艺和指标测定方法参照实施例4进行。
(1)对黄酒基本理化指标的影响
根据表2可以看出发酵结束后各组酒精度达到14％v/v左右，所有样品的还原糖、总酸和氨基酸态氮含量均在4.52-5.03g/L，均符合黄酒的理化要求。显著性分析表明Mix组与江西糖多孢菌J3组的酒精度、总酸含量和氨基酸态氮含量与对照组差异均不明显(P＞0.05)，说明接种江西糖多孢菌J3对黄酒发酵过程中重要理化指标影响不大，不会对黄酒发酵过程带来不利影响。
表2发酵结束时黄酒理化指标
Figure BDA0002631180970000111
(2)糖多孢菌对黄酒生物胺含量的影响
发酵结束后，接种复合菌剂Mix组、江西糖多孢菌J3组的样品生物胺含量分别为15.57±0.44mg/L和16.88±1.41mg/L，均低于对照组的26.75±2.39mg/L。江西糖多孢菌J3组与对照组相比降低了36.90％。说明复合菌剂Mix、江西糖多孢菌J3均有降低生物胺含量的作用。
综上所述，在黄酒发酵体系中接种复合菌剂Mix、江西糖多孢菌J3均不影响黄酒的正常品质，且对总胺的降解率分别达到了对照组的41.79％和36.90％。说明直接添加复合菌剂Mix或江西糖多孢菌J3均有应用于黄酒生产、调控黄酒中生物胺含量的潜力，复合菌剂Mix对黄酒中生物胺的降解效果更佳。
实施例6：江西糖多孢菌J3应用于发酵鱼中降低生物胺含量
以实施例1中的方法进行菌种活化。
利用中性蛋白酶发酵臭鳜鱼，具体工艺为：
(1)样品预处理：鳜鱼去内脏，称重3kg；
(2)发酵液制备：取鳜鱼等质量饮用水，以此为100％计，加入6％盐、1％大葱、0.6％姜、0.1％八角、0.05％茴香、0.05％孜然、0.01％辣椒、0.01％花椒、300000U中性蛋白酶，混匀，得发酵液；
(3)接种：发酵液分成两份，一份以10％接种量向发酵液中接种活化的江西糖多孢菌J3菌种，菌液浓度为107cfu/mL，另一份不接种；
(4)发酵：将鳜鱼浸于步骤(3)接种后的发酵液中，最上层用石头压实，20℃下发酵6天，得臭鳜鱼。
生物胺的测定方法：称取绞碎后鱼肉样品5.0g于50m L离心管中，加入20m L 5％的三氯乙酸并超声30min，转移至50m L具塞离心管中，6 000r/min离心10min，转移上清液至50m L容量瓶中，残渣用20m L上述溶液再提取1次，合并上清液并稀释至刻度。然后准确量取1mL上清液于15mL离心管中，加入1mL饱和NaHCO3溶液，混匀，加入2mL丹磺酰氯(5mg/mL丙酮)试剂，混匀后置于65℃恒温水浴锅中黑暗衍生30min，室温静置后，加入0.5mL饱和NaCl溶液，混匀后加入5mL乙醚，涡旋振荡20s，静置分层后，转移上层有机相于15mL离心管中，下层水相再萃取一次，合并两次萃取液，50℃水浴下氮气吹干。
加入1mL乙腈振荡混匀，溶解残留物，过0.22μm滤膜，通过高效液相色谱法(HPLC)测定。
发酵结束后，采取复合菌剂Mix强化的臭鳜鱼生物胺比对照组下降了20.87％；采用S.jiangxiensis J3强化的臭鳜鱼生物胺比对照组下降了23.24％。
实施例7：江西糖多孢菌J3用于料酒中降低生物胺含量
以实施例1中的方法进行生物胺含量的测定。
按照实施例4中酿造方法获得纯种发酵黄酒，向发酵黄酒中加入按质量计10％食盐，过灭菌机85℃灭菌30min热灌装。
对菌株在料酒中降生物胺的效果进行分析：用高效液相法检测料酒中生物胺含量，添加复合菌剂Mix和江西糖多孢菌J3的样品组与对照组相比，分别降低了23.16％和18.91％。
实施例8：江西糖多孢菌J3用于食醋中降低生物胺含量
按照实施例4中酿造方法获得纯种发酵黄酒，作为醋酸发酵原料；以实施例1中的方法进行生物胺含量的测定。
醋酸发酵采用固态发酵工艺：将大糠、麸皮、黄酒按照1:4:10的质量比拌匀，接入5％的醋醅，接种后前2天内每天从物料表面翻醅，保持温度为35-42℃。到6-8天时翻到物料底部。第8-12天，每天从底部翻醅，温度自然下降。从醋醅中分离后得生醋，在经过85℃灭菌30min后陈酿12个月。在灌装前经过高温灭菌后热灌装。
复合菌剂Mix和江西糖多孢菌J3降生物胺效果分析：所得固态发酵酿造食醋中醋酸含量均为55g/L。检测样品中生物胺含量，添加复合菌剂Mix和江西糖多孢菌J3的样品组与对照组相比，分别降低了25.08％和27.61％。
实施例9：江西糖多孢菌J3应用于白酒中降低生物胺含量
白酒酿造使用的糖多孢菌纯种麦曲参照按照实施案例3中麦曲制作方法。以实施案例1中的方法进行生物胺含量的测定。
白酒酿造方法采用两轮发酵法，第一轮发酵时高粱蒸熟后，风冷降温至25℃，添加4％米曲霉种子液，在28℃温度下培养24h。添加稻壳10％、大曲15％、麸皮8％、实施例3制备的纯种麦曲5～9％、按1％的比例接入酿酒酵母种子液，然后密封，发酵30天后进行蒸酒。二轮发酵时添加中温大曲10％、按1％的比例接入酿酒酵母种子液，酵母菌种子液浓度为1010～1012cfu/mL，继续发酵12～15天后进行蒸酒。
对江西糖多孢菌J3降生物胺效果分析：将蒸馏后的白酒勾兑成酒精度60％(V/V)，检测勾兑后样品中生物胺含量，添加江西糖多孢菌J3的样品组生物胺含量降低。
实施例10：江西糖多孢菌J3应用于酱油中降低生物胺含量
以实施案例1中的方法进行菌种活化和生物胺含量的测定。酱油采用高盐稀态法进行酿造：
(1)首先将豆粕和小麦按1:1比例混匀，然后蒸熟；
(2)按照5‰～10％的比例加入菌液浓度为105～106cfu/mL的江西糖多孢菌J3种子液，然后加入约1.5～2倍物料质量的盐水，酱醪最终含盐量约为18％、含水量为65％，然后混匀。
(3)酱醅发酵：起始发酵温度控制在14～16℃，随着发酵进行温度逐渐升高到约35℃。持续发酵约5个月。
(4)发酵结束后的将酱醪进行板框压榨，去除酱醅。压榨结束后进行硅藻土过滤和膜过滤，去除沉淀。过滤澄清的酱油经过巴氏灭菌后进行灌装。
江西糖多孢菌J3降生物胺效果分析，添加江西糖多孢菌J3的酱油产品中的生物胺含量相较于对照组降低。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 糖多孢菌及其在食品中的应用
<130> BAA200246A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1370
<212> DNA
<213> Saccharopolyspora jiangxiensis
<400> 1
gggttgggcc atgggcttcg ggtgttaccg actttcatga cgtgacgggc ggtgtgtaca 60
aggcccggga acgtattcac cgcagcaatg ctgatctgcg attactagcg actccgactt 120
cacggggtcg agttgcagac cccgatccga actgagaccg gctttaaggg attcgctcaa 180
cctcacgatc tcgcagccct ctgtaccggc cattgtagca tgtgtgaagc cctgggcata 240
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<211> 19
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Claims (17)

1.一株江西糖多孢菌（Saccharopolyspora jiangxiensis）J3，已于2020年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020104。
2.含有权利要求1所述江西糖多孢菌J3的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，含有所述江西糖多孢菌J3的活细胞。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，含有所述江西糖多孢菌J3冷冻干燥得到的干菌体或固定化的细胞。
5.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液体菌剂或固体菌剂。
6.根据权利要求2~5任一所述的微生物菌剂，其特征在于，每克或每毫升微生物菌剂中的江西糖多孢菌J3的数量≥1×106 CFU。
7.应用权利要求1所述江西糖多孢菌J3制备的纯种麦曲，其特征在于，是将经碾麦、润麦处理后的小麦进行蒸煮，再接种权利要求1所述的糖多孢菌进行发酵，获得纯种麦曲。
8.应用权利要求2~6任一所述微生物菌剂制备的纯种麦曲，其特征在于，是将经碾麦、润麦处理后的小麦进行蒸煮，再接种权利要求2~6任一所述的微生物菌剂进行发酵，获得纯种麦曲。
9.根据权利要求7所述的纯种麦曲，其特征在于，所述纯种麦曲的制备方法包括如下步骤：
（1）碾麦：将麦粒组织破碎，淀粉外露；
（2）润麦：向步骤（1）处理后的物料中加入物料质量30-45%的清水，搅拌15-25 min；
（3）蒸煮灭菌：将步骤（2）处理后的物料蒸煮灭菌；
（4）接种：待步骤（3）的物料降温至低于40℃后，接种所述糖多孢菌，接种量为105-107CFU/mL；
（5）发酵。
10.根据权利要求8所述的纯种麦曲，其特征在于，所述纯种麦曲的制备方法包括如下步骤：
（1）碾麦：将麦粒组织破碎，淀粉外露；
（2）润麦：向步骤（1）处理后的物料中加入物料质量30-45%的清水，搅拌15-25 min；
（3）蒸煮灭菌：将步骤（2）处理后的物料蒸煮灭菌；
（4）接种：待步骤（3）的物料降温至低于40℃后，接种所述微生物菌剂，接种量为105-107CFU/mL；
（5）发酵。
11.权利要求1所述的菌株、权利要求2~6任一所述的微生物菌剂，或权利要求8~10任一所述的纯种麦曲在制备发酵食品中的应用。
12.权利要求1所述的菌株、权利要求2~6任一所述的微生物菌剂，或权利要求8~10任一所述的纯种麦曲在制备饮品中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述饮品为酒精饮品。
14.权利要求1所述的菌株、权利要求2~6任一所述的微生物菌剂，或权利要求8~10任一所述的纯种麦曲在制备调味品中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述调味品为食醋、料酒或酱油。
16.权利要求1所述的江西糖多孢菌（Saccharopolyspora jiangxiensis）J3在降低发酵食品中生物胺含量方面的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述生物胺为酪胺、组胺、腐胺或尸胺。
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