CN116463235A - 一种提高食醋风味品质的枯草芽苞杆菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌菌株HSCY3011，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.25011，保藏日期为2022年06月06日。还公开了菌株HSCY3011在食醋酿造中的应用。HSCY3011耐受性强、能够产丰富的氨基酸、不挥发酸以及川芎嗪等物质，从而显著提升食醋感官品质。
Description
技术领域
本发明属于传统食醋酿造领域，具体涉及一株耐受性强、能够产丰富的氨基酸、不挥发酸以及川芎嗪等物质，从而显著提升食醋感官品质的枯草芽孢杆菌，还涉及所述枯草芽孢杆菌在食醋酿造中的应用。
背景技术
食醋是一类重要的调味品，滋味是决定其品质的一个重要因素。目前我国食醋酿造生产过程中，由于受到环境、季节、原料、工艺操作等因素影响，有时会发生苦味，严重影响酿造食醋品质甚至安全。传统降低苦味的方法是通过添加大量的蔗糖或甜味剂来掩蔽苦味，但是过多的食用高糖量的食物容易引发糖尿病，过多甜味剂在体内代谢会对身体产生不良影响。
枯草芽孢杆菌是一类耐受性较强的细菌，生长速度快，安全性较高，部分菌株对乙酸、高温具有较强的抵抗力。因此，筛选出适合食醋特殊酿造环境的具有优良抗逆性的芽孢杆菌，再将其应用于食醋的生产过程中，对稳定并提高产品品质具有重要的意义。目前鲜有将从醋醅中分离得到枯草芽孢杆菌应用于食醋产丰富氨基酸、提升口感方面的研究报道。通过创新分离和培养方法、依托能良好适应食醋酿造恶劣环境的新型枯草芽孢杆菌菌种提高传统食醋的整体风味品质，具有良好的应用前景。
发明内容
为解决上述技术问题，本法明第一方面提供了一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌命名为HSCY 3011，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.25011，保藏日期为2022年06月06日。HSCY 3011耐受性强、能够产丰富的氨基酸、不挥发酸以及川芎嗪等物质，显著提升食醋感官品质。
本发明第二方面提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包含本发明第一方面所述的枯草芽孢杆菌。
本发明第三方面提供了本发明第一方面所述的枯草芽孢杆菌、第二方面所述的微生物菌剂在食醋酿造中的应用。
在某些实施方式中，所述食醋为香醋、陈醋或米醋。
本发明第四方面提供了一种食醋的酿造方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制备菌株种子液或制备微生物菌剂；
(2)接种步骤(1)得到的菌株种子液或微生物菌剂进行发酵。
在某些实施方式中，当制备香醋或陈醋时，分别接入接种量为酒醪重量1-15％(v/v)的枯草芽孢杆菌的种子液，接入接种量为酒醪重量1-10％(v/v)的醋酸菌，进行醋酸发酵。
在某些实施方式中，当制备米醋时，将枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中培养，离心收集菌体，将无菌保护剂与菌体混合，利用真空冷冻干燥制得菌剂，按照1～15％的接种量接入醋酸菌，加入活化的枯草芽孢杆菌，进行醋酸发酵。
在某些实施方式中，枯草芽孢杆菌按照1-15％的接种量接种到LB培养基中；无菌保护剂与菌体均匀混合后放置在40-45℃的培养箱中热激处理。
在某些实施方式中，LB培养基中培养的温度为30-40℃，转速150-220r/min培养20-48h；
在某些实施方式中，无菌保护剂与菌体均匀混合放置在40～45℃的培养箱中热激1～10s；
在某些实施方式中，利用真空冷冻干燥制得菌剂中的枯草芽孢杆菌的活菌数约为108-1010cfu/g；
在某些实施方式中，加入的活化后的枯草芽孢杆菌量为1-15g。
在某些实施方式中，无菌保护剂的制备方法为：
A：脱脂奶粉10g，蒸馏水100mL，115℃灭菌15min；B：甘油0.5g、乳糖3g、甘露醇4g、海藻糖5g、蒸馏水100mL，121℃灭菌15min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。
在某些实施方式中，真空冷冻干燥工艺参数：冷阱温度为-40℃，板的温度为25℃，真空度初始为30Pa，终止为40Pa。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明从镇江香醋生产工艺过程的醋醅中分离筛选得到一株较适合于食醋酿造环境的枯草芽孢杆菌。通过该菌株的使用，可在食醋发酵过程中分泌淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶等丰富的酶系，从而有效提高淀粉和蛋白质等营养物质的利用效率，产生丰富的甜味氨基酸、还原糖、不挥发酸以及川芎嗪等营养物质。所发酵的醋产品风味独特，营养价值高，口感柔和，酸甜适口，基本无苦，避免了后期加大量糖或甜味剂调整口感带来的弊端，可满足消费者的养生需求，市场适应性更强。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：
图1 Bacillus subtilis HSCY 3011菌落形态。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另作定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。同样，“一个”或者“一”等类似词语也不表示数量限制，而是表示存在至少一个。
本发明实施例中LB培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，115℃灭菌20min。
LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，磷酸氢二钠0.5g，琼脂20.0g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，115℃灭菌20min。
产蛋白酶筛选培养基：牛肉膏5.0g，干酪素30.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH值自然，115℃灭菌20min。
产淀粉酶筛选培养基：蛋白胨10.0g，尿素15.0，酵母浸粉5.0g，麦芽糖150.0g，玉米淀粉20.0g，葡萄糖1.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁5.0g，硫酸锰4.0g，吐温80 1.0mL，氯化钠0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，115℃灭菌20min。
高温α-淀粉酶、糖化酶：购自山东隆科特酶制剂有限公司。
实施例1枯草芽孢杆菌HSCY3011的分离与鉴定
(1)菌株分离
称取镇江香醋醋醅样品15g，置于85mL已灭菌的LB培养基中，温度30℃、转速200r/min，振荡培养20min后，90℃水浴加热10min，对样品进行10倍梯度稀释，选取稀释梯度为10-3、10-4、10-5和10-6的稀释液，分别吸取100μL涂布LB固体培养基平板，40℃倒置培养48h。
(2)菌株纯化
挑取单个菌落革兰氏染色、镜检，对革兰氏阳性、杆状的细菌平板划线分离3次，取单菌落保存。
(3)菌株筛选
将纯化好的待测菌株用点接法接种到产蛋白酶筛选培养基，37℃培养24h后，选取菌落数30-300的平板，从中挑取生长良好、有明显透明圈的菌落，即产蛋白酶菌株。测量透明圈直径和菌落直径之比(H/d)，选择比值大于4.0的16株菌株，即具有较强产蛋白酶能力的菌株。再将初筛得到的16株菌株转接到产淀粉酶筛选培养基上，40℃培养36h后，在平板上滴加5mL碘液，均匀覆盖平板，按照前面方法选择透明圈最大的那株菌株，即可得到1株既高产蛋白酶又高产淀粉酶的菌株。其菌落形态为：呈白色或微黄色，表面粗糙，不透明，在液体培养基中生长时常形成皱壁。其菌落形态如图1所示。采用福林-酚比色法测定蛋白酶酶活发现，该菌株蛋白酶活性可达到952.87U/mL发酵液。同时作为对照，使用相同的方法检测公开号为CN113549575A的专利中枯草芽孢杆菌的蛋白酶活性，检测结果为202.3U/mL。采用3，5-二硝基水杨酸法(3，5-dinitrosalicylic acid，DNS)测定发现，该菌株淀粉酶活性可达到129.62U/mL发酵液。
(4)菌株鉴定
对纯化筛选得到的细菌，取指数生长期的新鲜菌液，离心收集菌体，采用基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物P0-P6(中国硕士学位论文全文数据库，朱其瀚，“镇江香醋发酵过程中微生物分离及其产酸特性”，2008年)扩增其16S rDNA全长序列。PCR扩增产物的测序由上海生工生物技术公司完成。将测得的16S rDNA序列，在NCBI数据库中进行BLAST比对确定其种属，该菌株16S rDNA全长序列为1425bp，与其具有最高同源性的菌株为Bacillus subtilis，相似度为100.0％，16S rDNA序列见SEQ ID NO：1。结合其特征，将本发明菌株命名为枯草芽孢杆菌HSCY 3011。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HSCY 3011，于2022年6月6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 25011。
实施例2枯草芽孢杆菌HSCY3011在镇江香醋酿造中的应用
1、菌株的扩大培养
一级种子液的制备：按照5％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的枯草芽孢杆菌HSCY3011菌液接种到LB培养基中，温度40℃，转速200r/min培养24h。
二级种子液的制备：选用50L液态自吸式发酵罐，加水35L，搅拌速度为120r/min，将水加热到90℃，加入经粉碎并过100目筛得到的玉米淀粉10kg，加入2万U/mL高温α-淀粉酶，添加量为3.0mL，保温35min得到醪液；然后将醪液温度降至45℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为0.50g，保温35min，制得糖化液；在所制备的糖化液中添加0.5％(w/v)的蛋白胨和0.5％(w/v)酵母粉，121℃灭菌15min；冷却至35℃后，按照5％的接种量接入一级种子液，调整通气量为0.1vvm，搅拌速度为200r/min，35℃保压发酵24h，活菌数达到108cfu/mL。
2、酒醪制备
取6个500kg大缸，各取100kg优质糯米加水浸泡过夜。利用蒸汽将糯米蒸熟，以冷水淋饭至温度约40℃加入酒药0.5kg，拌匀后入缸搭窝成喇叭状。待窝中有一定的酒液出现时，每缸加入麦曲6.0kg，然后加水300kg，搅拌均匀。酒精发酵过程中，定期搅拌，温度控制在30℃左右，约发酵5～7d结束。发酵结束后，将6个大缸中酒醪混合均匀后调整酒精度至9％vol，备用。
3、分组加料制醅
添加枯草芽孢杆菌HSCY 3011组：取3个500kg大缸，每个缸中加入上述酒醪200kg，然后加入本发明菌株HSCY 3011的二级种子发酵液，添加量为酒醪质量的5.0％，加入麸皮80kg，大糠35kg，将酒醪和谷物混合均匀。按照传统镇江香醋酿造工艺，每缸中加入种子醅25kg于醋醅的上部，然后盖上大糠保温。
对照组1：选取3个大缸，以蒸馏水替代菌株HSCY 3011的二级种子发酵液，按照与上述添加枯草芽孢杆菌HSCY 3011组相同的添加量和添加方式进行操作。
4、发酵、封醅、淋醋
按照传统镇江香醋的“固态分层发酵技艺”逐层进行翻醅，待醋醅发酵至醅卤总酸不再增加时将封醅压实，加盐封醅10天。封醅结束后，将醋醅加入淋醋缸，然后加入炒米色进行淋醋。对照组1步骤与实施例2保持一致。
5、煎醋及灌装
添加枯草芽孢杆菌HSCY 3011组：将生醋进行煎煮，温度100℃，煎煮时间30min，煎煮过程中不添加白砂糖。熟醋液进行热灌装，灌装温度不低于65℃，灌装结束即得到成品。
对照组1：煎煮过程中添加1.8％白砂糖，其他步骤与上述添加枯草芽孢杆菌HSCY3011组的相同。
6、总酸、不挥发酸、还原糖、川芎嗪含量检测
对步骤5所制得的成品醋进行检测。总酸、不挥发酸的含量参照《GB18187-2000》方法进行测定，其中总酸以乙酸计，不挥发酸以乳酸计；还原糖的含量参照《GB 5009.7-2016》方法进行测定，还原糖以葡萄糖计；川芎嗪(四甲基吡嗪)的含量参照《GB/T 19777-2013》方法进行测定。
表1成品醋中总酸、不挥发酸、还原糖和川芎嗪含量对比
与对照组1相比，使用本发明菌株的实施例2，成品醋中总酸含量提高4.78％，不挥发酸含量提高28.42％，还原糖含量提高37.24％，川芎嗪含量提高238.94％，产品出率提高5.06％。
7、有机酸含量检测
采用HPLC对成品醋中9种有机酸含量进行分析，结果如表2所示。发酵结束后，醋卤中的有机酸主要以乙酸与乳酸为主，二者在实施例2中的含量分别为53.26mg/mL和12.05mg/mL，相比于对照组1分别提高了11.82％和17.22％。乳酸含量增加，使食醋入口更柔和，回味绵长。
表2枯草芽孢杆菌HSCY3011在镇江香醋酿造中的有机酸含量(mg/mL)
| 组别 | 酒石酸 | 草酸 | 丙酮酸 | 甲酸 | 乳酸 | 乙酸 | 柠檬酸 | 焦谷氨酸 | 琥珀酸 |
| 实施例2 | 2.66 | 1.02 | 0.95 | 2.56 | 12.05 | 53.26 | 0.48 | 1.81 | 3.62 |
| 对照组1 | 1.93 | 1.17 | 1.14 | 2.14 | 10.28 | 47.63 | 0.52 | 1.63 | 3.15 |
8、淀粉含量检测
淀粉按照GB 5009.9-2016中，采用酶水解法进行测定。取发酵起始及发酵结束当天的醋醅检测淀粉含量，结果如表3所示。相比于对照组1，实施例2的淀粉利用率提高了21.63％，由此可见，在醋酸发酵阶段添加枯草芽孢杆菌，显著提高了原料的淀粉利用率，减少了浪费。
表3枯草芽孢杆菌HSCY 3011在镇江香醋酿造中的淀粉利用率
9、氨基酸含量检测
采用HPLC方法对成品醋中17种氨基酸含量进行了分析，结果如下表4所示。发酵结束时，实施例2氨基酸的总含量达到2942.02mg/100mL，相比对照组1的1062.56mg/100mL提高了176.88％。实施例2中甜味氨基酸占比高达65.38％，相比对照组1提高了92.21％，苦味氨基酸占比相比对照组1下降了62.34％。说明该发明所用的枯草芽孢杆菌HSCY 3011有利于甜味氨基酸的增加，相从而增加食醋的甜味，降低其苦味。
表4枯草芽孢杆菌HSCY 3011在镇江香醋酿造中的氨基酸含量
10、成品醋感官指标分析
选取30名富有经验的香醋感官评价人员，对实施例2与对照组1的产品进行感官评价分析，结果见表5。通过三点检验，发现在30名评价员中有26名评价员表示实施例2和对照组1产品之间的差异显著；通过描述性分析，实施例2产品色泽更红亮，体态更澄清，香气更醇厚，滋味更加柔和，刺激性更低；通过喜好性综合打分评价，实施例2的产品在色泽、体态、香气和滋味方面的得分明显高于对照组1，说明在醋酸发酵阶段添加枯草芽孢杆菌，显著提高了产品品质。
表5枯草芽孢杆菌HSCY 3011在镇江香醋酿造中的成品醋感官指标分析
| 组别 | 色泽(10分) | 体态(10分) | 香气(10分) | 滋味(10分) |
| 实施例2 | 9.6 | 9.4 | 9.6 | 9.8 |
| 对照组1 | 8.5 | 7.8 | 7.2 | 7.5 |
实施例3枯草芽孢杆菌HSCY3011在山西老陈醋中的应用
1、菌株的扩大培养
一级种子液的制备：按照8％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的枯草芽孢杆菌HSCY 3011菌液接种到LB培养基中，温度40℃，转速180r/min培养36h。
二级种子液的制备：选用50L液态自吸式发酵罐，加水35L，搅拌速度为150r/min，将水加热到95℃，加入经粉碎并过100目筛得到的玉米淀粉12kg，加入2万U/mL高温α-淀粉酶，添加量为3.5mL，保温40min得到醪液；然后将醪液温度降至55℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为1.0g，保温40min，制得糖化液；在所制备的糖化液中添加1.0％(w/v)的蛋白胨和1.0％(w/v)酵母粉，121℃灭菌15min，冷却至37℃后，按照8％(v/v)的接种量接入一级种子液，调整通气量为0.3vvm，搅拌速度为180r/min，40℃保压发酵36h，活菌数达到108cfu/mL。
2、酒醪制备
取6个500kg大缸，各取粉碎只四到六瓣的高粱100kg加水50kg润料10-18h。利用蒸汽将高粱蒸熟，加入300kg水搅拌后冷却至30℃，然后搬入大曲60kg，搅拌均匀。酒精发酵过程中，定期搅拌，温度控制在30℃左右，约发酵9～15d结束。
3、加料制醅
添加枯草芽孢杆菌HSCY 3011组：酒精发酵结束后，选取3个大缸，每个缸中加入本发明菌株HSCY 3011的二级种子发酵液，添加量为酒醪质量的8.0％，然后加入麸皮200kg，谷糠160kg，将酒醪和谷物混合均匀。按照传统山西老陈醋酿造工艺进行发酵、熏醅、淋醋、陈酿。
对照组2：剩余3个大缸，以蒸馏水替代菌株HSCY 3011的二级种子发酵液，按照与上述添加枯草芽孢杆菌HSCY 3011组相同的添加量和添加方式进行操作。
4、总酸、不挥发酸、还原糖、川芎嗪含量
表6成品醋中总酸、不挥发酸、还原糖和川芎嗪含量对比
与对照组2相比，使用本发明菌株的实施例3，成品醋中总酸含量提高7.01％，不挥发酸含量提高23.79％，还原糖含量提高33.18％，川芎嗪含量提高206.24％，产品出率提高8.12％。
5、有机酸含量
采用HPLC对成品醋中9种有机酸含量进行分析，结果如表7所示。发酵结束后，醋卤中的有机酸主要以乙酸与乳酸为主，二者在实施例3中的含量分别为38.46mg/mL和10.39mg/mL，相比于对照组1分别提高了10.77％和15.57％。
表7枯草芽孢杆菌HSCY3011在镇江香醋酿造中的有机酸含量(mg/mL)
| 组别 | 酒石酸 | 草酸 | 丙酮酸 | 甲酸 | 乳酸 | 乙酸 | 柠檬酸 | 焦谷氨酸 | 琥珀酸 |
| 实施例3 | 1.95 | 0.98 | 0.86 | 1.97 | 10.39 | 38.46 | 0.51 | 1.85 | 3.13 |
| 对照组2 | 1.45 | 1.01 | 0.79 | 1.84 | 8.99 | 34.72 | 0.49 | 1.92 | 2.52 |
6、淀粉含量
淀粉按照GB 5009.9-2016中，采用酶水解法进行测定。取发酵起始及发酵结束当天的醋醅检测淀粉含量，结果如表8所示。相比于对照组2，实施例3的淀粉利用率提高了18.91％，由此可见，在醋酸发酵阶段添加枯草芽孢杆菌，显著提高了原料的淀粉利用率，减少了浪费。
表8枯草芽孢杆菌HSCY 3011在山西老陈醋酿造中的淀粉利用率
7、氨基酸含量
采用HPLC方法对成品醋中17种氨基酸含量进行了分析，结果如下表9所示。发酵结束时，实施例3氨基酸的总含量达到2197.80mg/100mL，相比对照组2的834.82mg/100mL提高了163.27％，实施例3中甜味氨基酸占比高达65.67％，相比对照组2提高了77.98％，苦味氨基酸占比相比对照组2下降了61.63％。同样也说明该发明所用的枯草芽孢杆菌HSCY 3011有利于甜味氨基酸的增加，相从而增加食醋的甜味，降低其苦味。
表9枯草芽孢杆菌HSCY 3011在山西老陈醋酿造中的氨基酸含量
8、成品醋感官指标分析
选取30名富有经验的香醋感官评价人员，对实施例3与对照组2的产品进行感官评价分析，结果见表10。通过三点检验，发现在30名评价员中有26名评价员表示实施例3和对照组2产品之间的差异显著；通过描述性分析，实施例3产品色泽更红亮，体态更澄清，香气更醇厚，滋味更加柔和，刺激性更低；通过喜好性综合打分评价，实施例3的产品在色泽、体态、香气和滋味方面的得分明显高于对照组2，说明在醋酸发酵阶段添加枯草芽孢杆菌，显著提高了产品品质。
表10枯草芽孢杆菌HSCY 3011在山西老陈醋酿造中的成品醋感官指标分析
| 组别 | 色泽(10分) | 体态(10分) | 香气(10分) | 滋味(10分) |
| 实施例3 | 9.5 | 8.7 | 9.4 | 9.7 |
| 对照组2 | 8.2 | 7.4 | 7.2 | 6.8 |
实施例4枯草芽孢杆菌HSCY3011在液态米醋酿造中的应用
1、枯草芽孢杆菌菌剂制备
将枯草芽孢杆菌按照5％的接种量接种到LB培养基中，温度40℃，转速180r/min培养40h，离心收集菌体，将无菌保护剂与菌体均匀混合放置在45℃的培养箱中热激8s，再利用真空冷冻干燥制得菌剂，枯草芽孢杆菌的活菌数约为108cfu/g菌剂，阴凉干燥条件下贮存期为1年。
无菌保护剂的制备：上述的保护剂制备方法为：A：脱脂奶粉10g，蒸馏水100mL，115℃灭菌15min；B：甘油0.5g、乳糖3g、甘露醇4g、海藻糖5g、蒸馏水100mL，121℃灭菌15min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。
真空冷冻干燥工艺参数：冷阱温度为-40℃，板的温度为25℃，真空度初始为30Pa，终止为40Pa。
2、接种发酵
选取2个500L发酵罐设为实施例4和对照组3，分别加入100L酒精度为9～10％vol的米酒，按照12％的接种量接入购自CICC、菌株保藏编号为CICC 20761的醋酸菌，温度为30℃，调整通气量为0.30vvm，搅拌速度为220r/min进行醋酸发酵。待酒精度降至5％vol以下时，实施例4发酵罐中加入4g活化好的枯草芽孢杆菌，对照组3发酵罐中不添加，继续进行醋酸发酵。其中活化方法为：1g菌剂溶解到10mL无菌水中，35℃活化30min后备用。
3、总酸和乳酸含量的检测
发酵结束后分别对酿造的米醋中总酸和乳酸含量进行检测，如表11所示。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。乳酸采用高效液相色谱法，参照《GB/T18623-2011地理标志产品镇江香醋》附录B中方法。
表11枯草芽孢杆菌HSCY 3011在米醋酿造中总酸、乳酸产量
| 组别 | 总酸(g/100mL) | 乳酸(g/100mL) |
| 实施例4 | 9.56±0.09 | 0.21±0.01 |
| 对照组3 | 9.14±0.08 | 0.17±0.01 |
4、氨基酸含量
采用HPLC方法对成品醋中17种氨基酸含量进行了分析，结果如下表12所示。发酵结束时，实施例3氨基酸的总含量达到902.78mg/100mL，相比对照组2的393.99mg/100mL提高了129.14％，实施例3中甜味氨基酸占比高达63.95％，相比对照组2提高了63.59％，苦味氨基酸占比相比对照组2下降了55.91％。同样也说明该发明所用的枯草芽孢杆菌HSCY3011有利于甜味氨基酸的增加，相从而增加食醋的甜味，降低其苦味。
表12枯草芽孢杆菌HSCY 3011在米醋酿造中的氨基酸含量
8、成品醋感官指标分析
选取30名富有经验的香醋感官评价人员，对实施例4与对照组3的产品进行感官评价分析，结果见表13。通过三点检验，发现在30名评价员中有26名评价员表示实施例4和对照组3产品之间的差异显著；通过描述性分析，实施例4产品色泽更红亮，体态更澄清，香气更醇厚，滋味更加柔和，刺激性更低；通过喜好性综合打分评价，实施例4的产品在色泽、体态、香气和滋味方面的得分明显高于对照组3，说明在醋酸发酵阶段添加枯草芽孢杆菌，显著提高了产品品质。
表13枯草芽孢杆菌HSCY 3011在米醋酿造中的成品醋感官指标分析
| 组别 | 色泽(10分) | 体态(10分) | 香气(10分) | 滋味(10分) |
| 实施例4 | 9.5 | 8.7 | 9.4 | 9.7 |
| 对照组3 | 8.2 | 7.4 | 7.2 | 6.8 |
对照组4：
在实施例2的基础上，与实施例2不同的是，枯草芽孢杆菌为市售，产品来源为CGMCC，菌株保藏编号为CGMCC1.14985，对使用该枯草芽孢杆菌酿造的成品醋分别检测以下性质，如表14～18所示。
表14对照组4的成品醋中总酸、不挥发酸、还原糖和川芎嗪含量
表15对照组4的枯草芽孢杆菌在镇江香醋酿造中的有机酸含量(mg/mL)
表16对照组4的枯草芽孢杆菌在镇江香醋酿造中的淀粉利用率
表17对照组4的枯草芽孢杆菌在镇江香醋酿造中的氨基酸含量
表18对照组4的枯草芽孢杆菌在镇江香醋酿造中的成品醋感官指标分析
| 组别 | 色泽(10分) | 体态(10分) | 香气(10分) | 滋味(10分) |
| 对照组4 | 8.6 | 8.1 | 7.5 | 7.7 |
由表15～18的数据可以看出，使用市售的枯草芽孢杆菌，通过镇江香醋酿造工艺酿造的成品醋，在淀粉利用率、不挥发酸、还原糖、川芎嗪含量、有机酸、氨基酸含量、甜味氨基酸占比、成品醋感官指标等方面均明显低于实施例2，说明本发明的枯草芽孢杆菌应用在食醋酿造领域，能够显著提高产品中氨基酸、不挥发酸、还原糖、川芎嗪等含量，从而提高产品的整体风味品质。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (8)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌命名为HSCY 3011，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为CGMCC NO.25011，保藏日期为2022年06月06日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌、权利要求2所述的微生物菌剂在食醋酿造中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食醋为香醋、陈醋或米醋。
5.一种食醋的酿造方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制备菌株种子液或制备微生物菌剂；
(2)接种步骤(1)得到的菌株种子液或微生物菌剂进行发酵。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当制备香醋或陈醋时，分别接入接种量为酒醪重量1-15％(v/v)的枯草芽孢杆菌的种子液，接入接种量为酒醪重量1-10％(v/v)的醋酸菌，进行醋酸发酵。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当制备米醋时，将枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中培养，离心收集菌体，将无菌保护剂与菌体混合，利用真空冷冻干燥制得菌剂，按照1～15％的接种量接入醋酸菌，加入活化的枯草芽孢杆菌，进行醋酸发酵。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，枯草芽孢杆菌按照1-15％的接种量接种到LB培养基中；无菌保护剂与菌体均匀混合后放置在40～45℃的培养箱中热激处理。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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