CN116574633A - 一株产酯香芽孢杆菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种地衣芽孢杆菌菌株HSCY3018，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM20221831，保藏日期为2022年11月28日。本发明还提供了HSCY3018菌株及其微生物菌剂在食醋酿造中的应用。HSCY3018在食醋酿造中具有高产淀粉酶和蛋白酶活性，可明显提高食醋酿造的原料利用率，淀粉利用率相比对照组提高58.50％，有机酸中的乳酸含量提高72.95％，氨基酸总量提高66.18％，还原糖含量提高43.96％，总酯含量提高275.74％。
Description
技术领域
本发明涉及传统食醋酿造领域，具体涉及一株耐受性强、能产生丰富酶系及营养物质，从而显著提升食醋感官品质的地衣芽孢杆菌，还涉及所述地衣芽孢杆菌及其微生物菌剂在食醋酿造中的应用。
背景技术
传统酿造食醋主要以糯米、高粱等淀粉质原料为主要原料，以麸皮和稻壳为辅料，经过多菌种混合发酵酿制而成。目前在食醋酿造过程中，存在酿造原料的原料利用率较低，成品醋的香气较单薄、口感较刺激等问题，从而影响产品的价值。
目前，工业生产中多采用粉碎原料、醋渣二次发酵、高温浇淋熏醅、添加复合酶制剂、调味和增味等方法来提高食醋酿造中原料的利用率及增强风味，虽然风味有所改善，但生产成本明显提高，不利于生产上的广泛应用。
随着生活水平的提高，消费者对高品质食醋的需求也越来越迫切，酿造高品质、风味独特的食醋对我国食醋行业来说已经迫在眉睫，整个行业急需转型升级。
芽孢杆菌是一类耐受性较强的细菌，生长速度快，安全性较高，部分菌株对乙酸、高温具有较强的抵抗力。因此，筛选出适合食醋特殊酿造环境的具有优良抗逆性的地衣芽孢杆菌，再将其应用于食醋的生产过程中，对稳定并提高产品品质具有重要的意义。目前虽然有醋醅中分离得到地衣芽孢杆菌的相关报道，但将地衣芽孢杆菌利用于食醋产丰富有机酸、氨基酸、还原糖、酯香物质和提升风味口感方面的研究尚无。因此，通过创新分离和培养方法、依托能良好适应食醋酿造恶劣环境的新型地衣芽孢杆菌菌种提高传统食醋的整体风味品质，具有良好的应用前景。
发明内容
为解决上述技术问题，本法明第一方面提供了一种地衣芽孢杆菌，命名为HSCY3018，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20221831，保藏日期为2022年11月28日。
本发明第二方面提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包含本发明第一方面所述的地衣芽孢杆菌。
在某些实施方式中，所述微生物菌剂的制备包括将本发明第一方面所述的菌株与无菌保护剂混合后进行热激，再利用真空冷冻干燥。
在某些实施方式中，所述热激为在35-45℃的培养箱中热激5-25s。优选地，所述热激为在40℃的培养箱中热激10s。
在某些实施方式中，所述无菌保护剂保护组分A和组分B。优选地，所述组分A的制备方法为：脱脂奶粉10g，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min；所述组分A的制备方法为甘油0.5g、乳糖3g、甘露醇4g、海藻糖5g、蒸馏水100mL，121℃灭菌20min。
在某些实施方式中，组分A，组分B分别灭菌后，冷却至室温混合即得无菌保护剂。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的地衣芽孢杆菌、本发明第二方面所述的微生物菌剂在食醋酿造中的应用。
在某些实施方式中，所述食醋为香醋、陈醋或米醋。
本发明第三方面提供了一种食醋的酿造方法，包括以下步骤：(1)采用本发明第一方面所述的地衣芽孢杆菌制备菌株种子液或制备微生物菌剂；(2)接种步骤(1)得到的菌株种子液或微生物菌剂进行发酵。
在某些实施方式中，所述食醋为香醋、陈醋或米醋。
在某些实施方式中，所述微生物菌剂的制备包括将地衣芽孢杆菌菌株与无菌保护剂混合后进行热激，再利用真空冷冻干燥。
在某些实施方式中，所述热激为在35-45℃的培养箱中热激5-25s。优选地，所述热激为在40℃的培养箱中热激10s。
在某些实施方式中，所述无菌保护剂保护组分A和组分B。优选地，所述组分A的制备方法为：脱脂奶粉10g，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min；所述组分A的制备方法为甘油0.5g、乳糖3g、甘露醇4g、海藻糖5g、蒸馏水100mL，121℃灭菌20min。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明从镇江香醋生产工艺过程的醋醅中分离筛选得到一株地衣芽孢杆菌HSCY 3018，应用在食品领域，具有较高的淀粉酶和蛋白酶活性，可提高原料的淀粉和蛋白利用率。该菌株淀粉酶活性可达到843.95U/mL发酵液，蛋白酶活性可达到256.18U/mg发酵液。
(2)只采用单一的本发明的菌株应用于传统固态食醋酿造中，即可显著提升产品中有机酸、氨基酸、还原糖、总酯等含量，具有显著提高产品的整体风味和口感品质，提高产品出率的有益效果。
(3)通过该菌株在镇江香醋酿造中的使用，可使成品醋中有机酸中的乳酸含量相比对照组提高72.95％，氨基酸总量提高66.18％，还原糖含量提高43.96％，总酯含量提高275.74％，产品出率提高12.96％，显著改善了产品的滋味和香气，整体感官品质较高。
(4)该菌株应用在食醋酿造中，使食醋营养价值更高，口感醇厚、柔和、不刺激，酯香浓郁，感官品质明显优于对照组，可满足消费者的养生和高品质需求，市场适应性更强。
(5)该菌株还可以制作成微生物菌剂，菌株可以制作成菌液或微生物菌剂进行食醋酿造，提高风味、口感及产品品质。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：
图1地衣芽孢杆菌HSCY 3018菌落形态。
具体实施方式
下面申请人将结合具体的实施例对本发明产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但应该理解，以下实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。
本发明实施例中LB培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。
LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，磷酸氢二钠0.5g，琼脂20.0g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。
产蛋白酶筛选培养基：牛肉膏5.0g，干酪素30.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH值自然，121℃灭菌20min。
产淀粉酶筛选培养基：蛋白胨10.0g，尿素15.0g，酵母浸粉5.0g，麦芽糖150.0g，玉米淀粉20.0g，葡萄糖1.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁5.0g，硫酸锰4.0g，吐温80 1.0mL，氯化钠0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。
高温α-淀粉酶、糖化酶：购自山东隆科特酶制剂有限公司。
实施例1地衣芽孢杆菌HSCY3018的分离与鉴定
(1)菌株分离
称取镇江香醋醋醅样品15g，置于85mL已灭菌的LB培养基中，温度37℃、转速180r/min，振荡培养20min后，90℃水浴加热10min，对样品进行10倍梯度稀释，选取稀释梯度为10-3、10-4、10-5和10-6的稀释液，分别吸取100μL涂布LB固体培养基平板，37℃倒置培养24h。
(2)菌株纯化
挑取单个菌落革兰氏染色、镜检，对革兰氏阳性、呈杆状的细菌平板划线分离3次，取单菌落保存。
(3)菌株筛选
将纯化好的待测菌株用点接法接种到产蛋白酶筛选培养基，37℃培养24h后，选取菌落数30-300的平板，从中挑取生长良好、有明显透明圈的菌落，即产蛋白酶菌株。测量透明圈直径和菌落直径之比(H/d)，选择比值大于4.0的16株菌株，即具有较强产蛋白酶能力的菌株。再将初筛得到的16株菌株转接到淀粉酶筛选培养基上，40℃培养36h后，在平板上滴加5mL碘液，均匀覆盖平板，按照前面方法选择透明圈最大的那株菌株，即可得到1株既高产蛋白酶又高产淀粉酶的菌株。其菌落形态为：表面略湿润，菌落呈不规则形状、淡黄色、不透明、中间凸起，边缘有褶皱，如图1所示。
(4)菌株鉴定
对纯化筛选得到的细菌，取指数生长期的新鲜菌液，离心收集菌体，采用基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物P0-P6(中国硕士学位论文全文数据库，朱其瀚，“镇江香醋发酵过程中微生物分离及其产酸特性”，2008年)扩增其16S rDNA全长序列。PCR扩增产物的测序由上海生工生物技术公司完成。将测得的16S rDNA序列，在NCBI数据库中进行BLAST比对确定其种属，该菌株16S rDNA全长序列为1468bp，与其具有最高同源性的菌株为Bacillus licheniformis，相似度为99.86％，16S rDNA序列见SEQ ID NO：1。结合其特征，将本发明菌株命名为地衣芽孢杆菌HSCY3018。
(5)菌株产蛋白酶能力测定
采用福林-酚比色法测定蛋白酶酶活发现，该菌株蛋白酶活性可达到256.18U/mg发酵液。同时作为对照，使用相同的方法检测公开号为CN111718871A的专利中地衣芽孢杆菌的蛋白酶活性，检测结果为34.61U/mg。
(5)菌株产淀粉酶能力测定
采用3，5-二硝基水杨酸法(3，5-dinitrosalicylic acid，DNS)测定发现，该菌株淀粉酶活性可达到843.95U/mL发酵液。同时作为对照，游勇等人从特香型白酒大曲分离的一株耐热产淀粉酶地衣芽孢杆菌(游勇等，“特香型白酒大曲中一株耐热产淀粉酶地衣芽孢杆菌的分离和鉴定”，酿酒科技，2022年第3期)的淀粉酶活为53.42U/mg。
地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis HSCY 3018，于2022年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏登记入册的编号为CCTCC M 20221831。
实施例2HSCY3018在镇江香醋酿造中的应用
1、菌株的扩大培养
一级种子液的制备：按照4％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的地衣芽孢杆菌HSCY 3018菌液接种到LB培养基中，温度37℃，转速200r/min培养24h。
二级种子液的制备：选用50L液态自吸式发酵罐，加水35L，搅拌速度为120r/min，将水加热到90℃，加入经粉碎并过100目筛得到的玉米淀粉10kg，加入2万U/mL高温α-淀粉酶，添加量为3.0mL，保温35min得到醪液；然后将醪液温度降至45℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为0.50g，保温30min，制得糖化液；在所制备的糖化液中添加1.0％(w/v)的蛋白胨和1.0％(w/v)酵母浸膏，121℃灭菌20min；冷却至37℃后，按照4.0％的接种量接入一级种子液，调整通气量为0.15vvm，搅拌速度为150r/min，37℃保压发酵24h，活菌数达到1010cfu/mL。
2、酒醪制备
取6个500kg大缸，各取80kg优质糯米加水浸泡过夜。利用蒸汽将糯米蒸熟，以冷水淋饭至温度约40℃加入酒药0.4kg，拌匀后入缸搭窝成喇叭状。待窝中有一定的酒液出现时，每缸加入麦曲5.0kg，然后加水250kg，搅拌均匀。酒精发酵过程中，定期搅拌，温度控制在30℃左右，发酵7天结束。发酵结束后，将6个大缸中酒醪混合均匀，备用。
3、分组加料制醅
添加地衣芽孢杆菌HSCY 3018组：取3个500kg大缸，每个缸中加入上述酒醪200kg，然后加入本发明菌株HSCY 3018的二级种子发酵液，添加量为酒醪质量的3.0％，加入麸皮76kg，大糠35kg，将酒醪和谷物混合均匀，接种原料总重量5.0％的种醅(发酵至第7天的醋醅)，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。
对照组1：选取3个大缸，以蒸馏水替代菌株HSCY 3018的二级种子发酵液，按照与上述添加地衣芽孢杆菌HSCY 3018组相同的添加量和添加方式进行操作。
4、发酵、封醅
按照传统镇江香醋的“固态分层发酵技艺”逐层进行翻醅，待醋醅发酵至醅卤总酸不再增加时将封醅压实，加盐封醅7～10天。封醅结束后，将醋醅加入淋醋缸，然后加入炒米色进行淋醋。对照组1步骤与实施例2保持一致。
5、成品制备
封醅结束后，将醋醅加入淋醋缸，然后加入6.0％炒米色进行淋醋。经煎醋、陈酿、杀菌灌装，即得成品。
6、总酸、还原糖和总酯含量检测
对步骤5所制得的成品醋进行检测。总酸的含量参照《GB 18187-2000》方法进行测定，总酸以乙酸计；还原糖的含量参照《GB 5009.7-2016》方法进行测定，还原糖以葡萄糖计；总酯的含量参照《GB/T 19777-2013》方法进行测定，总酯以乙酸乙酯计。
表1成品醋中总酸、还原糖和总酯含量对比
与对照组1相比，使用本发明菌株的实施例2，成品醋中总酸含量提高13.89％，还原糖含量提高43.96％，总酯含量提高275.74％，产品出率提高12.96％。总酯含量显著提高，说明该发明所用的地衣芽孢杆菌HSCY 3018有利于酯类物质的生成，使得所制得的食醋酯香浓郁，风味独特。
7、有机酸含量检测
采用HPLC对成品醋中9种有机酸含量进行分析，结果如表2所示。发酵结束后，醋卤中的有机酸主要以乙酸与乳酸为主，二者在实施例2中的含量分别为52.08mg/mL和22.12mg/mL，相比于对照组1分别提高了13.66％和72.95％。有机酸含量增加，使食醋入口更柔和，回味绵长。说明该发明所用的地衣芽孢杆菌HSCY 3018可代谢产生较丰富的有机酸，一方面能缓冲乙酸带来的强烈刺激性酸味，另一方面可以与醇类物质酯化生成酯类物质，可丰富食醋的风味与口感，提高产品品质。
表2地衣芽孢杆菌HSCY3018在镇江香醋酿造中的有机酸含量
8、淀粉含量检测
淀粉按照GB 5009.9-2016中，采用酶水解法进行测定。取发酵起始及发酵结束当天的醋醅检测淀粉含量，结果如表3所示。相比于对照组1，实施例2的淀粉利用率提高了58.50％，由此可见，在醋酸发酵阶段添加地衣芽孢杆菌，显著提高了原料的淀粉利用率，减少了浪费。
表3地衣芽孢杆菌HSCY3018在镇江香醋酿造中的淀粉利用率
9、氨基酸含量检测
采用HPLC方法对成品醋中17种氨基酸含量进行了分析，结果如下表4所示。发酵结束时，实施例2氨基酸的总含量达到1639.07mg/100mL，相比对照组1的986.33mg/100mL提高了66.18％。说明该发明所用的地衣芽孢杆菌HSCY3018可提供丰富的蛋白酶，从而提高原料中的蛋白质利用效率，分解所形成的的小分子氨基酸更有利于丰富口感，使所酿造的镇江香醋口感更醇厚。实施例2中各类氨基酸的含量也普遍高于对照组1中氨基酸的含量。
表4地衣芽孢杆菌HSCY 3018在镇江香醋酿造中的氨基酸含量
10、成品醋感官指标分析
选取30名富有经验的香醋感官评价人员，对实施例2与对照组1的产品进行感官评价分析，结果见表5。通过三点检验，发现在30名评价员中有28名评价员表示实施例2和对照组1产品之间的差异显著；通过描述性分析，实施例2产品色泽更红亮，体态更澄清，酯香更浓郁，滋味更加柔和，刺激性更低；通过喜好性综合打分评价，实施例2的产品在色泽、体态、香气和滋味方面的得分明显高于对照组1，说明在醋酸发酵阶段添加地衣芽孢杆菌，显著改善了产品风味和口感，从而提高了产品感官品质。
表5地衣芽孢杆菌HSCY 3018在镇江香醋酿造中的成品醋感官指标分析
| 组别 | 色泽(10分) | 体态(10分) | 香气(10分) | 滋味(10分) |
| 实施例2 | 9.3 | 9.2 | 9.8 | 9.8 |
| 对照组1 | 8.2 | 7.1 | 6.7 | 7.1 |
实施例3地衣芽孢杆菌HSCY 3018在山西老陈醋中的应用
1、菌株的扩大培养
一级种子液的制备：按照6％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的地衣芽孢杆菌HSCY 3018菌液接种到LB培养基中，温度40℃，转速180r/min培养24h。
二级种子液的制备：选用50L液态自吸式发酵罐，加水35L，搅拌速度为140r/min，将水加热到95℃，加入经粉碎并过100目筛得到的玉米淀粉12kg，加入2万U/mL高温α-淀粉酶，添加量为3.5mL，保温40min得到醪液；然后将醪液温度降至55℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为1.5g，保温40min，制得糖化液；在所制备的糖化液中添加3.0％(w/v)的蛋白胨和3.0％(w/v)酵母浸膏，121℃灭菌15min，冷却至37℃后，按照6％(v/v)的接种量接入一级种子液，调整通气量为0.3vvm，搅拌速度为120r/min，40℃保压发酵30h，活菌数达到1010cfu/mL。
2、酒醪制备
取6个500kg大缸，各取粉碎至四到六瓣的高粱100kg加水50kg润料15h。利用蒸汽将高粱蒸熟，加入200kg水搅拌后冷却至30℃，然后加入62kg大曲和0.1kg活性干酵母，搅拌均匀。酒精发酵过程中，定期搅拌，温度控制在30℃左右，发酵13天结束。
3、加料制醅
添加地衣芽孢杆菌HSCY 3018组：酒精发酵结束后，选取3个大缸，每个缸中加入酒醪150kg，麸皮60kg，大糠75kg，接入酒醪重量的6.0％的上述地衣芽孢杆菌HSCY 3018的二级种子发酵液，将菌液与所投原料一起充分拌匀后，接种原料总重量10％的火醅(2-3天发酵旺盛的醋醅)，再按照山西老陈醋的固态发酵工艺进行发酵、熏醅、淋醋、陈酿。
对照组2：剩余3个大缸，以蒸馏水替代菌株HSCY 3018的二级种子发酵液，按照与上述添加地衣芽孢杆菌HSCY 3018组相同的添加量和添加方式进行操作。
4、总酸、还原糖、总酯含量
表6成品醋中总酸、还原糖和总酯含量对比
与对照组2相比，使用本发明菌株的实施例3，成品醋中总酸含量提高12.70％，还原糖含量提高32.55％，总酯含量提高224.81％，产品出率提高11.02％。还原糖和总酯含量均显著提高，同样也说明该发明所用的地衣芽孢杆菌HSCY3018有利于酯类物质的生成，使得所制得的食醋酯香浓郁，口感柔和、不刺激。
5、有机酸含量
采用HPLC对成品醋中9种有机酸含量进行分析，结果如表7所示。发酵结束后，醋卤中的有机酸主要以乙酸与乳酸为主，二者在实施例3中的含量分别为39.06mg/mL和15.93mg/mL，相比于对照组1分别提高了13.66％和41.50％。同样也说明该发明所用的地衣芽孢杆菌HSCY 3018可代谢产生较丰富的有机酸，降低酿造食醋入口的刺激感。
表7地衣芽孢杆菌HSCY3018在山西老陈醋酿造中的有机酸含量
6、淀粉含量
淀粉按照GB 5009.9-2016中，采用酶水解法进行测定。取发酵起始及发酵结束当天的醋醅检测淀粉含量，结果如表8所示。相比于对照组2，实施例3的淀粉利用率提高了46.14％，由此可见，在醋酸发酵阶段添加地衣芽孢杆菌，显著提高了原料的淀粉利用率，减少了浪费。
表8地衣芽孢杆菌HSCY 3018在山西老陈醋酿造中的淀粉利用率
7、氨基酸含量
采用HPLC方法对成品醋中17种氨基酸含量进行了分析，结果如下表9所示。发酵结束时，实施例3氨基酸的总含量为1106.50mg/100mL，相比对照组2的711.43mg/100mL提高了55.53％。
表9地衣芽孢杆菌HSCY3018在山西老陈醋酿造中的氨基酸含量
8、成品醋感官指标分析
选取30名富有经验的香醋感官评价人员，对实施例3与对照组2的产品进行感官评价分析，结果见表10。通过三点检验，发现在30名评价员中有27名评价员表示实施例3和对照组2产品之间的差异显著；通过描述性分析，实施例3产品色泽更红亮，体态更澄清，酯香更浓郁，滋味更加柔和，刺激性更低，综合口感更醇厚；通过喜好性综合打分评价，实施例3的产品在色泽、体态、香气和滋味方面的得分明显高于对照组2，说明在醋酸发酵阶段添加地衣芽孢杆菌，显著提高了产品品质。
表10地衣芽孢杆菌HSCY 3018在山西老陈醋酿造中的成品醋感官指标分析
| 组别 | 色泽(10分) | 体态(10分) | 香气(10分) | 滋味(10分) |
| 实施例3 | 9.3 | 8.9 | 9.7 | 9.6 |
| 对照组2 | 8.5 | 6.8 | 7.6 | 7.1 |
实施例4地衣芽孢杆菌HSCY3018在液态米醋酿造中的应用
1、地衣芽孢杆菌菌剂制备
将地衣芽孢杆菌按照5％的接种量接种到LB培养基中，温度37℃，转速180r/min培养36h，离心收集菌体，将无菌保护剂与菌体均匀混合放置在40℃的培养箱中热激10s，再利用真空冷冻干燥制得菌剂，地衣芽孢杆菌的活菌数约为1010cfu/g菌剂，阴凉干燥条件下贮存期为1年。
无菌保护剂的制备：上述的保护剂制备方法为：A：脱脂奶粉10g，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min；B：甘油0.5g、乳糖3g、甘露醇4g、海藻糖5g、蒸馏水100mL，121℃灭菌20min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。
真空冷冻干燥工艺参数：冷阱温度为-45℃，板的温度为28℃，真空度初始为30Pa，终止为45Pa。
2、接种发酵
选取2个500L发酵罐设为实施例4和对照组3，分别加入100L酒精度为9～10％vol的米酒，按照10％的接种量接入购自CGMCC、菌株保藏编号为CGMCC1.2269的巴氏醋杆菌，温度为30℃，调整通气量为0.30vvm，搅拌速度为200r/min进行醋酸发酵。待酒精度降至5％vol以下时，实施例4发酵罐中加入3g活化好的地衣芽孢杆菌，对照组3发酵罐中不添加，继续进行醋酸发酵。其中活化方法为：1g菌剂溶解到10mL无菌水中，37℃活化30min后备用。
3、总酸、总酯和乳酸含量的检测
发酵结束后分别对酿造的米醋中总酸、总酯和乳酸含量进行检测，如表11所示。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。总酯以乙酸乙酯计，总酯的含量参照《GB/T 19777-2013》方法进行测定。乳酸采用高效液相色谱法，参照《GB/T18623-2011地理标志产品镇江香醋》附录B中方法。
表11地衣芽孢杆菌HSCY 3018在米醋酿造中总酸、总酯和乳酸含量
| 组别 | 总酸(g/100mL) | 总酯(g/100mL) | 乳酸(g/100mL) |
| 实施例4 | 9.83±0.07 | 2.56±0.03 | 0.27±0.01 |
| 对照组3 | 9.20±0.05 | 0.35±0.01 | 0.19±0.01 |
4、氨基酸含量
采用HPLC方法对成品醋中17种氨基酸含量进行了分析，结果如下表12所示。发酵结束时，实施例3氨基酸的总含量为736.47mg/100mL，相比对照组3的501.17mg/100mL提高了46.95％。
表12地衣芽孢杆菌HSCY3018在米醋酿造中的氨基酸含量
8、成品醋感官指标分析
选取30名富有经验的香醋感官评价人员，对实施例4与对照组3的产品进行感官评价分析，结果见表13。通过三点检验，发现在30名评价员中有26名评价员表示实施例4和对照组3产品之间的差异显著；通过描述性分析，实施例4产品色泽更透亮，体态更澄清，酯香更浓郁，滋味更加柔和，刺激性更低；通过喜好性综合打分评价，实施例4的产品在色泽、体态、香气和滋味方面的得分明显高于对照组3，说明在醋酸发酵阶段添加地衣芽孢杆菌，显著提高了产品品质。
表13地衣芽孢杆菌HSCY 3018在米醋酿造中的成品醋感官指标分析
| 组别 | 色泽(10分) | 体态(10分) | 香气(10分) | 滋味(10分) |
| 实施例4 | 9.6 | 8.9 | 9.5 | 9.4 |
| 对照组3 | 7.7 | 7.3 | 6.8 | 6.5 |
对照组4：
在实施例2的基础上，与实施例2不同的是，地衣芽孢杆菌为市售，产品来源为CICC，菌株保藏编号为CICC 10037，对使用该地衣芽孢杆菌酿造的成品醋分别检测以下性质，如表14～18所示。
表14对照组4的成品醋中总酸、还原糖和总酯含量
表15对照组4的地衣芽孢杆菌在镇江香醋酿造中的有机酸含量
表16对照组4的地衣芽孢杆菌在镇江香醋酿造中的淀粉利用率
表17对照组4的地衣芽孢杆菌在镇江香醋酿造中的氨基酸含量
表18对照组4的地衣芽孢杆菌在镇江香醋酿造中的成品醋感官指标分析
| 组别 | 色泽(10分) | 体态(10分) | 香气(10分) | 滋味(10分) |
| 对照组4 | 8.2 | 7.9 | 6.9 | 6.4 |
由表15～18的数据可以看出，使用市售的地衣芽孢杆菌，通过镇江香醋酿造工艺酿造的成品醋，在淀粉利用率、还原糖、总酯、有机酸、氨基酸含量、成品醋感官指标等方面均明显低于实施例2，说明本发明的地衣芽孢杆菌应用在食醋酿造领域，能够显著提高原料利用率，还可以产生丰富的有机酸、氨基酸、还原糖以提高食醋滋味的柔和性，同时又能提高具有良好香气的酯类物质，最终所发酵的醋营养价值高，口感柔和，酸甜适口，酯香浓郁，解决了目前市面上纯酿造食醋口感较刺激、香气较单薄的问题，可满足消费者的养生和高品质需求，市场适应性更强。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (9)
1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌命名为HSCY 3018，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M20221831，保藏日期为2022年11月28日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含权利要求1所述的地衣芽孢杆菌。
3.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌、权利要求2所述的微生物菌剂在食醋酿造中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食醋为香醋、陈醋或米醋。
5.一种食醋的酿造方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用权利要求1所述的地衣芽孢杆菌制备菌株种子液或制备微生物菌剂；
(2)接种步骤(1)得到的菌株种子液或微生物菌剂进行发酵。
6.根据权利要求5所述的酿造方法，其特征在于，所述食醋为香醋、陈醋或米醋。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述微生物菌剂的制备包括将地衣芽孢杆菌菌株与无菌保护剂混合后进行热激，再利用真空冷冻干燥。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述热激为在40℃的培养箱中热激10s。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述无菌保护剂的制备方法包括：1)组分A的制备：脱脂奶粉10g，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min；组分B：2)组分B的制备：甘油0.5g、乳糖3g、甘露醇4g、海藻糖5g、蒸馏水100mL，121℃灭菌20min；3)组分A，组分B分别灭菌后，冷却至室温混合。
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