CN110408571A - 一株凝结芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株凝结芽孢杆菌及其应用，所述凝结芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年5月13日，保藏编号为CGMCC NO.17801。本发明还公开了一种食醋的酿造方法。该菌株具有耐8％(v/v)乙酸、生长温度范围广(30～55℃)、产乙酸和高产乳酸等特性，不仅能够适应一般微生物难以生长的醋酸发酵的恶劣环境，而且对氧气的要求低，在需氧和厌氧条件下均能生长。通过该菌株的使用，可以改善因季节变化、菌种退化等问题引起的不挥发酸含量降低问题，可明显提高食醋中不挥发酸的含量，改善产品风味，提高产品品质，并可一定程度上提高产品出率。
Description
技术领域
本发明涉及一株凝结芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一株适用于食醋酿造的特殊环境并可提高食醋品质的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulansHSCY3073)，属于微生物应用和传统食品酿造领域。
背景技术
有机酸是食醋中的重要成分，其组成非常丰富，它不仅决定了食醋的酸味质量，还是决定成品醋缓冲性和pH的重要物质之一，同时它还影响产品的货架期和生物安全性。尽管食醋中酸含量很高，但并无刺激感，酸味很柔和，这其中有机酸的作用是非常重要的。
由于食醋酿造的特殊环境条件，如使发酵微生物在此过程中能充分发挥作用，需要考虑其环境耐受性。如在醋酸发酵阶段，醋醅pH较低、温度较高，则需要考虑到微生物的耐酸及耐高温能力等。所以微生物的环境耐受能力的高低决定了其能否在食醋酿造中发挥作用。在食醋酿造中优良发酵菌种应具备耐酸和耐高温的特性。
芽孢杆菌是一类耐受性较强的细菌，部分菌株对乙酸、高温具有较强的抵抗力。因此，筛选出适合食醋特殊酿造环境的具有优良抗逆性的芽孢杆菌，再将其应用于食醋的生产过程中，对稳定并提高产品品质具有重要的意义。凝结芽孢杆菌具有芽孢杆菌和乳酸菌的双重优势，经研究发现，其可以利用各种糖类转化成乳酸，具有较高的乳酸生产能力，葡萄糖发酵主要产物为L-乳酸，属同型乳酸发酵，除此之外，还可生成少量的乙酸、乙醇、水解酶、维生素等。另外，凝结芽孢杆菌还具有芽孢杆菌丰富的酶系统及抗逆性强、耐高温、耐酸能力极强的特性。凝结芽孢杆菌虽然具有很高的商业应用价值，但当前工业上对凝结芽孢杆菌的应用还不是很多，其良好的生物学特性尚未得到充分利用。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一株凝结芽孢杆菌。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种微生物菌剂。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种食醋的酿造方法。
为实现上述技术目的，本发明采取如下的技术方案：一株凝结芽孢杆菌，所述凝结芽孢杆菌的分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年5月13日，保藏编号为CGMCCNO.17801。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明内容还包括一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包含所述的凝结芽孢杆菌。
本发明内容还包括所述的凝结芽孢杆菌、所述的微生物菌剂在食品领域中的应用。
本发明内容还包括所述的凝结芽孢杆菌、所述的微生物菌剂在食醋酿造中的应用。
所述食醋为米醋、香醋或苹果醋中的一种。
本发明内容还包括一种食醋的酿造方法，所述食醋的酿造方法包括如下步骤：
1)采用所述的凝结芽孢杆菌的菌株种子液的制备；
2)对菌株种子液进行发酵。
其中，所述步骤1)中的菌株种子液的制备包括一级种子液的制备和二级种子液的制备。
其中，所述一级种子液的制备具体包括以下步骤：按照3％～6％的接种量，将纯化的凝结芽孢杆菌接种到MRS培养基中，40～45℃转速200～220r/min培养20～24h。
其中，所述二级种子液的制备包括以下步骤：选用液态发酵罐，加水搅拌，将水加热到90～95℃，加入米粉和高温α-淀粉酶，保温得到醪液，然后将醪液温度降至45～55℃，加入糖化酶，制得糖化液；在所制备的糖化液中添加蛋白胨和酵母粉，灭菌冷却至35～37℃后，按照3％～6％的接种量接入一级种子液，通气搅拌，37～45℃保压发酵24～36h即得。
其中，所述步骤2)中当制备香醋时，按照镇江香醋酿造工艺进行投料、接种、带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。
其中，所述步骤2)中当制备果醋时，在发酵罐中加入经过调配糖含量为16～18％(w/w)，pH值为4.5～5.0的果汁，接种酵母菌进行酒精发酵；待发酵至酒精度为4～6％vol时加入活菌数108cfu/ml的凝结芽孢杆菌HSCY3073二级种子液，添加量为1～5％(v/v)；待发酵至酒精度约5～7％vol时接入醋酸菌进行醋酸发酵。
其中，所述步骤2)中当制备米醋时，在发酵罐中加入酒精度为6～8％vol的米酒，接种醋酸菌进行醋酸发酵，接种量为8～10％(v/v)，待酒精度降至4～5％vol以下时加入活菌数108cfu/ml的凝结芽孢杆菌HSCY3073二级种子液，添加量为1～5％(v/v)，继续进行醋酸发酵。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：食醋酿造的环境具有酸度高、温度高的特点，很多微生物不具备较好的抗逆性，在此种环境中生长代谢较差甚至不能生存。本发明从镇江香醋生产工艺过程的醋醅中分离筛选得到一株较适合于食醋酿造环境的凝结芽孢杆菌，该菌株具有耐8％(v/v)乙酸、生长温度范围广(30～55℃)、产乙酸和高产乳酸等特性，不仅能够适应一般微生物难以生长的醋酸发酵的恶劣环境，而且对氧气的要求低，在需氧和厌氧条件下均能生长，为食醋酿造提供了新的抗逆性强的宝贵菌种资源，具有很高的应用价值。通过该菌株的使用，可以改善因季节温度变化、菌种退化等问题引起的不挥发酸含量降低问题，可明显提高食醋中不挥发酸的含量，改善产品风味，提高产品品质，并可一定程度上提高产品出率。
附图说明
图1为本发明的菌株HSCY3073的菌落形态。
具体实施方式
下面申请人将结合具体的实施例对本发明产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但应该理解，以下实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。
本发明实施例中MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6。
高温α-淀粉酶、糖化酶：购自山东隆科特酶制剂有限公司。
实施例1菌株HSCY 3073的分离与鉴定
1、菌株的分离
称取镇江香醋醋醅样品10g，置于90ml已灭菌的MRS液体培养基中，温度40℃、转速200r/min，震荡10min，再置于40℃培养箱中富集培养3h，期间每天摇动一次菌液。富集结束后，取2mL菌液，90℃水浴10min，再进行10倍梯度稀释。选取稀释10、100和1000倍3个稀释度的稀释液，分别吸取100μL涂布MRS固体平板，40℃倒置培养24h。
2、菌株纯化
挑取单个菌落革兰氏染色、镜检，对革兰氏阳性、杆状的细菌平板划线分离3次，取单菌落保存。
3、菌株筛选
将保存的菌株分别接种到含有5％vol乙醇的MRS液体培养基中，温度40℃，转速200r/min，培养48h后测定发酵液的pH值，选取pH值低于4.0的菌株，得到一株耐酸、产酸特性较好的菌株HSCY3073，其细胞学特征为：菌体为杆状，菌落呈乳白色，圆形，表明光滑湿润、凸起、边缘整齐。其菌落形态如图1所示。
4、菌株鉴定
纯化筛选得到的细菌，取指数生长期的新鲜菌液，离心收集菌体，采用基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物P0-P6扩增其16S rDNA全长序列。PCR扩增产物的测序由上海生工生物技术公司完成。将测得的16S rDNA序列，在NCBI数据库中进行BLAST比对确定其种属，该菌株16S rDNA全长序列为1413bp，与其具有最高同源性的菌株为Bacillus coagulans，相似度为99％，16S rDNA序列见SEQ ID NO：1。
该菌株于2019年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC NO.17801，其分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans。
5、菌株产酸特性
分离得到的凝结芽孢杆菌HSCY3073菌株在30～55℃均能生长，在有氧和无氧环境中均可生长。40℃有氧发酵24h，经HPLC测得发酵液中的有机酸组成见表1。
表1凝结芽孢杆菌HSCY3073液体发酵24小时有机酸产量
6、菌株耐乙酸特性
将活化的凝结芽孢杆菌HSCY3073菌株按5％的接种量，分别接种到含有2g/100ml，4g/100ml，6g/100ml，8g/100ml乙酸浓度的液体MRS培养基中，设置不添加乙酸组为对照，温度40℃，转速200r/min，分别于12，24小时取样进行活菌计数。
表2凝结芽孢杆菌HSCY3073对乙酸的耐受性(cfu·mL-1)
| 乙酸浓度(g/100ml) | 活菌数(12小时) | 活菌数(24小时) |
| 2.0 | 3.39×10<sup>7</sup> | 3.42×10<sup>7</sup> |
| 4.0 | 3.28×10<sup>7</sup> | 3.05×10<sup>7</sup> |
| 6.0 | 2.87×10<sup>7</sup> | 2.90×10<sup>7</sup> |
| 8.0 | 2.31×10<sup>7</sup> | 2.01×10<sup>7</sup> |
| 对照(0) | 3.42×10<sup>7</sup> | 3.38×10<sup>7</sup> |
7、菌株耐高温特性将活化的凝结芽孢杆菌HSCY3073菌株按5％的接种量，接种到液体MRS培养基中，分别置于40、45、50、55℃的摇床中，转速200r/min，于12，24小时取样进行活菌计数。
表2凝结芽孢杆菌HSCY3073耐高温特性(cfu·mL-1)
| 培养温度(℃) | 活菌数(12小时) | 活菌数(24小时) |
| 40 | 4.19×10<sup>7</sup> | 1.42×10<sup>8</sup> |
| 45 | 5.42×10<sup>7</sup> | 2.89×10<sup>8</sup> |
| 50 | 4.65×10<sup>7</sup> | 1.78×10<sup>8</sup> |
| 55 | 4.82×10<sup>7</sup> | 1.83×10<sup>8</sup> |
实施例2凝结芽孢杆菌HSCY3073在镇江香醋酿造中的应用
1、菌株的扩大培养
一级种子液的制备：按照6％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的凝结芽孢杆菌HSCY3073菌液接种到MRS培养基中，温度40℃，转速200r/min培养20h。
二级种子液的制备：选用50L液态发酵罐，加水35L，搅拌速度为120r/min，将水加热到95℃，加入米粉(大米经过粉碎后，过100目筛得到米粉)8kg，加入2万U/ml高温α-淀粉酶，添加量为3.0ml，保温35min得到醪液。然后将醪液温度降至45℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为0.50g，保温35min，制得糖化液。在所制备的糖化液中添加0.5％(w/v)的蛋白胨和0.5％(w/v)酵母粉，115℃灭菌20min。冷却至35℃后，按照5％(v/v)的接种量接入一级种子液，调整通气量为0.1vvm，搅拌速度为120r/min，37℃保压发酵24h，活菌数达到108cfu/ml。
2、醋醅接种发酵
正常对照组：
选取500kg大缸，加入酒醪120kg，麸皮40.8kg，大糠19.2kg，将所投原料充分拌匀后，接种醋酸菌(购自CICC，菌株保藏编号为CICC 20001)，接种量为酒醪重量的5％，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。
添加凝结芽孢杆菌组：
选取500kg大缸，加入酒醪120kg，麸皮40.8kg，大糠19.2kg，将所投原料充分拌匀后，接种醋酸菌(购自CICC，菌株保藏编号为CICC 20001，接种量为酒醪重量的5％，再以酒醪重量1％的接种量接入凝结芽孢杆菌的二级种子液，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。
3、总酸和乳酸含量的检测
发酵结束后，取底部醋卤进行检测。总酸(以乙酸计)采用酸碱滴定法测定。乳酸采用高效液相色谱法，参照《GB/T 18623-2011地理标志产品镇江香醋》附录B中方法。与对照组相比，试验组的总酸含量提高了7.5％；乳酸含量提高了15.14％，有了明显的提高。本发明的菌株HSCY3073可较好地作为辅助菌种强化菌种应用于固态食醋的生产中，通过该菌株的强化可明显提高食醋中的乳酸含量，提高产品的风味及品质。
表2凝结芽孢杆菌HSCY3073在镇江香醋酿造中总酸、乳酸产量
| 组别 | 总酸(g/100ml) | 乳酸(g/100ml) |
| 试验组 | 7.98 | 2.13 |
| 对照组 | 7.42 | 1.85 |
实施例3凝结芽孢杆菌HSCY3073在苹果醋酿造中的应用
1、菌株的扩大培养
一级种子液的制备：按照5％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的凝结芽孢杆菌HSCY3073菌液接种到MRS培养基中，温度40℃，转速200r/min培养20h。
二级种子液的制备：选用25L液态发酵罐，加水15L，搅拌速度为100r/min，将水加热到90℃，加入米粉(大米经过粉碎后，过100目筛得到米粉)6kg，加入2万U/ml高温α-淀粉酶，添加量为1.5ml，保温35min得到醪液。然后将醪液温度降至55℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为0.25g，保温40min，制得米浆糖化液。在所制备的米浆糖化液中添加0.3％(w/v)的蛋白胨和0.3％(w/v)酵母粉，115℃灭菌20min。冷却至37℃后，按照5％(v/v)的接种量接入一级种子液，调整通气量为0.3vvm，搅拌速度为120r/min，37℃保压发酵36h，活菌数达到108cfu/ml。
2、接种发酵
选取2个500L发酵罐设为试验组和对照组，分别加入200L经过调配，糖含量为16～18％(w/w)，pH值为4.5～5.0的苹果汁，接种酵母菌(购自CICC，菌株保藏编号为CICC1001)，接种量为5％(v/v)，28～30℃发酵至酒精度约为4％vol。试验组发酵罐中加入4L活菌数约108cfu/ml凝结芽孢杆菌HSCY3073二级种子液，对照组发酵罐中不添加。按照相同的条件，保持发酵罐温度为30℃，压力0.05Mpa，搅拌速度为60r/min，发酵至酒精度约7％vol。最后接入醋酸菌(购自CICC，菌株保藏编号为CICC 20001)，接种量为10％(v/v)，调整通气量为0.3～0.4vvm，搅拌速度为250r/min进行醋酸发酵。
3、总酸和乳酸含量的检测
发酵结束后分别对酿造的苹果醋中总酸和乳酸含量进行检测。总酸(以乙酸计)采用酸碱滴定法测定。乳酸采用高效液相色谱法，参照《GB/T 18623-2011地理标志产品镇江香醋》附录B中方法。与对照组相比，试验组的总酸含量从5.60g/100ml提高到了5.95g/100ml；乳酸含量从0.76g/100ml提高到了1.09g/100ml，提高了43.42％。试验组的苹果醋刺激性显著降低、口感更加绵柔，品质得到显著提升。
表3凝结芽孢杆菌HSCY3073在苹果醋酿造中总酸、乳酸产量
| 组别 | 总酸(g/100ml) | 乳酸(g/100ml) |
| 试验组 | 5.95 | 1.09 |
| 对照组 | 5.60 | 0.76 |
实施例4凝结芽孢杆菌HSCY3073在米醋酿造中的应用
1、菌株的扩大培养
一级种子液的制备：按照3％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的凝结芽孢杆菌HSCY3073菌液接种到MRS培养基中，温度40℃，转速220r/min培养24h。
二级种子液的制备：选用50L液态发酵罐，加水20L，搅拌速度为120r/min，将水加热到90℃，加入米粉(大米经过粉碎后，过100目筛得到米粉)12kg，加入2万U/ml高温α-淀粉酶，添加量为3.5ml，保温35min。然后将醪液温度降至55℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为0.6g，保温40min，制得米浆糖化液。在所制备的米浆糖化液中添加0.3％(w/v)的蛋白胨和0.3％(w/v)酵母粉，115℃灭菌20min。冷却至37℃后，按照5％(v/v)的接种量接入一级种子液，调整通气量为0.3vvm，搅拌速度为120r/min，37℃保压发酵36h，活菌数达到108cfu/ml。
2、接种发酵
选取2个500L发酵罐设为试验组和对照组，分别加入100L酒精度为8％vol的米酒，按照10％的接种量接入醋酸菌(购自CICC，菌株保藏编号为CICC 20001)，温度为30～35℃，调整通气量为0.3～0.4vvm，搅拌速度为250r/min进行醋酸发酵。待酒精度降至5％vol以下时，试验组发酵罐中加入5L活菌数约108cfu/ml凝结芽孢杆菌HSCY3073二级种子液，对照组发酵罐中不添加，继续进行醋酸发酵。
3、总酸和乳酸含量的检测
发酵结束后分别对酿造的米醋中总酸和乳酸含量进行检测。总酸(以乙酸计)采用酸碱滴定法测定。乳酸采用高效液相色谱法，参照《GB/T 18623-2011地理标志产品镇江香醋》附录B中方法。与对照组相比，试验组的总酸含量提高了6.98％，从6.59g/100ml提高到了7.05g/100ml；乳酸含量提高了52.7％，使得试验组的米醋口感更绵柔和，显著提升了产品品质。
表4凝结芽孢杆菌HSCY3073在米醋酿造中总酸、乳酸产量
| 组别 | 总酸(g/100ml) | 乳酸(g/100ml) |
| 试验组 | 7.05 | 1.13 |
| 对照组 | 6.59 | 0.74 |
序列表
<110> 江苏恒顺醋业股份有限公司、江苏恒顺集团有限公司
<120> 一株凝结芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> Bacillus coagulans
<400> 1
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acacccgaag tcggtgaggt aaccttacgg agc 1413
Claims (10)
1.一株凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年5月13日，保藏编号为CGMCC NO.17801。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含权利要求1所述的凝结芽孢杆菌。
3.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌、权利要求2所述的微生物菌剂在食品领域中的应用。
4.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌、权利要求2所述的微生物菌剂在食醋酿造中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述食醋为米醋、香醋或苹果醋中的一种。
6.一种食醋的酿造方法，其特征在于，所述食醋的酿造方法包括如下步骤：
1）采用权利要求1所述的凝结芽孢杆菌制备菌株种子液；
2）对菌株种子液进行发酵即得。
7.根据权利要求6所述的食醋的酿造方法，其特征在于，所述步骤1）中的菌株种子液的制备包括一级种子液的制备和二级种子液的制备。
8.根据权利要求7所述的食醋的酿造方法，其特征在于，所述一级种子液的制备具体包括以下步骤：按照3%~6%的接种量，将纯化的凝结芽孢杆菌接种到MRS培养基中，40~45℃转速200~220r/min培养20~24h。
9.根据权利要求7所述的食醋的酿造方法，其特征在于，所述二级种子液的制备包括以下步骤：选用液态发酵罐，加水搅拌，将水加热到90~95℃，加入米粉和高温α-淀粉酶，保温得到醪液，然后将醪液温度降至45~55℃，加入糖化酶，制得糖化液；在所制备的糖化液中添加蛋白胨和酵母粉，灭菌冷却至35~37℃后，按照3%~6%的接种量接入一级种子液，通气搅拌，37℃~45℃保压发酵24~36h即得。
10.根据权利要求6所述的食醋的酿造方法，其特征在于，所述步骤2）中当制备香醋时,按照镇江香醋酿造工艺进行投料、接种、带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束；所述步骤2）中当制备果醋时，在发酵罐中加入经过调配糖含量为16～18％(w/w)，pH值为4.5～5.0的果汁，接种酵母菌进行酒精发酵；待发酵至酒精度为4～6％vol时加入活菌数108cfu/ml的凝结芽孢杆菌HSCY3073二级种子液，添加量为1～5％(v/v)；待发酵至酒精度约5～7％vol时接入醋酸菌进行醋酸发酵；所述步骤2）中当制备米醋时，在发酵罐中加入酒精度为6～8％vol的米酒，接种醋酸菌进行醋酸发酵，接种量为8～10％(v/v)，待酒精度降至4～5％vol以下时加入活菌数108cfu/ml的凝结芽孢杆菌HSCY3073二级种子液，添加量为1～5％(v/v)，继续进行醋酸发酵。
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