CN108913628A - 一株索诺拉沙漠芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株索诺拉沙漠芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株索诺拉沙漠芽孢杆菌，所述索诺拉沙漠芽孢杆菌为索诺拉沙漠芽孢杆菌HS‑B1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年5月30日，保藏编号为CGMCC NO.15824。本发明还公开了该菌株的应用。本发明的该菌株具有优良的抗逆性，可作为辅助菌种直接应用于香醋、陈醋等传统固态酿造食醋的生产中，也可以应用于液态酿造食醋的生产。通过该菌株的使用，可以改善因季节变化、菌种退化等问题引起的不挥发酸含量降低问题，可明显提高食醋中不挥发酸的含量，改善产品风味，提高产品品质，并可一定程度上提高产品出率。

Description

一株索诺拉沙漠芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株索诺拉沙漠芽孢杆菌及其应用，具体为一株适用于食醋酿造的恶劣环境并可提高食醋品质的索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis HS-B1)，属于微生物应用和传统食品酿造领域。
背景技术
传统酿造食醋是传统固态酿造食品的典型代表。在中国、日本国等东方国家，食醋主要是以糯米、高粱或甘薯等淀粉含量较高的粮谷类为主要原料、以谷糠、麸皮为辅料，通过多种微生物的固态发酵工艺进行酿造。传统酿造食醋中除了乙酸以外，不挥发酸是其重要风味物质，而不挥发酸中主要以乳酸为主。乳酸具有酸味柔和、刺激性小的特点，进而可以缓和乙酸刺激的酸味，同时还具有利尿和缓泻的作用。另外，乳酸在糖原异生基质和肝糖原的合成、调节细胞内氧化还原状态、体液调节等方面也发挥着良好的作用。
在实际的酿醋过程中,除了起主导作用的醋酸菌以外,其它微生物对产品的风味和品质也起着重要的作用。我国食醋多采用独特的开放式天然多菌种混合发酵工艺，在不同的季节、不同批次之间具有一定的差异，且产品中不挥发酸含量的稳定性差。
食醋发酵是在高乙醇、高乙酸的恶劣环境中进行的，一般微生物难以在其中生长。食醋酿造的技术研究相对落后，可用于发酵且性状优良的微生物严重缺乏。芽孢杆菌是一类耐受性较强的细菌，部分菌株对乙醇、乙酸具有较强的抵抗力。因此，筛选出适合食醋特殊酿造环境的具有优良抗逆性的芽孢杆菌，再将其应用于食醋的生产过程中，对稳定并提高产品品质具有重要的意义。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一株索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种微生物菌剂，所述菌剂包含所述的索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的索诺拉沙漠芽孢杆菌、所述的微生物菌剂在食品领域中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供一种食醋的酿造方法。
技术方案：为实现上述技术目的，本发明采取如下的技术方案：一株索诺拉沙漠芽孢杆菌，所述索诺拉沙漠芽孢杆菌为索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年5月30日，保藏编号为CGMCC NO.15824。
本发明内容还包括一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包含所述的索诺拉沙漠芽孢杆菌。
本发明内容还包括所述的索诺拉沙漠芽孢杆菌、所述的微生物菌剂在食醋的酿造中的应用。
其中，所述食醋为镇江香醋、山西老陈醋等固态酿造食醋或果醋等液态酿造食醋中的一种。
本发明内容还包括一种食醋的酿造方法，所述食醋的酿造方法包括如下步骤：
1)索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1的扩大培养；
2)醋醅接种发酵。
其中，所述步骤1)中的菌株的扩大培养包括一级种子液的制备和二级种子液的制备，所述一级种子液的制备中采用的培养基为营养肉汤培养基，所述营养肉汤培养基的成分为：葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 3g/L，调节pH7.0～7.2。
具体的，该肉汤培养基的成分为：葡萄糖25g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，NaCl 3g，蒸馏水1000mL，调节pH7.0-7.2。
其中，所述二级种子液的培养基制备方法如下：大米经粉碎后过80目筛得到米粉，边搅拌边将米粉加入90～95℃热水中，其中米粉添加量为15～25％(w/v)。加入2万U/ml高温α-淀粉酶，添加量为每千克米粉添加0.4～0.6ml，保温30～40min得到醪液。然后将醪液温度降至45～55℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为每千克米粉添加70～100mg，保温30～40min，制得米浆糖化液。在所制备的米浆糖化液添加0.2％～0.5％(w/v)的蛋白胨和0.1％～0.4％(w/v)酵母粉，灭菌即得。
其中，所述步骤2)中当制备香醋或陈醋时，按照香醋或陈醋的酿造工艺进行带种、翻醅发酵，发酵结束后加入食盐进行封醅。
其中，所述步骤2)中当制备果醋时，在发酵罐中加入经过调配糖含量为16％～18％(w/w)，pH值为4.5～5.0的果汁，接种酵母菌进行酒精发酵；待发酵至酒精度为4～6％vol时加入活菌数109cfu/ml索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1，添加量为1％～3％(v/v)；待发酵至酒精度为5～7％vol时接入醋酸菌进行醋酸发酵。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明提供了一株适合食醋酿造生产用的、具有优良抗逆性的索诺拉沙漠芽孢杆菌，该菌株可作为辅助菌种直接应用于镇江香醋、山西老陈醋等传统固态酿造食醋的酿造中，也可以应用于苹果醋、桑葚醋等液态食醋的酿造。通过该菌株的使用，可以改善因季节变化、菌种退化等问题引起的不挥发酸含量降低问题，可明显提高食醋中不挥发酸的含量，改善产品风味，提高产品品质，并可一定程度上提高产品出率。
本发明从镇江香醋生产工艺过程的醋醅中分离筛选得到一株较适合于食醋酿造使用的索诺拉沙漠芽孢杆菌，该菌株具有耐8.5％vol乙醇、耐5％(v/v)乙酸、NaCl耐受度低(质量百分比2.5％)、生长温度范围广(15～55℃)、产乳酸和乙酸等特性，不仅能够适应一般微生物难以生长的醋酸发酵的恶劣环境，而且对氧气的要求低，在需氧和厌氧条件下均能生长，并产生乳酸、乙酸等有机酸。
附图说明
图1为本发明的菌株HS-B1菌落形态；
图2为本发明索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1在镇江香醋酿造中接种后、露底和封醅时总酸含量的检测；
图3为本发明索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1在镇江香醋酿造中接种后、露底和封醅时乳酸含量的检测。
具体实施方式
下面申请人将结合具体的实施例对本发明产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但应该理解，以下实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。
本发明实施例中采用的肉汤培养基：
葡萄糖25g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，NaCl 3g，蒸馏水1000mL，调节pH7.0‐7.2。固体培养基添加20g琼脂粉。初筛培养基添加3％(v/v)乙酸。
实施例1索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1的分离与鉴定
1、菌株的分离
分别取镇江香醋醋酸发酵至第7d、15d的低层醋醅样品25g，加入225ml灭菌的生理盐水中，摇匀后取1ml样品加入到9ml无菌生理盐水中，在漩涡混合器上混和均匀后，再取1ml稀释过的溶液加入到9ml的生理盐水中，以此类推。选取3个合适的浓度依次涂布到添加有体积百分比为3％(v/v)乙酸的营养琼脂固体平板上，分别于37℃普通培养箱和厌氧培养箱中培养48h。
2、菌株纯化
3％(v/v)乙酸对绝大部分细菌具有明显的抑制作用，平板仅长出极少量的菌落。利用划线的方法在对平板上长出的疑似芽孢杆菌菌落在平板上进行划线纯化2次后，置于4℃冰箱保存。
3、菌株复筛
将保存的菌株分别接种到含有6％vol乙醇的营养琼脂培养基中，37℃培养24h后测定发酵液的pH值，选取pH值低于4.5的菌株。
将产酸特性好的菌株分别接入NaCl含量(w/v)为1.5％、2.0％、2.5％和3.0％的液体营养肉汤培养基中，选取耐受NaCl最差的菌株，并确定NaCl的最大耐受浓度。
最终得到一株耐乙醇、耐乙酸、产酸特性好、NaCl的最大耐受浓度为2.5％(w/v)的菌株HS-B1。
4、菌株鉴定
测得的16S rRNA序列(序列详见SEQ ID NO：1所示)用BLAST程序在NCBI数据库中比对分析，结果本发明菌株HS-B1与索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)NBRC101234的16S rRNA同源性为99％。结合生理生化特征，将本发明菌株命名为索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1(Bacillus sonorensis HS-B1)。
该菌株于2018年5月30日将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC NO.15824，保藏日期为2018年5月30日，其分类命名为Bacillussonorensis。
5、菌株产酸特性
分离得到的索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1菌株在15～55℃均能生长，不论在需氧还是厌氧条件下均能大量产生不挥发酸—乳酸，厌氧状态下产生的乳酸明显高于需氧状态，且在需氧状态下会产生一定量的乙酸。
表1有机酸种类及产量(mg/100ml)
有机酸 乳酸 乙酸 柠檬酸 草酸 丙酮酸
厌氧 594.93 1.30 6.38 0.13 0.10
需氧 367.74 134.81 3.21 0.03 --
实施例2索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1在镇江香醋酿造中的应用
1、菌株的扩大培养
一级种子液的制备：按照5％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1菌液接种到液体营养肉汤培养基中，37℃培养20h。
二级种子液的制备：选用50L液态发酵罐，加水35L，搅拌速度为80～100r/min，将水加热到90～95℃，加入米粉(大米经过粉碎后，过80目筛得到米粉)7kg，加入2万U/ml高温α-淀粉酶，添加量为2.8ml，保温40min得到醪液。然后将醪液温度降至45～55℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为0.49g，保温40min，制得米浆糖化液。在所制备的米浆糖化液中添加0.3％(w/v)的蛋白胨和0.3％(w/v)酵母粉，115℃灭菌20min。冷却至35～37℃后，按照5％(v/v)的接种量接入一级种子液，调整通气量为0.1～0.3vvm，搅拌速度为80～120r/min，37℃保压发酵18～24h，活菌数达到109cfu/ml。
2、醋醅接种发酵
冬季，选取6个400kg大缸，选3个缸为试验组，每个缸中加入酒醪250kg，接入11L索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1二级种子液，加入麸皮90kg、大糠50kg。剩余3个缸为对照组，每个缸中加入酒醪250kg、麸皮90kg、大糠50kg。按照镇江香醋酿造工艺进行带种、翻醅发酵，发酵结束后加入食盐进行封醅。
3、总酸和乳酸含量的检测
发酵过程中，取接种后、露底和封醅时的卤子进行检测。
总酸(以乙酸计)采用酸碱滴定法测定，测定结果如图2所示。
乳酸采用高效液相色谱法，参照《GB/T 18623-2011地理标志产品镇江香醋》附录B中方法，测定结果如图3所示。
在醋酸发酵过程中，试验组的总酸含量略高于对照组，约提高3.27％；但试验组的乳酸含量明显高于对照组，封醅时试验组乳酸含量比对照组提高了14.80％。
本发明的菌株HS-B1可较好的作为辅助菌种强化菌种应用于镇江香醋的生产中，通过该菌株的强化可明显提高冬季镇江香醋中的乳酸含量，提高产品品质。
实施例3索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1在山西老陈醋酿造中的应用
1、菌株的扩大培养
一级种子液的制备：按照5％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1菌液接种到液体营养肉汤培养基中，37℃培养20h。
二级种子液的制备：选用50L液态发酵罐，加水35L，搅拌速度为80～100r/min，将水加热到90～95℃，加入米粉(大米经过粉碎后，过80目筛得到米粉)7kg，加入2万U/ml高温α-淀粉酶，添加量为4.2ml，保温30min。然后将醪液温度降至45～55℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为0.7g，保温30min，制得米浆糖化液。在所制备的米浆糖化液中添加0.4％(w/v)的蛋白胨和0.2％(w/v)酵母粉，115℃灭菌20min。冷却至35～37℃后，按照5％(v/v)的接种量接入一级种子液，调整通气量为0.1～0.3vvm，搅拌速度为80～120r/min，37℃保压发酵18～24h，活菌数达到109cfu/ml。
2、醋醅接种发酵
选取6个400kg大缸，分为试验组和对照组，每组各3缸。按照山西老陈醋酿造工艺，每缸在酒醪中接入等量的种醅。其中，试验组每缸中再接入11L索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1二级种子液，对照组均不添加。每天翻醅一次进行醋酸发酵，醋酸发酵结束后加入食盐进行封醅。
在醋酸发酵过程中，试验组总酸含量比对照组提高2.67％，试验组的乳酸含量明显高于对照组，封醅时试验组乳酸含量比对照组提高10.37％。
实施例4索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1在苹果醋酿造中的应用
1、菌株的扩大培养
一级种子液的制备：按照5％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1菌液接种到液体营养肉汤培养基中，37℃培养20h。
二级种子液的制备：选用25L液态发酵罐，加水15L，搅拌速度为80～100r/min，将水加热到90～95℃，加入米粉(大米经过粉碎后，过80目筛得到米粉)3kg，加入2万U/ml高温α-淀粉酶，添加量为1.3ml，保温30～40min。然后将醪液温度降至45～55℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为0.28g，保温30～40min，制得米浆糖化液。在所制备的米浆糖化液中添加0.3％(w/v)的蛋白胨和0.2％(w/v)酵母粉，115℃灭菌20min。冷却至35～37℃后，按照5％(v/v)的接种量接入一级种子液，调整通气量为0.1～0.3vvm，搅拌速度为80～120r/min，37℃保压发酵18～24h，活菌数达到109cfu/ml。
2、接种发酵：
选取6个500L发酵罐，分别加入200L经过调配，糖含量为16～18％(w/w)，pH值为4.5～5.0的苹果汁，接种酵母菌，接种量为5％(v/v)，28～30℃发酵至酒精度为约5％vol。试验组3罐中加入4L活菌数约109cfu/ml索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1二级种子液，对照组3罐中不添加。按照相同的条件，保持发酵罐温度为28～30℃，压力0.05Mpa，搅拌速度为60r/min，发酵至酒精度约7％vol。最后接入醋酸菌，接种量为10％(v/v)，调整通气量为0.3～0.4vvm，搅拌速度为250r/min进行醋酸发酵。
发酵结束后分别对酿造的苹果醋中总酸和乳酸含量进行检测，结果试验组比对照组中总酸提高4.81％；对照组中乳酸含量几乎为零，而试验组中乳酸含量为0.27g/100mL。试验组酿造苹果醋的乙酸刺激性显著降低、口感更加绵柔，显著提升产品品质，同时一定程度上提高了产品出率。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对发明进行了详细的描述，但本领域的技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 江苏恒顺醋业股份有限公司
<120> 一株索诺拉沙漠芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> 索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis )
<400> 1
catgcaagtc gagcgaaccg acgggagctt gctcccttag gttagcggcg gacgggtgag 60
taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc 120
ggatgcttga ttgaaccgca tggttcaatt ataaaaggtg gcttttagct accacttaca 180
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ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta 1380
acacccgaag tcggtgaggt aaccttttgg agccagccgc 1420

Claims (10)

1.一株索诺拉沙漠芽孢杆菌，其特征在于，所述索诺拉沙漠芽孢杆菌为索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年5月30日，保藏编号为CGMCC NO. 15824。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含权利要求1所述的索诺拉沙漠芽孢杆菌。
3.权利要求1所述的索诺拉沙漠芽孢杆菌、权利要求2所述的微生物菌剂在食品领域中的应用。
4.权利要求1所述的索诺拉沙漠芽孢杆菌、权利要求2所述的微生物菌剂在食醋酿造中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述食醋为固态酿造食醋或液态酿造食醋中的一种。
6.一种食醋的酿造方法，其特征在于，所述食醋的酿造方法包括如下步骤：
1）索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1的扩大培养；
2）醋醅接种发酵。
7.根据权利要求6所述的食醋的酿造方法，其特征在于，所述步骤1）中的索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1的扩大培养包括一级种子液的制备和二级种子液的制备，所述一级种子液的制备中采用的培养基为营养肉汤培养基，所述营养肉汤培养基的成分为：葡萄糖 25g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 3g/L，调节pH7.0~7.2。
8.根据权利要求7所述的食醋的酿造方法，其特征在于，所述酿造食醋使用的二级种子液的培养基制备方法如下：大米经粉碎后过80目筛得到米粉，边搅拌边将米粉加入90~95℃热水中，其中米粉添加量为15~25%w/v，加入2万U/ml高温α-淀粉酶，添加量为每千克米粉添加0.4~0.6ml，保温30~40min得到醪液，然后将醪液温度降至45~55℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为每千克米粉添加70~100mg，保温30~40min，制得米浆糖化液，在所制备的米浆糖化液中添加0.2%~0.5%w/v的蛋白胨和0.1%~0.4%w/v酵母粉，灭菌即得。
9.根据权利要求6所述的食醋的酿造方法，其特征在于，所述步骤2）中当制备香醋或陈醋时，按照香醋或陈醋的酿造工艺进行带种、翻醅发酵，发酵结束后加入食盐进行封醅。
10.根据权利要求6所述的食醋的酿造方法，其特征在于，所述步骤2）中当制备果醋时，在发酵罐中加入经过调配糖含量为16%~18%w/w，pH值为4.5~5.0的果汁，接种酵母菌进行酒精发酵；待发酵至酒精度为4~6%vol时加入活菌数109cfu/ml索诺拉沙漠芽孢杆菌HS-B1，添加量为1%~3%v/v；待发酵至酒精度为5~7%vol时接入醋酸菌进行醋酸发酵。
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