CN110577914B - 索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CZ182菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物领域，尤其涉及索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CZ182菌株及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年4月28日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019309，分类学命名Bacillus sonorensis。本技术方案的有益效果在于提供了一种可抑制细菌和真菌的索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CZ182菌株，该菌株具有较高的耐盐能力，且能抑制金黄色葡萄球菌、棉花黄霉菌等致病菌。且该菌株具有耐高盐、高温、强酸、强碱以及抗蛋白酶的特性，具有广泛的应用前景。

Description

索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CZ182菌株及其 应用

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensisCZ182菌株及其应用。

背景技术

目前已发现许多种生物防治微生物，在这些生防微生物中，芽孢杆菌属应用较多。自从发现芽孢杆菌产生抑菌物质以来，人们从芽孢杆菌属中发现了许多种抗生素，不同种类的芽孢杆菌所产生的抑菌物质有很大差别。抑菌物质的产生途径主要有核糖体途径和非核糖体途径，通过非核糖体途径产生的抑菌物质主要有脂肽类抗生素、挥发性物质等，脂肽类抗生素如生物表面活性素是一种生物表面活性剂，能够溶解病原菌的细胞膜，从而导致细胞裂解；通过核糖体途径产生的抑菌物质主要有蛋白酶类，如几丁质酶、葡聚糖酶、脂肪酶、纤维素酶等多种真菌细胞壁裂解酶，对于抑制病原真菌非常有效。

耐盐芽孢杆菌菌适应高盐环境的能力很强，它们通过渗透调节来保持细胞的渗透压平衡，具有很好的排钠、吸钾的生理功能，某些嗜盐菌细胞还含有视黄醛朊,为细胞内质子移动提供了推动力，以维持其正常的新陈代谢。至今有一些天然抑菌物质被商品化为生防制剂应用于农业，耐盐芽孢杆菌属生防制剂相对稳定，与非芽孢杆菌属生防制剂、真菌属生防制剂相比，耐盐芽孢杆菌源抗菌物质在化学相容性、抗酸碱、耐高温等方面，具有很大的优势。

因此，筛选具要较高耐盐抗性、又能产抗菌活性物质的细菌，并研究其生物学特性及对不同细菌和真菌的抑制作用，可为细菌源抗菌活性物质提供优质的资源，对于细菌源药物的广泛应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种可抑制细菌和真菌的索诺拉沙漠芽孢杆菌菌株，该菌株具有较高的耐盐能力，且能抑制金黄色葡萄球菌、棉花黄霉菌等致病菌。

本发明提供的技术方案为一种索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CZ182菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年4月28日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019309，分类学命名Bacillussonorensis。

以及，索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CZ182菌株在抑制金黄色葡萄球菌中的应用。

以及，索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CZ182菌株在抑制棉花黄霉菌中的应用。

而且，所述菌株能耐受18％浓度的NaCl。

而且，所述菌株的发酵液活性物质至少适用于-20℃～80℃的温度条件。

而且，所述菌株的发酵液活性物质至少适用于3～12的pH条件。

而且，所述菌株的发酵液活性物质至少适用于0-20％浓度NaCl的条件。

而且，所述菌株的发酵液活性物质至少适用于0-5mg/ml蛋白酶K的条件。

而且，所述菌株的发酵液活性物质至少适用于0-5mg/ml胰蛋白酶的条件。

与现有技术相比，该技术方案的有益效果在于：提供了一种可抑制细菌和真菌的索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CZ182菌株，该菌株具有较高的耐盐能力，且能抑制金黄色葡萄球菌、棉花黄霉菌等致病菌。且该菌株具有耐高盐、高温、强酸、强碱以及抗蛋白酶的特性，具有广泛的应用前景。

具体实施方式

本发明的索诺拉沙漠芽孢杆菌的分离和鉴定方法如下：

索诺拉沙漠芽孢杆菌CZ182从新疆阿克苏盐碱地土样中分离得到。具体分离步骤为：称取新疆阿克苏盐碱地土样1g加入含有99mL无菌蒸馏水并带有玻璃珠的三角瓶中，放置于28℃摇床内振荡30min，取样做梯度稀释后，涂布于含有20μg/mL氨苄霉素和5％的NaCl的牛肉膏蛋白胨平板中，置于37℃生化培养箱中培养48h，从中筛选出菌株。以金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、棉花黄霉菌为检测菌，采用牛津杯法，对分离的菌株进行抗菌试验，筛选出对细菌Staphylococcus aureus、棉花黄霉菌具有较强抑菌能力的菌株CZ182。

采用16S rDNA基因序列分析法，对菌株CZ182进行分子鉴定。将菌株接种到5ml LB培养液，37℃、200rpm/min培养24小时，10000rpm/min离心1min，收集菌体于1.5ml离心管中，采用CTAB法抽提细菌基因组。使用16S rDNA引物16S-F：AAGGAGGTGATCCAGCC和16S-R：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，进行PCR扩增，扩增产物经测序后与GenBank已登录的相关序列进行核苷酸序列同源性比对分析，与索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)相比，其16S rDNA序列相似性都达到99.8％,将其鉴定为这个种。

以下给出本发明的索诺拉沙漠芽孢杆菌CZ182的一些性能研宄结果：

实验1索诺拉沙漠芽孢杆菌CZ182耐盐能力测定

对索诺拉沙漠芽孢杆菌CZ182进行盐浓度耐受分析。倒置含有NaCl质量浓度为3％、5％、10％、15％、18％的LB固体培养基平板，接种CZ182菌株后，置于37℃恒温培养箱倒置培养2d，每个处理做三个平行，观察生长状况。结果表明在NaCl质量浓度为18％的条件下，菌体生长良好，表明CZ182菌株能耐受18％NaCl。

实验2菌株CZ182产生的活性物质对金黄色葡萄球菌的抑制作用

对分离的耐盐菌索诺拉沙漠芽孢杆菌CZ182进行抑菌性能测定。以金黄色葡萄球菌作为指示菌，取其活化后菌液均匀涂布到LB培养基上。CZ182菌株用LB液体培养基培养过夜后，离心去菌株沉淀，取菌株上清发酵液。将牛津杯置于涂布有金黄色葡萄球菌的LB培养基上，并加入100μL CZ182菌株发酵液于牛津杯中，正置于37℃恒温培养箱中培养14h，每个处理做三个平行。用牛津杯法测定菌株发酵液的抑菌性能，结果表明CZ182菌株发酵液对金黄色葡萄球菌有很强的抑制能力，其抑菌圈直径达到为2.99±0.08cm。

实验3菌株CZ182产生的活性物质对植物致病真菌的抑制作用

以植物致病真菌棉花黄霉菌作为指示菌，蘸取棉花黄霉菌的孢子，均匀涂抹到PDA培养基平板上；用镊子夹取已灭菌的牛津杯放置在已涂布棉花黄霉菌PDA培养基平板上，牛津杯中加入100μL CZ182菌株发酵液，将平板正放于30℃恒温培养箱中培养4d，每个处理做三个平行，观察抑菌效果。结果表明：菌株CZ182发酵液对棉花黄霉菌具有较好的抑制效果，其抑菌圈直径达到3.1±0.2cm。

实验4不同温度对菌株CZ182产生的活性物质抑菌能力的影响

CZ182菌株用LB液体培养基培养过夜后，离心去菌株沉淀，取上清菌株发酵液。上清发酵液分别经-20℃、20℃、37℃、60℃、80℃、100℃等不同温度处理，处理时间为2h，处理之后恢复室温。经不同温度处理的发酵液进行棉花黄霉菌抑菌实验，每个处理做三个平行。结果表明：CZ182菌株发酵液活性物质能耐受-20℃～80℃的温度条件，在此范围内，菌株发酵液活性物质都有很强的抗菌活性，其中在20℃处理2h，其抑菌圈直径最高，达到3.4±0.1cm(表1)，而经80℃处理，其抑菌活性还保持在80％以上。表明CZ182菌株产生的活性物质具有很广的温度适应范围，可用于高温条件下抑制植物致病真菌。

表1 CZ182菌株产生的抑菌活性物质热稳定性检测

x±SD：表示抑菌圈大小(cm)的平均值±标准偏差。

实验5不同pH对菌株CZ182产生的活性物质抑菌能力的影响

CZ182菌株用LB液体培养基培养过夜后，离心去菌株沉淀，取上清菌株发酵液。上清发酵液分别在3、4、6、8、10、12等不同pH处理4h，处理之后恢复pH至7。经不同pH处理的发酵液进行棉花黄霉菌抑菌实验，每个处理做三个平行。结果表明：CZ182菌株发酵液活性物质能耐受3-12的酸碱度环境，在此条件下，其活性物质都能保持较高的抗菌活性(表2)，经低酸pH3和高碱pH12，CZ182菌株产生的活性物质还保持80％以上的抑菌活性。表明CZ182菌株产生的活性物质具有很广的酸碱度适应范围，可用于高酸或强碱条件写抑制植物致病真菌。

表2 CZ182菌株产生的抑菌活性物质pH稳定性检测

x±SD：表示抑菌圈大小(mm)的平均值±标准偏差。

实验6不同盐浓度处理对菌株CZ182产生的活性物质抑菌能力的影响

CZ182菌株用LB液体培养基培养过夜后，离心去菌株沉淀，取上清菌株发酵液。上清发酵液分别添加灭菌的NaCl，使其终浓度分别为0％、1％、5％、10％、15％、20％。含有不同浓度NaCl的CZ182菌株发酵液进行棉花黄霉菌抑菌实验，每个处理做三个平行。结果表明：CZ182菌株发酵液活性物质能耐受高达20％NaCl(表3)。经20％NaCl的浓液中，其抑菌圈直径仍达到2.72±0.29cm，仍保持80％以上的抗菌活性。表明CZ182菌株产生的活性物质具有很广的盐浓度适应范围，可用于高盐条件下抑制植物致病真菌。

表3 CZ182菌株产生的抑菌活性物质盐稳定性检测

x±SD：表示抑菌圈大小(cm)的平均值±标准偏差。

实验7不同蛋白酶处理对菌株CZ182产生的活性物质抑菌能力的影响

进一步研究了CZ182菌株产生的抗菌活性物质对蛋白酶的抗性。CZ182菌株用LB液体培养基培养过夜后，离心去菌株沉淀，取上清菌株发酵液。上清发酵液分别加入蛋白酶，使其总浓度分别为1mg/ml蛋白酶K、5mg/ml蛋白酶K、1mg/ml胰蛋白酶、5mg/ml胰蛋白酶。反应3小时后，终止蛋白酶活性。将经不同蛋白酶处理的发酵液进行棉花黄霉菌抑菌实验，每个处理做三个平行。结果表明：CZ182菌株发酵液活性物质能耐受高达5mg/ml蛋白酶K和5mg/ml胰蛋白酶(表4)，经蛋白酶处理，其活性物质还保持83％以上抗性活力，说明菌株CZ182产生的抗菌活性物质对蛋白酶具有很强的耐受性。

表4 CZ182菌株产生的抑菌活性物质蛋白酶抗性检测

x±SD：表示抑菌圈大小(cm)的平均值±标准偏差。

序列表

<110> 中南民族大学

<120> 索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CZ182菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 848

<212> DNA

<213> 索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)

<400> 1

gggggtgcta tactgcagtc gagcggaccg acgggagctt gctcccttag gtcagcggcg 60

gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg 120

ggctaatacc ggatgcttga ttgaaccgca tggttcaatc ataaaaggcg gcttcggctg 180

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actccgcc 848

Claims (2)

1.一种索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CZ182菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年4月28日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019309，分类学命名Bacillus sonorensis。

2.权利要求1所述的索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CZ182菌株在制备抑制金黄色葡萄球菌的药物中的应用。