CN114073665B - 索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物在制备抗光老化产品中的应用。本发明在研究过程中发现所得到的索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物，具有抗光老化的作用，可用于抗光老化的护肤品、医美产品中。

Description

索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物的应用
技术领域
本发明涉及微生物应用领域。具体地，涉及一种索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物在抗光老化中的应用。
背景技术
索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillussonorensis)是一种耐盐芽孢杆菌，适应高盐环境的能力很强，它们通过渗透调节来保持细胞的渗透压平衡，具有很好的排钠、吸钾的生理功能，某些嗜盐菌细胞还含有视黄醛朊,为细胞内质子移动提供了推动力，以维持其正常的新陈代谢。至今有一些天然抑菌物质被商品化为生防制剂应用于农业，耐盐芽孢杆菌是相对稳定的生防制剂，而且与非芽孢杆菌属生防制剂、真菌属生防制剂相比，耐盐芽孢杆菌源抗菌物质在化学相容性、抗酸碱、耐高温等方面，具有很大的优势。
外源性皮肤老化是指皮肤受环境因素影响而引起的衰老变化，其中以紫外线(Ultraviolet,UV)辐射的影响为主，故又称为光老化。长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB)均可造成光老化。皮肤光老化的主要临床表现是皮肤皱纹、粗糙、松弛、毛细血管扩张、色素沉积以及同时成纤维细胞、角化细胞和浸润性中性粒细胞也发生多种变化。长期日光照射可影响皮肤的多种细胞成分和组织结构改变，其中最具特征性的变化是真皮细胞外基质成分的改变。真皮细胞外基质包括胶原纤维、弹力纤维、氨基多糖和蛋白多糖等，其中I型胶原蛋白是其主要结构蛋白。在光老化的皮肤中，I型与III型胶原纤维减少、紊乱，弹性纤维变性、变粗，聚集成块，氨基多糖裂解，导致皮肤松弛、皱纹的发生。
因此，随着人们对预防光老化效应的兴趣日益浓厚，寻求有效的抗光老化产品是目前护肤品行业关注的焦点之一。具有修复光损伤能力且富含天然活性成分的抗光老化产品，是永恒的需求，具有广阔的应用前景。
目前还没有人发现索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物具有抗光老化的作用，本发明的发明人在之前对索诺拉沙漠芽孢杆菌的研究基础上，对其发酵液提取物进一步挖掘新的应用。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物的新的应用。
实现上述目的的技术方案包括如下：
本发明的第一个方面，是提供索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物的应用。
索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物在制备抗光老化产品中的应用。
本发明的第二个方面，是提供具有抗光老化作用的产品，所述产品的抗光老化的活性物质含有索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物。
在其中一些实施例中，所述索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物通过包括以下步骤的制备方法得到：
(1)将索诺拉沙漠芽孢杆菌菌种活化；
(2)活化后进行种子液培养；
(3)将索诺拉沙漠芽孢杆菌液种子液接入发酵罐，于温度为37±0.5℃，溶氧为30±3％，维持发酵罐内的发酵液pH为7.0±0.5中进行发酵；
(4)离心，收集菌体，菌体经重悬，均质破碎，离心收集上清，即得。
在其中一个实施例中，所述发酵步骤包括：所述发酵包括：以索诺拉沙漠芽孢杆菌种子液OD600＝0.8，按体积比为1:9～11接种量接入发酵罐，于温度为37±0.5℃，初始搅拌转速为400±50rpm，溶氧为30±3％，维持罐内发酵液pH在7.0±0.5中进行发酵。。
所述索诺拉沙漠芽孢杆菌的菌株保藏编号为中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)CICC10847。
在其中一些实施例中，所述产品是是药物或者化妆品。
在其中一些实施例中，所述化妆品是医美用品，护肤品，或美容产品。
所述护肤品包括以下重量含量的成分，索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物1～10％、保湿剂5～20％、增稠剂0.1～1.5％、油脂0％～20％、乳化剂0～8％、防腐剂0.1～1％。
在其中一些实施例中，所述保湿剂是小分子透明质酸钠、
增稠剂是丙烯酰胺/丙烯酸铵共聚物、
油脂是乳木果油、
乳化剂是鲸蜡硬脂基葡糖苷。
在其中一些实施例中，所述化妆品是液体制剂或霜剂或凝露剂或面膜。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明在研究过程中发现所得到的索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物，还具有抗光老化的作用，并通过弹性蛋白酶抑制试验、胶原蛋白酶抑制试验、透明质酸酶抑制试验、人皮肤成纤维细胞抗老化实验验证其具有抗光老化作用，其可用于抗光老化的医美产品、护肤品中。
附图说明
图1是实施例1中细胞毒性检测的结果示意图。
图2是实施例2中索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物的弹性蛋白酶抑制率能力测试实验的结果示意图。
图3是实施例2中索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物的胶原蛋白酶抑制能力测试的结果示意图。
图4是实施例2中诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物在透明质酸抑制能力实验的结果示意图。
图5是实施例3中含诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物的化妆品在细胞密度分析测试的结果示意图。
图6是实施例3中诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物的化妆品在COL-Ⅳ表达量趋势图示意。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明，但不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例所述诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液的提取方法，包括以下步骤：
(1)将菌种(平台资源号：1511C0005000010884，菌株保藏编号：CICC10847，中文名称：索诺拉沙漠芽孢杆菌，拉丁名称：Bacillus sonorensis)在LB固体培养基上划线，37℃培养16h。挑取单克隆至30mL LB液体培养基中，37℃，220rpm培养，将培养好的菌种进行保存。
(2)使用5L发酵罐发酵，主要发酵步骤如下：
(2.1)菌种活化
从-80℃取一管保存的菌种，常温冻融，取30μL接种至30mL TB培养基中(以TB培养基作为基础培养基，其含量分别为：蛋白胨10g/L，酵母粉24g/L，葡萄糖12g/L，硫酸镁1.2g/L，硫酸亚铁0.001g/L，硫酸铜0.01g/L)，37℃，220rpm恒温振荡培养8h(9:30—17:30)。
(2.2)种子液培养
取300μL活化的菌液转接至330mL TB培养基中。37℃，220rpm恒温振荡培养16h。
(2.3)5L发酵罐初始发酵条件设置
发酵培养采用5L发酵罐，工作体积为3L，种子OD600＝0.8按1:10(v/v)接种量接入发酵罐，测量种子液浓度。初始pH设置为7.0，温度为37℃，初始搅拌转速为400rpm，溶氧为30％。并将酸碱、消泡、温度、溶氧调为自动。通过整个发酵过程中流加4mol/L NaOH溶液和2mol/L HCl溶液进行pH调节，维持罐内发酵液pH在7.0左右。
(2.4)补料方式
残糖浓度反馈补料。
(2.5)4200RPM离心30min，收集菌体，菌体经PBS重悬(1：10)，均质破碎，离心收集上清。0.22um滤膜过滤，即为发酵液提取物。
所得到的发酵液提取物进行细胞毒性检测，实验过程如下：
1)采用小鼠成纤维细胞系BALB/3T3细胞，经过中性红摄取暴露法(NRU)，通在波长540nm处检测吸光度值(OD值)，检测实施例1所述的索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物的贮备液的细胞毒性。
2)采用96孔板培养，阳性对照物：十二烷基硫酸钠(SLS)；阴性对照：超纯水；受试物：索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物，采用对数稀释法从受试物的贮备液制备8个实验浓度(1000ug/ml，100ug/ml,10ug/ml,1ug/ml,0.1ug/ml,0.01ug/ml,0.001ug/ml))。
参见图1，实验结果表明在索诺拉沙漠芽孢杆菌在浓度100ug/ml以下，相对细胞活性平均值为83.3％，与对照组(SLS)相比≥80％，该索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物在该浓度下无细胞毒性。
实施例2
一.弹性蛋白酶抑制试验
弹性纤维由弹性蛋白和微原纤维构成，使皮肤具有弹性。而由于紫外照射作用，会促进体内弹性蛋白酶产生，降解弹性蛋白，造成表皮中连接组织的丧失，从而导致皮肤衰老，皱纹等光老化现象。本实施例进行了弹性蛋白酶抑制试验。
(一)实验系统
1.受试物质：索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物
2.阳性对照：以EGCG(Epigallocatechin gallate儿茶素没食子酸酯)作为阳性对照。
3.阴性对照：以纯水作为空白对照
(二)实验操作
每孔加入100uL的0.2mol/L的tris-HCl缓冲液和50uL的10mmol/L的MAAPVN，然后分别加入20ul的1000、800、600、400、200ug/ml的实施例1所制备到的索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物、EGCG和纯水，充分混匀后在25℃条件下孵育15min后，加入30uL的0.3U/mL的弹性蛋白酶(活性最高)继续孵育15min。酶标仪在410nm条件下检测OD值，计算抑制率(弹性蛋白酶抑制率(％)＝(A对照-A实验)/A对照×100％)。
表2.1
Figure BDA0003447817270000071
结果如图2显示，索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物的弹性蛋白酶抑制率高于EGCG组，其弹性蛋白酶抑制能力较高。
二.胶原蛋白酶抑制试验
(一)实验系统
1.受试物质：索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物
2.阳性对照：以EGCG作为阳性对照
3.阴性对照：以纯水作为空白对照。
(二)实验操作
用茚三酮反应监测受试物被胶原蛋白酶片段化后的肽的量。
在1.5ml ep管中加入：20mg胶原蛋白I、250uL的200mM TES、550uL的pH＝7.5tris-HCl缓冲液和100ul的1％胶原蛋白酶Ⅳ溶液，再分别加入100ul的1000、800、600、400、200ug/ml的受试物、EGCG和纯水，混匀，在37℃条件下孵育5h后2000rpm离心5min。收集上清液，将其与茚三酮显色剂反应，80℃加热10min后冷却。溶液与异丙醇按1:1的比例混合,在4℃,12000rm下离心10min。上清液加入到96孔板中，在600m下检测其吸光度，计算抑制率(胶原蛋白酶抑制率(％)＝(A对照-A实验)/A对照×100％)。
表2.2
Figure BDA0003447817270000081
结果如图3显示，索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物的胶原蛋白酶抑制率高于EGCG组，其胶原蛋白酶抑制能力较高。
三透明质酸酶抑制试验
紫外线(UV)照射会导致皮肤中透明质酸酶的产生，降解透明质酸，使皮肤发生光老化。
(一)实验系统
1.受试物质：索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物
2.阳性对照：以抗坏血酸为阳性对照。
3.阴性对照：以纯水作为空白对照
(二)实验操作
在6孔板中加入100uL PBS缓冲液，100ul 50mmol/L NaCl溶液，100ul 0.01％BSA与50uL 1％透明质酸酶溶液，再分别加入50uL的1000、800、600、400、200ug/ml的受试物、抗坏血酸和纯水作为培养基，37℃孵育10min。然后加入100uL的透明质酸溶液(0.03％,溶于300mmol/L的磷酸盐溶液,pH＝5.35)作为反应的开始。37℃孵育45min后，未经水解的透明质酸用1.0mL的酸白蛋白溶液(0.1％的BSA溶于24mmo/L的乙酸钠和79mmol/L的乙酸,pH＝3.75)沉淀。室温放置10min后，用酶标仪在600nm处检测该混合物的吸光度，计算抑制率(透明质酸酶抑制率(％)＝(A对照-A实验)/A对照×100％)。结果见表2.3。
表2.3
Figure BDA0003447817270000091
Figure BDA0003447817270000101
结果如图4显示，索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物的透明质酸酶抑制率高于抗坏血酸组，其透明质酸酶抑制能力较高。
综上所述，本发明索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物对弹性蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶均具有抑制作用，可见，本发明索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物具有抗光老化的能力。
实施例3
本实施例进行了3D皮肤模型组织形态分析、Ⅳ型胶原蛋白(COL-Ⅳ)表达试验，本测试以3D全层皮肤模型
Figure BDA0003447817270000102
为测试模型，SSUV为刺激条件，经过样品给药后，检测3D全层皮肤组织形态的变化以及衰老相关蛋白Ⅳ型胶原蛋白(COL-Ⅳ)的表达量变化，进而评价待测样品的抗光老化功效。
1测试系统：本次测试所用3D全层皮肤模型
Figure BDA0003447817270000103
由广东博溪生物科技有限公司生产提供。
2主要试剂：KC2500(广东博溪)、MTT(Sigma)、TA培养液(3D皮肤模型专用培养液)、二甲苯(国药)、无水乙醇(国药)、COL-Ⅳ(Abcam)。
3主要设备：CO2培养箱(Thermo)、超净工作台(苏净安泰)、倒置显微镜(Olympus)、酶标仪(BioTek)、荧光显微镜(Leica)、微量振荡器(其林贝尔)。
4样品信息：所述化妆品的组成：所述化妆品含实施例1索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物8wt％、小分子透明质酸钠1wt％、丙烯酰胺/丙烯酸铵共聚物0.25wt％、乳木果油10wt％、鲸蜡硬脂基葡糖苷5wt％、苯氧乙醇0.8wt％、余量为去离子水。
样品制备方法，包括如下：
(1)将小分子透明质酸钠、丙烯酰胺/丙烯酸铵共聚物、去离子水混合，加热到80～85℃并不断搅拌，使各组分充分搅拌均匀，得到水相物料；
(2)将乳木果油、鲸蜡硬脂基葡糖苷混合，加热到80～85℃并不断搅拌，使各组分充分搅拌均匀，得到油相物料；
(3)将步骤(2)所得油相物料投入步骤(1)所得水相物料中，加热到80～85℃并不断搅拌，使各组分充分搅拌均匀，保温20分钟灭菌，开启冷却水，冷却水温度为25℃，同时不断搅拌；
(4)将步骤(3)的物料降温至45℃加入索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物和苯氧乙醇，继续搅拌使各组分混合均匀；
(4)冷却至30℃～35℃，出料，得到乳黄色流动液体物质。
5实验方法：参照试验分组和试验处理条件(见表2)，在模型出厂即0天时，每天进行SSUV辐照处理(UVA：30J/cm2；UVB：50mJ/cm2)，然后将一定量的样品分别涂布于相应的模型表面(每组取3个模型做平行样)，样品隔天进行涂抹，共作用时长为4天，最后将样品固定，包埋切片并进行H&E染色(组织形态分析)、IHC(COL-Ⅳ)染色分析。采用Image-Pro Plus软件对IHC染色后的各组照片中真表皮连接处黄褐色区域的IOD值(Integrated opticaldensity)进行统计，IOD值可间接反映COL-Ⅳ的表达量；对H&E染色后各组照片紫色细胞核区域的IOD值进行统计，IOD值可间接反映细胞密度。
表3.1试验设计
Figure BDA0003447817270000111
Figure BDA0003447817270000121
6试验结果
6.1组织形态分析结果
根据试验分组，在模型出厂后进行SSUV辐照并进行给药处理，样品隔天给药，总作用时长4天，进行H&E染色，细胞密度分析结果如图5，表3.2所示。
表3.2真表皮细胞密度统计
Figure BDA0003447817270000122
备注：用t-test方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以*表示，p<0.001表示为***；PC组、样品组与NC组相比，显著性以～表示，p<0.01表示为～～，p<0.001表示为～～～。
空白对照组在全程中保持基础液培养。模型出厂开始进行SSUV辐照并给药处理，连续辐照4天后，进行收样检测分析，当受试物作用模型4天后，与阴性对照相比，样品组在浓度0.5％、2.0％时真表皮细胞密度均有显著升高。
6.2Ⅳ型胶原蛋白(COL-Ⅳ)表达结果
根据试验分组，在模型出厂后进行SSUV辐照并进行给药处理，样品隔天给药，总作用时长4天后，进行IHC染色分析，IOD值汇总结果如表3.3，图6。
表3.3 COL-Ⅳ表达量统计
Figure BDA0003447817270000131
备注：用t-test方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以*表示，p<0.01表示为**；PC组、样品组与NC组相比，显著性以～表示，p<0.01表示为～～。
空白对照组在全程中保持基础液培养，模型出厂开始进行SSUV辐照并给药处理，连续辐照4天后，进行收样检测分析。当受试物作用模型4天后，样品组模型的真表皮连接处COL-Ⅳ的表达较阴性对照组有所提高，其中样品组在浓度2.0％时与阴性对照组有显著差异。
基于
Figure BDA0003447817270000141
3D全层皮肤模型的检测结果显示：阴性对照组与空白对照组对比，组织形态、真表皮细胞密度、真表皮连接处COL-Ⅳ的表达有显著下降；PC(Vc+Ve)组与阴性对照组对比，组织形态、真表皮细胞密度、真表皮连接处COL-Ⅳ的表达有一定幅度的上升，表明模型成立。
样品组与阴性对照组对比，样品组浓度为2.0％、0.5％时的组织形态、真表皮细胞密度、COL-Ⅳ表达较阴性对照组均有显著性提升，其中含索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物的浓度为2.0％时的提升作用最为突出，说明含有含索诺拉沙漠芽孢杆菌发酵液提取物的化妆品具有一定的抗光老化的功效。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物在制备抗光老化产品中的应用，所述索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物通过包括以下步骤的制备方法得到：
(1)将索诺拉沙漠芽孢杆菌菌种活化；
(2)活化后进行种子液培养；
(3)将索诺拉沙漠芽孢杆菌液种子液接入发酵罐，于温度为37±0.5℃，溶氧为30±3％，维持发酵罐内的发酵液pH为7.0±0.5中进行发酵；
(4)离心，收集菌体，菌体经重悬，均质破碎，离心收集上清，即得，所述索诺拉沙漠芽孢杆菌的菌株保藏编号为中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC10847，所述抗光老化产品是抗光老化化妆品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述发酵包括：以索诺拉沙漠芽孢杆菌种子液OD600＝0.8，按体积比为1:9～11接种量接入发酵罐，于温度为37±0.5℃，初始搅拌转速为400±50rpm，溶氧为30±3％，维持罐内发酵液pH在7.0±0.5中进行发酵。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述化妆品是医美用品。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述化妆品是护肤品。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述化妆品是美容用品。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述化妆品是液体制剂或霜剂或面膜。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述化妆品是凝露剂。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述化妆品包括以下重量含量的成分，所述索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物1～10％、保湿剂5～20％、增稠剂0.1～1.5％、油脂0％～20％、乳化剂0～8％、防腐剂0.1～1％。
9.一种抗光老化产品，其特征是，所述产品的抗光老化活性物质包括权利要求1-2任一项所述的索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液提取物，所述抗光老化产品是抗光老化化妆品。
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