CN111534455B - 一种乳酸杆菌溶孢产物的制备及其在化妆品的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请属于益生菌溶孢产物技术领域，具体的，本发明涉及一种乳酸杆菌溶孢产物的制备及其在化妆品的应用。本发明提供了一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，包括以下步骤：(1)培养液制备：取一定重量份数的鲜姜，清洗干净后榨汁，过滤收集姜汁；在姜汁中加入纤维素酶和淀粉酶，调节pH为4.0‑5.5，温度为30‑60℃，水浴15‑30min，离心、收集上清液；在上清液加入葡萄糖，调节pH至6.0‑7.0，灭菌，得培养液；(2)纯种活化；将乳酸杆菌接于MRS斜面培养基上活化，35‑40℃培养20‑28h，再将斜面活化后的菌种按1‑2％的添加量接于MRS液体试管培养基中，摇瓶200‑250rpm、35‑40℃培养20‑28h，作为种子培养基；(3)发酵培养；(4)溶胞物制备。

Description

一种乳酸杆菌溶孢产物的制备及其在化妆品的应用
技术领域
本申请属于益生菌溶孢产物技术领域，具体的，本发明涉及一种乳酸杆菌溶孢产物的制备及其在化妆品的应用。
背景技术
益生菌的概念由诺贝尔奖获得者伊力亚.梅契尼科夫首次提出的理论发展而来。益生菌是指经口或其他粘膜途径摄入，通过改善粘膜表面微生物或酶的平衡，刺激特异性或非特异性免疫机制而发挥作用的微生物制剂。人体内对人有益的细菌主要有：乳酸菌，双歧杆菌，酵母菌等。
最近由于益生菌科学的飞速发展、益生菌的功效从原有的促进消化功能、到医学领域的防止过敏、癌症、感染、改善胆固醇的代谢等。不仅仅通过改善肠内道菌群的平衡来起到保健作用、而且益生菌对人或动植物的直接作用十分明显。益生菌不仅可以用在食品上、它的发酵产物在化妆品上也被广泛应用。现代研究表明益生菌技术能消除高达50％的皮肤损伤，并激活细胞再生至70％。益生菌还能刺激皮肤的免疫系统并恢复其天然防御，起到滋润、防止胶原蛋白的破坏及减缓衰老的效果。
近年来，对皮肤微生态环境的研究，为护肤产品的开发提供了重要方向。当产生皮肤问题时，利用调节皮肤菌群平衡来改善皮肤状态；益生菌制剂及衍生物可代替抗生素等药物制剂，因为抗生素在杀死致病菌的同时，也影响了益生菌的保护作用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，包括以下步骤：(1)培养液制备：取一定重量份数的鲜姜，清洗干净后榨汁，过滤收集姜汁；在姜汁中加入纤维素酶和淀粉酶，调节pH为4.0-5.5，温度为30-60℃，水浴15-30min，离心、收集上清液；在上清液加入葡萄糖，调节pH至6.0-7.0，灭菌，得培养液；
(2)纯种活化；将乳酸杆菌接于MRS斜面培养基上活化，35-40℃培养20-28h，再将斜面活化后的菌种按1-2％的添加量接于MRS液体试管培养基中，摇瓶200-250rpm、35-40℃培养20-28h，作为种子培养基；
(3)发酵培养：取步骤(2)活化得到的种子培养基加入步骤(1)制备的培养液中，设置发酵温度35-40℃，搅拌转速50-150rpm，发酵时间22-26h，得发酵液；
(4)溶胞物制备：取发酵液高速离心，收集菌体沉淀；用蒸馏水均匀分散菌体沉淀，然后加入1-5wt％微生物多糖，用高压破碎机低温破碎，即得乳酸杆菌溶孢产物。
作为一种优选的技术方案，步骤(1)中，所述纤维素酶和淀粉酶的加入量为姜汁的0.5-2wt％。
作为一种优选的技术方案，所述纤维素酶和淀粉酶的重量比为1：2-4。
作为一种优选的技术方案，步骤(1)中，所述葡萄糖的加入量为上清液的1-3wt％。
作为一种优选的技术方案，步骤(3)中，所述种子培养基的加入量为培养液的5-10wt％。
作为一种优选的技术方案，步骤(4)中，所述菌体沉淀的重量为蒸馏水的3-10wt％。
作为一种优选的技术方案，步骤(4)中，微生物多糖加入量为1-5wt％。
作为一种优选的技术方案，所述微生物多糖选自普鲁兰多糖、海藻糖、壳聚糖、透明质酸中的至少一种。
本发明的第二方面提供了所述的制备方法得到的乳酸杆菌溶孢产物。
本发明的第三方面提供了一种护肤组合物，包括所述乳酸杆菌溶孢产物。
有益效果：本发明采用姜汁作为培养基，制备的乳酸杆菌发酵产物溶孢物，具有调控KLK7蛋白正常表达的效果，从而加快角质更新，具有提亮、改善皮肤色素沉着等功效。而且本发明制备方法简单，市场前景广阔，适合规模化生产。
附图说明
图1为实施例1的乳酸杆菌溶孢产物对KLK7的表达示意图。
具体实施方式
为了解决上述问题，本发明提供了一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，包括以下步骤：
(1)培养液制备：取一定重量份数的鲜姜，清洗干净后榨汁，过滤收集姜汁；在姜汁中加入纤维素酶和淀粉酶，调节pH为4.0-5.5，温度为30-60℃，水浴15-30min，离心、收集上清液；在上清液加入葡萄糖，调节pH至6.0-7.0，灭菌，得培养液；
(2)纯种活化；将乳酸杆菌接于MRS斜面培养基上活化，35-40℃培养20-28h，再将斜面活化后的菌种按1-2％的添加量接于MRS液体试管培养基中，摇瓶200-250rpm、35-40℃培养20-28h，作为种子培养基；
(3)发酵培养：取步骤(2)活化得到的种子培养基加入步骤(1)制备的培养液中，设置发酵温度35-40℃，搅拌转速50-150rpm，发酵时间22-26h，得发酵液；
(4)溶胞物制备：取发酵液高速离心，收集菌体沉淀；用蒸馏水均匀分散菌体沉淀，然后加入微生物多糖，用高压破碎机低温破碎，即得乳酸杆菌溶孢产物。
步骤(1)
本申请中，所述过滤滤膜没有特别限制，所述步骤(1)中粗过滤采用微孔滤膜，膜的孔径为0.02-0.2μm。
所述纤维素酶和淀粉酶的加入量为姜汁的0.5-2wt％；所述纤维素酶和淀粉酶的重量比为1：2-4。
所述pH调节剂无特别限制，能调节pH为所需值而不影响本发明目的即可，本申请中，所述pH调节剂为柠檬酸。
所述灭酶和灭菌的条件无特别限制，本申请中，90℃灭酶；115℃灭菌15min。
作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)中，所述葡萄糖的加入量为上清液的1-3wt％。
所述纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶。所述淀粉酶能够催化淀粉及糖原水解，生成葡萄糖、麦芽糖等。本发明采用姜汁作为培养基，通过纤维素酶和淀粉酶处理，水解细胞壁，充分释放其中营养物质，为乳酸菌提供有益的生长环境。
步骤(2)
优选的，纯种活化步骤包括：将植物乳杆菌接于MRS液体培养基中活化，37℃培养24h；再将斜面活化后的菌种按1-2％的添加量接于MRS液体试管培养基中，摇瓶200-250rpm、37℃培养24h，作为种子培养基。
所述MRS培养基无特别限制，可以自制也可以购买。
本申请中，MRS培养基组分包括蛋白胨10.0g；牛肉膏10.0g；酵母膏5.0g；柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0g；葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g；吐温80 1.0mL；乙酸钠5.0g；磷酸氢二钾2.0g；硫酸镁0.58g；硫酸锰0.25g；琼脂18.0g；蒸馏水1 000mL；pH 6.2～6.6。
步骤(3)
优选的，取步骤(2)活化得到的种子培养基加入步骤(1)制备的培养液中，设置发酵温度37℃，搅拌转速50-150rpm，发酵时间22-26h，得发酵液；
优选的，步骤(3)中，所述种子培养基的加入量为培养液的5-10wt％。
步骤(4)
优选的，步骤(4)中，所述菌体沉淀的重量为蒸馏水的3-10wt％。
优选的，步骤(4)中，微生物多糖加入量为1-5wt％。
所述“微生物多糖加入量为1-5wt％”指的是微生物多糖的加入量为蒸馏水和菌体沉淀总量的1-5wt％。
作为一种优选的实施方式，所述高速离心的转速为5000-8000r/min。
所述微生物多糖选自普鲁兰多糖、海藻糖、壳聚糖、透明质酸中的至少一种。
所述低温破碎的破碎压力为120-180MPa，温度2-6℃，破碎次数1-3次。
本申请的第二方面提供了所述制备方法得到的乳酸杆菌溶孢产物。
本申请的第三方面提供了一种护肤组合物，包括所述乳酸杆菌溶孢产物。
所述护肤组合物包括但不限于洗面奶、护肤水、面膜、面霜、精华水、喷雾、防晒霜。
本发明采用姜汁作为培养基，制备的乳酸杆菌发酵产物溶孢物，具有调控KLK7蛋白正常表达的效果，从而加快角质更新，具有提亮、改善皮肤色素沉着等功效。而且本发明制备方法简单，市场前景广阔，适合规模化生产。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售得到的。
实施例
实施例1
一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，包括以下步骤：
(1)培养液制备：取一定重量份数的鲜姜，清洗干净后榨汁，过滤收集姜汁；在姜汁中加入纤维素酶和淀粉酶，调节pH为5.0，温度为40℃，水浴30min，离心、收集上清液；在上清液加入葡萄糖，调节pH至6.0，灭菌，得培养液；
(2)纯种活化；将乳酸杆菌接于MRS斜面培养基上活化，35℃培养28h，再将斜面活化后的菌种按1％的添加量接于MRS液体试管培养基中，摇瓶200rpm、35℃培养20h，作为种子培养基；
(3)发酵培养：取步骤(2)活化得到的种子培养基加入步骤(1)制备的培养液中，设置发酵温度35℃，搅拌转速50rpm，发酵时间26h，得发酵液；
(4)溶胞物制备：取发酵液高速离心，收集菌体沉淀；用蒸馏水均匀分散菌体沉淀，然后加入1wt％微生物多糖普鲁兰多糖，用高压破碎机低温破碎，即得乳酸杆菌溶孢产物。
步骤(1)中，所述纤维素酶和淀粉酶的加入量为姜汁的0.5wt％；所述纤维素酶和淀粉酶的重量比为1：2；所述pH调节剂为柠檬酸；所述葡萄糖的加入量为上清液的1wt％；
步骤(3)中，所述种子培养基的加入量为培养液的10wt％。
步骤(4)中，所述菌体沉淀的重量为蒸馏水的5wt％，微生物多糖加入量为5wt％。所述高速离心的转速为5000r/min；所述低温破碎的破碎压力为150MPa，温度6℃，破碎次数2次。
实施例2
一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，包括以下步骤：
(1)培养液制备：取一定重量份数的鲜姜，清洗干净后榨汁，过滤收集姜汁；在姜汁中加入纤维素酶和淀粉酶，调节pH为5.0，温度为60℃，水浴15min，离心、收集上清液；在上清液加入葡萄糖，调节pH至7.0，灭菌，得培养液；
(2)纯种活化；将乳酸杆菌接于MRS斜面培养基上活化，40℃培养20h，再将斜面活化后的菌种按2％的添加量接于MRS液体试管培养基中，摇瓶250rpm、40℃培养20h，作为种子培养基；
(3)发酵培养：取步骤(2)活化得到的种子培养基加入步骤(1)制备的培养液中，设置发酵温度40℃，搅拌转速150rpm，发酵时间22h，得发酵液；
(4)溶胞物制备：取发酵液高速离心，收集菌体沉淀；用蒸馏水均匀分散菌体沉淀，然后加入5wt％微生物多糖普鲁兰多糖，用高压破碎机低温破碎，即得乳酸杆菌溶孢产物。
步骤(1)中，所述纤维素酶和淀粉酶的加入量为姜汁的2wt％；所述纤维素酶和淀粉酶的重量比为1：4；所述pH调节剂为柠檬酸；所述葡萄糖的加入量为上清液的3wt％；
步骤(3)中，所述种子培养基的加入量为培养液的10wt％。
步骤(4)中，所述菌体沉淀的重量为蒸馏水的5wt％，微生物多糖加入量为1wt％。所述高速离心的转速为5000r/min；所述低温破碎的破碎压力为120MPa，温度6℃，破碎次数2次。
对比例1
一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于，
(1)培养基预处理：在水中加入纤维素酶和淀粉酶，调节pH为5.0，温度为40℃，水浴30min，离心、收集上清液；加入1wt％葡萄糖，调节pH至6.0，灭菌，得培养液；
对比例2
一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于，(1)培养基预处理：鲜雪莲果榨汁，采用微孔滤膜粗过滤，除去粗杂质收集滤液；加入纤维素酶和淀粉酶，调节pH为5.0，温度为40℃，水浴30min，离心、收集上清液；加入1wt％葡萄糖，调节pH至6.0，灭菌，得雪莲果预处理液；
对比例3
一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于，所述纤维素酶和淀粉酶的重量比为1：1。
对比例4
一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于，所述纤维素酶和淀粉酶的重量比为1：6。
对比例5
一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于，步骤(1)中，所述葡萄糖的加入重量为0.5wt％。
对比例6
一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于，步骤(4)中，所述菌体沉淀的重量为蒸馏水的0.5wt％。
对比例7
一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于，步骤(4)中，所述菌体沉淀的重量为蒸馏水的15wt％。
对比例8
一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于，所述微生物多糖加入比例为0.5wt％。
性能测试
(1)测试实施例及对比例产品对角化相关基因(激肽释放酶相关肽酶KLK7)表达的影响。
角质细胞不断从角质层表面脱落，对于维持角质层的稳态具有重要意义。角质细胞的脱落主要受激肽释放酶相关肽酶的调控，KLK7具有糜蛋白酶活性，可以裂解桥粒芯胶蛋白和角质桥粒蛋白，是角质更新的重要调节蛋白。KLK7蛋白的正常表达，可以保证角质层的正常脱落。
测试方法：取生长状态良好的HaCaT细胞铺6孔板培养24h后，更换为含有受检样品的培养基，24h后用TRIzon提取总RNA，并采用NanoDrop进行RNA纯度和浓度检测。随后通过cDNA合成试剂得到cDNA链并进行PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳分析确认有目的基因条带。最后将cDNA链用于Real-Time PCR定量检测，得出样品对角化相关基因(激肽释放酶相关肽酶KLK7)表达的影响。以蒸馏水做空白对照。
如图1，实施例1的乳酸杆菌溶孢产物对KLK7的表达有一定促进作用，基因的表达量为220％，与对照组有显著性差异。
Figure BDA0002436193490000071
Figure BDA0002436193490000081
(2)促进角质更新测试
角蛋白是角化细胞中的主要成分，也是角质层中数量最多的蛋白。故采用胶带撕拉的方式，获得的胶带上的蛋白质的数量，即代表了角化细胞的数量；角化细胞间结合力与角质更新成反比，即角质更新快，撕拉下来的角蛋白数量越多。将3％实施例及对比例得到的乳酸杆菌溶孢产物加入基料中，人群试用，用胶带撕拉方式测定蛋白的方式，考察其促进角质更新的效果。
方法：10名受试者，45-60岁，在前臂中划定区域，使用产品和基料，每天2次，持续使用28天。对使用产品处皮肤进行胶带撕拉测试，每个部位采集18条胶带，将胶带按照1-6,7-12,13-18先后顺序标记，按照分成3组，提取并测定胶带上的蛋白质总量。
Figure BDA0002436193490000082
Figure BDA0002436193490000091
结果：与基料对照处理相比，加入溶孢产物的成品，各胶带上蛋白变化更明显。前6条胶带蛋白含量较高，即角化细胞较多，最后6条胶带上蛋白含量较低，说明使用产品后角化速度加快，说明植物发酵产物溶孢物具有加快皮肤更新、有效促进死皮脱落的功效。
(3)人群试用
样品：面膜基础配方中加入5％实施例1-2所述的植物乳杆菌发酵产物溶孢物。
方法：选15名受试者(平均年龄29岁；最低年龄21岁，最高年龄49岁；干性2人，中性1人，油性3人，混合偏干2人，混合偏油7人，其中敏感肌1人)，用产品之前采集皮肤初始值(初始水分、黑色素、颜色、弹性指标)，两天使用一片面膜，使用2周后回访，并采集受试者皮肤的数据，与初始值对比分析。
结果：植乳发酵产物溶孢物具有明显提亮肤色、提升皮肤角质层水分、增加皮肤弹性、提升皮肤状态的功效。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或更改为等同变化的等效实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种乳酸杆菌溶孢物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养液制备：取一定重量份数的鲜姜，清洗干净后榨汁，过滤收集姜汁；在姜汁中加入纤维素酶和淀粉酶，调节pH为4.0-5.5，温度为30-60℃，水浴15-30min，离心、收集上清液；在上清液加入葡萄糖，调节pH至6.0-7.0，灭菌，得培养液；
(2)纯种活化：将乳酸杆菌接于MRS斜面培养基上活化，35-40℃培养20-28h，再将斜面活化后的菌种按1-2％的添加量接于MRS液体试管培养基中，摇瓶200-250rpm、35-40℃培养20-28h，作为种子培养基；
(3)发酵培养：取步骤(2)活化得到的种子培养基加入步骤(1)制备的培养液中，设置发酵温度35-40℃，搅拌转速50-150rpm，发酵时间22-26h，得发酵液；
(4)溶胞物制备：取发酵液高速离心，收集菌体沉淀；用蒸馏水均匀分散菌体沉淀，然后加入微生物多糖，用高压破碎机低温破碎，即得乳酸杆菌溶孢产物；
步骤(1)中，所述纤维素酶和淀粉酶的重量比为1：2-4；
所述葡萄糖的加入量为上清液的1-3wt％；
步骤(4)中，所述菌体沉淀的重量为蒸馏水的3-10wt％；
所述微生物多糖加入量为1-5wt％。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述纤维素酶和淀粉酶的加入量为姜汁的0.5-2wt％。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述种子培养基的加入量为培养液的5-10wt％。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微生物多糖选自普鲁兰多糖、海藻糖、壳聚糖、透明质酸中的至少一种。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的乳酸杆菌溶孢产物。
6.一种护肤组合物，包括权利要求1-4任一项所述乳酸杆菌溶孢产物。
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