CN106399192A

CN106399192A - 一种乳酸菌发酵溶胞产物、制备方法及其应用

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Publication number: CN106399192A
Application number: CN201610934333.0A
Authority: CN
Inventors: 方曙光; 占英英; 姜甜; 冯胜鹏
Original assignee: Jiangsu Wecare Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Wecare Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2017-02-15

Abstract

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种乳酸菌发酵溶胞产物、制备方法及其应用；一种乳酸菌发酵溶胞产物，其有效成分经过乳酸菌菌种于种子培养基中扩培后，于发酵培养基中发酵而得的初始体系，经离心、乳化和灭活处理后，制备而成，其中，乳酸菌包括乳杆菌中的一种或多种、以及双歧杆菌中的一种或多种；本发明的乳酸菌发酵溶胞产物，可用于多种化妆品中，能有效促进皮肤更新、减少黑色素合成、具有美白功效、能有效清除自由基、改善真皮组织生理功能，具有抗衰功效、且安全性较高。

Description

一种乳酸菌发酵溶胞产物、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种乳酸菌发酵溶胞产物、制备方法及其应用。

背景技术

目前全球工业化和城市化对环保的影响很大，各国人民普遍关注污染问题。表现在美容护肤品上，就是人们寻找具有高科技含量、有益肌肤健康又不受化学品污染的生物技术护肤品。另外，随着人们安全意识的提高，为避免对皮肤的不良影响，人们更倾向于选择安全性高的皮肤护理产品。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种能有效促进皮肤更新、减少黑色素合成、具有美白功效、能有效清除自由基、改善真皮组织生理功能，具有抗衰功效、且安全性较高的乳酸菌发酵溶胞产物、制备方法及其应用。

本发明第一方面提供一种乳酸菌发酵溶胞产物，其有效成分为：乳酸菌菌种于种子培养基中扩培后，于发酵培养基中发酵而得的初始体系，经离心、乳化和灭活处理后，得到的溶胞产物。

进一步的，所述乳酸菌包括乳杆菌中的一种或多种、以及双歧杆菌中的一种或多种。应当说明的是，由于乳杆菌和双歧杆菌的培养条件有一定差别，优选的，乳杆菌采取兼性厌氧培养，双歧杆菌采取厌氧培养，因而，乳杆菌和双歧杆菌优选的分别扩培、发酵并离心后，再混合乳化灭菌处理。

进一步的，所述乳杆菌包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌；所述双歧杆菌包括乳双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌。

进一步的，所述种子培养基包括如下比例的各组分：

葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、酵母膏5g、无水乙酸钠5g、吐温-80 1ml、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.58g、一水硫酸锰0.19g、加水至1000ml。

进一步的，所述发酵培养基以质量分数计包括：

葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉浸粉0.5％、酵母膏1％、无水乙酸钠0.5％、吐温-800.1％、柠檬酸氢二铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、七水硫酸镁0.058％、一水硫酸锰0.019％、L-半胱氨酸盐酸盐0.1％。

本发明第二方面提供一种乳酸菌发酵溶胞产物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将乳酸菌菌种分别于种子培养基中扩培，所述乳酸菌包括乳杆菌中的一种或多种、以及双歧杆菌中的一种或多种；

S2、将扩培的乳杆菌和双歧杆菌种子分别接种至发酵培养基中发酵，得到发酵液；

S3、将发酵液离心处理，得到菌泥；

S4、根据菌泥质量添加保护剂，高速搅拌以充分乳化，得到乳化液；

S5、将乳化液高温灭菌，得到乳酸菌发酵溶胞产物。

进一步的，步骤S1中，乳酸菌菌种以占比种子培养基1％-10％的接种量接种于种子培养基中，接种温度为35-45℃，种子成熟OD为2.0-5.0，pH<5.0，乳杆菌采取兼性厌氧培养，双歧杆菌采取厌氧培养。

进一步的，步骤S2中，将步骤S1扩培后的种子，按照占比发酵培养基1％-10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵温度37℃，控制起始pH6.0-7.0、发酵pH 4.5-6.0、搅拌转速60-100r/min、发酵时间7-10h、放罐OD7-10。

进一步的，步骤S3中，控制发酵液离心转数为5000-10000r/min，离心半径为6-12cm，离心时间为15-30min，离心后倒掉上清液得到菌泥。

进一步的，步骤S4中，将乳杆菌和双歧杆菌菌泥进行混合，混合比例1:1-1:10，根据混合菌泥质量，按照1:1-1:10添加保护剂，经高速搅拌器进行充分乳化。

进一步的，步骤S5中，乳化液高温湿热灭菌温度95-121℃，灭菌时间15-30min。

本发明第二方面提供一种乳酸菌发酵溶胞产物，在化妆品中的应用。

应当说明的是，所述化妆品应包括但不限于乳液、唇、唇彩、化妆水、面膜、面霜、精华露、软膏、摩丝、贴剂、发蜡、溶液、喷雾剂、蜡基棒状物或湿纸巾；尤其是在面霜、精华露中的应用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

乳酸菌发酵溶胞产物是乳酸菌菌体与保护剂进行乳化灭菌而得到的，该2种原料都是可食用的，且在整个制备过程中，发酵温度和发酵pH温和，且不添加任何有机试剂，确保产品对人体的安全。乳酸菌发酵溶胞产物富含功能性大分子肽聚糖、酯磷壁酸、益生菌源脱氧核糖核酸(DNA)等成分，能有效促进皮肤更新、减少黑色素合成，具有美白功效。另外，其还富含益生菌的超氧化物歧化酶、细菌素、益生菌源活性肽，能有效清除自由基、改善真皮组织生理功能，具有抗衰功效，从而对皮肤具有较强的美白、抗衰功能。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明中GC-MS分析乳酸菌发酵溶胞产物结果图；

图2是本发明中乳酸菌发酵溶胞产物对DPPH自由基清除作用曲线图；

图3是本发明中乳酸菌发酵溶胞产物的抑制酪氨酸酶活性示意图；

图4是本发明中乳酸菌发酵溶胞产物对色斑数量改善结果图；

图5是本发明中乳酸菌发酵溶胞产物对面部黑色素数值降低程度结果图；

图6是本发明中乳酸菌发酵溶胞产物对皱纹数量减少程度结果图；

图7是本发明中乳酸菌发酵溶胞产物对皮肤平滑度改善程度结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1乳酸菌发酵溶胞产物制备

本实施例提供一种乳酸菌发酵溶胞产物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将乳酸菌菌种分别于种子培养基中扩培，所述乳酸菌包括乳杆菌中的一种或多种、以及双歧杆菌中的一种或多种；其中，

种子培养基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、酵母膏5g、无水乙酸钠5g、吐温-80 1ml、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.58g、一水硫酸锰0.19g、加水至1000ml，调pH至6.8，灭菌118℃，20min；

S2、将扩培的乳杆菌和双歧杆菌种子分别接种至发酵培养基中发酵，得到发酵液；发酵温度：37℃、控制起始pH:6.8、发酵pH:5.5搅拌转速：80r/min；其中，

发酵培养基：葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉浸粉0.5％、酵母膏1％、无水乙酸钠0.5％、吐温-80 0.1％、柠檬酸氢二铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、七水硫酸镁0.058％、一水硫酸锰0.019％、L-半胱氨酸盐酸盐0.1％。发酵时间：8.5h，放罐OD：9.5；

S3、将发酵液离心处理，离心转速6500r/min，时间15min，倾倒上清液收集菌泥；

S4、将乳杆菌和双歧杆菌菌泥进行混合，混合比例1:1-1:10，根据混合菌泥质量，按照1:1-1:10添加保护剂，保护剂成分：5-50％海藻糖，优选28％海藻糖，经高速搅拌器进行充分乳化，得到乳化液；

S5、将乳化液高温湿热灭菌，温度95-121℃，灭菌时间15-30min，得到乳酸菌发酵溶胞产物。

实施例2乳酸菌发酵溶胞产物在化妆品中的应用

一、乳酸菌发酵溶胞产物的性质

实施例1制备所得的乳酸菌发酵溶胞产物，外观为澄清液体、颜色为透明至淡黄色，pH值5.0-6.0，可溶性固含物含量15-25％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，因此，该发酵提取物符合化妆品质量要求。

采用高效液相色谱(HLPC)技术,研究了乳酸菌发酵溶胞产物的相关成分，具体数据如下：

苹果酸：0.32g/100mL，乳酸：1.90g/100mL，乙酸：2.99g/100mL。

维生素含量：维生素B1：0.013mg/100g，维生素B2：0.285mg/100g，维生素B6：0.0211mg/ml，维生素C：0.0134mg/ml。

氨基酸含量：苏氨酸：0.019g/100g，谷氨酸：0.103g/100g，组氨酸：0.048g/100g，天冬氨酸：0.025g/100g，胱氨酸：0.026g/100g，异亮氨酸：0.004g/100g，酪氨酸：0.029g/100g。

用GC-MS分析乳酸菌发酵溶胞产物的化学成分，具体如表1和图1所示：

表1 GC-MS分析乳酸菌发酵溶胞产物的化学成分表

二、乳酸菌发酵溶胞产物的安全性检测

人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1获得的乳酸菌发酵溶胞产物进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。

1、试验对象

选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。

2、试验方法

称取0.020g-0.025g固体样品或半固体的样品放入斑试器中备用。将液体样品0.2mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油。试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。

3、试验结果

斑贴试验结果如表2所示："-"＝阴性反应；"±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；"+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；"++"＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；"+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。

根据化妆品卫生规范2007，人体斑贴试验判断标准为：30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或二级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例三级或三级以上皮肤不良反应时，则判定受试物对人体有不良反应，反之，则视为对人体无不良反应。

从表2中可以看出：实施例1得到的乳酸菌发酵溶胞产物未产生可疑反应，说明本发明提供的乳酸菌发酵溶胞产物均具有安全性，不会给人体带来不良反应。

表2乳酸菌发酵溶胞产物的斑贴试验结果

三、乳酸菌发酵溶胞产物的抗氧化性能检测

DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。

DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：

以实施例1所得乳酸菌发酵溶胞产物作为待测物；

(1)取等体积(一般为3mL)的待测物与2×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀(A1管)；

(2)取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀(A2管)；

(3)取等体积的无水乙醇与待测物混匀(A3管)；

(4)反应30min后，在517nm下测A1、A2、A3管吸光度值。

清除率计算公式为：清除率(％)＝[(A2+A3)-A1]/A2

做出乳酸菌发酵溶胞产物对DPPH自由基清除作用曲线，见图2。

由图可知，实施例1所得乳酸菌发酵溶胞产物对DPPH清除作用的IC50＝8.6％，说明乳酸菌发酵溶胞产物具有较强的抗氧化能力，可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。

三、乳酸菌发酵溶胞产物的美白功效分析

酪氨酸酶是黑素生成的关键酶，它控制着黑素的形成过程,其活性程度对色素的沉积起主要作用。目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用,故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白化妆品的主要指标。

通过测定样品对酪氨酸酶的影响来评价样品的美白功能，具体方法如下：

按表3配置溶液：

表3、溶液配制列表

单位(mL)	C1	C2	T1	T2
					L-酪氨酸	2	2	2	2
样品	0	0	2	2
					PBS	4	5	2	3
酪氨酸酶	1	0	1	0
					总体积	7	7	7	7

注：C1和T1加入1mL酪氨酸酶，酶活为100U/mL；

样品为实施例1所得乳酸菌发酵溶胞产物；

(1)C2管配好摇匀后，在37℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调零。

(2)C1管溶液配好摇匀，37℃水浴10min后，加酪氨酸酶1ml，继续水浴10分钟，测定C1吸光度值。

(3)按(1)(2)同样方法，以T2调零测定T1吸光度值。

(4)计算样品对酪氨酸酶的活性抑制率T(％)：

T(％)＝(C1-T1)/C1×100％

实验证明，本发明实施例1所得10％乳酸菌发酵溶胞产物对酪氨酸酶活性的抑制率为38.46％，1％的熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率98.12％，如图3所示，即本发明提供的10％乳酸菌发酵溶胞产物的美白效果相当于0.392％的熊果苷的效果，具有一定的美白功效。

四、乳酸菌发酵溶胞产物化妆品人体测试

方法：分别各选20名年龄在28-50岁之间的女性志愿者使用含10％、20％乳酸菌发酵溶胞产物的面膜，以不含乳酸菌发酵溶胞产物的基质配方作为空白对照，每天晚上使用1次。使用VISIA全脸分析仪拍照分析，使用MPA580皮肤测试仪分析黑色素数值。

结果：乳酸菌发酵溶胞产物可显著降低皮肤色斑数量，提亮肤色，减轻皱纹数量和程度，提高平滑度，使肌肤年轻化。

1.祛斑与亮肤效果

如图4所示，乳酸菌发酵溶胞产物使用4周色斑数量已有显著改善，如图5所示，使用6周后皮肤黑色素数值有显著下降。

2.抚平皱纹效果

如图6所示，乳酸菌发酵溶胞产物具有显著的促进皮肤年轻化效果，使用4周后，不同浓度处理组皱纹数量均有极显著降低。

3.改善皮肤平滑度

如图7所示，乳酸菌发酵溶胞产物可快速改善皮肤平滑度，使用2周后有显著改善。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种乳酸菌发酵溶胞产物，其特征在于：其有效成分为：乳酸菌菌种于种子培养基中扩培后，于发酵培养基中发酵而得的初始体系，经离心、乳化和灭活处理后，得到的溶胞产物；所述乳酸菌包括乳杆菌中的一种或多种、以及双歧杆菌中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的乳酸菌发酵溶胞产物，其特征在于：所述乳杆菌包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌；所述双歧杆菌包括乳双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌。

3.根据权利要求1所述的乳酸菌发酵溶胞产物，其特征在于：所述种子培养基包括如下比例的各组分：

4.根据权利要求1所述的乳酸菌发酵溶胞产物，其特征在于：所述发酵培养基以质量分数计包括：

5.一种乳酸菌发酵溶胞产物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S3、将发酵液离心处理，得到菌泥；

S5、将乳化液高温灭菌，得到乳酸菌发酵溶胞产物。

6.根据权利要求5所述的乳酸菌发酵溶胞产物的制备方法，其特征在于：步骤S1中，乳酸菌菌种以占比种子培养基1％-10％的接种量接种于种子培养基中，接种温度为35-45℃，种子成熟OD为2.0-5.0，pH<5.0，乳杆菌采取兼性厌氧培养，双歧杆菌采取厌氧培养。

7.根据权利要求5所述的乳酸菌发酵溶胞产物的制备方法，其特征在于：步骤S2中，将步骤S1扩培后的种子，按照占比发酵培养基1％-10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵温度37℃，控制起始pH6.0-7.0、发酵pH 4.5-6.0、搅拌转速60-100r/min、发酵时间7-10h、放罐OD7-10。

8.根据权利要求5所述的乳酸菌发酵溶胞产物的制备方法，其特征在于：步骤S3中，控制发酵液离心转数为5000-10000r/min，离心半径为6-12cm，离心时间为15-30min，离心后倒掉上清液得到菌泥。

9.根据权利要求5所述的乳酸菌发酵溶胞产物的制备方法，其特征在于：步骤S4中，将乳杆菌和双歧杆菌菌泥进行混合，混合比例1:1-1:10，根据混合菌泥质量，按照1:1-1:10添加保护剂，经高速搅拌器进行充分乳化。

10.一种乳酸菌发酵溶胞产物，其特征在于：在化妆品中的应用。