CN114317617A - 具有抗皱功效的三重益生菌发酵复合物制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有抗皱功效的三重益生菌发酵复合物制备方法及其应用，属于微生物发酵技术领域。本发明将双歧杆菌Bicilia‑B01的溶胞物、植物乳杆菌Bicilia‑Lp01的发酵上清液、嗜酸乳杆菌Bicilia‑La01的溶胞物按最佳配比组合形成具有抗皱功效的三重乳酸发酵复合物，该复合物能够使得成纤维细胞中丝聚蛋白含量升高，达到抗皱的目的。

Description

具有抗皱功效的三重益生菌发酵复合物制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及具有抗皱功效的三重益生菌发酵复合物制备方法及其应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
真皮是皮肤的一层，位于表皮之下，主要由结缔组织组成，主要由纤维(胶原蛋白和弹性蛋白纤维)和纤维外基质(基质)组成。成纤维细胞是真皮中最常见的细胞类型，它们合成包括胶原蛋白和弹性蛋白在内的细胞外基质。胶原蛋白和弹性蛋白纤维在维持正常皮肤的紧致和弹性方面起着关键作用。一般来说，胶原蛋白和弹性蛋白纤维形成三维结构。胶原蛋白，尤其是I型胶原蛋白，约占皮肤结缔组织的90％。皮肤的结缔组织含有弹性蛋白和胶原蛋白。弹性蛋白仅占结缔组织的约3.4％，胶原蛋白和弹性蛋白起到保持皮肤的形状和紧致皮肤的效果。胶原蛋白酶的增加导致弹性蛋白的降解，而弹性蛋白酶会使得皮肤结缔组织中的弹性蛋白降解，从而影响皮肤的弹性，导致皱纹的产生。
因此，抑制胶原蛋白酶和弹性蛋白酶的活性，减少皮肤中胶原蛋白和弹性蛋白的降解，可以对皮肤起到抗皱的效果。
益生菌被认为是一种非致病性的食品级微生物，通过调节肠道菌群为人体健康保驾护航。大量文献报道证明，活性益生菌以多种方式表现出抗氧化、螯合金属离子、产生抗氧化物、调节信号通路上调抗氧化活性、下调ROS诱导的酶作用。乳酸菌是益生菌的主要代表，益生菌的发酵产物对体内酶活的调节作用，具有很高的研究和应用价值。目前，益生菌主要应用在食品中，保护人体肠道的安全；在人体皮肤上的应用报道较少，对于益生菌在抗皱方面的研究更少。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是：单一的益生菌发酵物很难达到理想的抗皱效果。
[技术方案]
本发明采用耐高渗筛选机制，筛选得到具有抑制胶原蛋白酶、弹性蛋白酶活性的三株乳酸菌。通过对三株菌的发酵物进行筛选和协同增效配比，得出具有显著抑制胶原蛋白酶和弹性蛋白酶的三重益生菌发酵复合物，增加了益生菌在人体皮肤抗皱研究中的应用实例。
本发明提供一种双歧杆菌Bicilia-B01(Bifidobacterium sp.Bicilia-B01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021469。
所述双歧杆菌Bicilia-B01具有耐受高渗的特性，在耐高渗(高盐、高糖)益生菌筛选培养基中于37℃条件下培养24h，OD600可以达到1.9。
所述双歧杆菌的培养方法是，于厌氧手套箱中，挑取双歧杆菌Bicilia-B01单菌落接种至装有400mL无菌益生菌培养基的摇瓶中，摇瓶规格为500mL，放置在厌氧培养箱中，37℃培养24h。
本发明提供一种植物乳杆菌Bicilia-Lp01(Lactobacillus plantarum Bicilia-Lp01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021472。
所述植物乳杆菌Bicilia-Lp01具有耐受高渗的特性，在耐高渗(高盐、高糖)益生菌筛选培养基中于37℃条件下培养24h，OD600可以达到2.58。
所述植物乳杆菌的培养方法是于厌氧手套箱中，挑取植物乳杆菌单菌落接种至装有400mL无菌益生菌培养基的摇瓶中，摇瓶规格为500mL，放置在厌氧培养箱中，37℃培养24h。
本发明提供一种嗜酸乳杆菌Bicilia-La01(Lactobacillus acidophilusBicilia-La01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021471。
所述嗜酸乳杆菌Bicilia-La01具有耐受高渗的特性，在耐高渗(高盐、高糖)益生菌筛选培养基中于37℃条件下培养24h，OD600可以达到3.21。
所述嗜酸乳杆菌的培养方法是，于厌氧手套箱中，挑取嗜酸乳杆菌单菌落接种至装有400mL无菌益生菌培养基的摇瓶中，摇瓶规格为500mL，放置在厌氧培养箱中，37℃培养24h。
本发明还提供具有抗皱功能的组合物，所述组合物包含双歧杆菌Bicilia-B01的溶胞物、植物乳杆菌Bicilia-Lp01的发酵上清液、嗜酸乳杆菌Bicilia-La01的溶胞物，三者的质量比例是1：1：1或1：2：3或1：3：2；所述溶胞物是指指液态培养结束后，除去发酵上清液，收集微生物菌体，将菌体破碎、过滤，收集滤清部分，即得到溶胞物；所述发酵上清液是指微生物液态培养结束后，除去菌体后得到的液体。
本发明还提供应用所述具有抗皱功能的组合物制备的化妆品、护肤品。将所述具有抗皱功能的组合物与其它溶剂、载体、赋形剂、美白剂、保湿剂、维生素、防晒霜、香水、染料、抗菌剂等以适当的比例调整使用。
所述组合物可以用纯化水稀释或不，都能够发挥抗皱功效。
[有益效果]
本发明采用采用独特的抗皱靶点筛选具有抗皱功效的活性益生菌，通过相互复配协同增效来解决单一益生菌抗皱效果差的弊端，增添了益生菌发酵物在抗皱类护肤品原料中的应用新局面。
本发明以从人体内筛选到双歧杆菌、植物乳杆菌属、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌出发，采用高渗益生菌培养基诱导培养，待生长一段时间后分别测定对应益生菌的菌体浓度OD600。将耐高渗的菌株(表现为在筛选培养基中能大量增殖的菌株)筛选出来，再通过发酵后测定对应菌株发酵产物的胶原蛋白酶抑制率；分别分析发酵液、溶胞物、以及不同组分配比间的胶原蛋白酶抑制率差异，得出最佳的益生菌发酵物配比，组合形成具有抗皱功效的三重乳酸发酵复合物，再通过测定其作用在细胞上，使得成纤维细胞中丝聚蛋白含量升高的作用来验证抗皱活性。
生物材料保藏
双歧杆菌Bicilia-B01(Bifidobacterium sp.Bicilia-B01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021469。
植物乳杆菌Bicilia-Lp01(Lactobacillus plantarum Bicilia-Lp01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021472。
嗜酸乳杆菌Bicilia-La01(Lactobacillus acidophilus Bicilia-La01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021471。
附图说明
图1是实施例4测得的不同浓度复合物对HaCaT细胞中丝聚蛋白含量的提升作用。
图2是实施例6测得的不同浓度复合物对弹性蛋白酶的抑制率。
具体实施方式
术语：
抗皱：皱纹形成有很多种机理，胶原蛋白酶和弹性蛋白酶会使得皮肤中胶原蛋白、弹性蛋白的降解。真皮中的胶原蛋白和弹性蛋白合成不足、或者被破坏过多，将会使皮肤弹性减弱，引发皱纹、缺水、光泽黯淡等多种衰老症状弹性。抑制胶原蛋白酶和弹性蛋白酶的活性，能减少皮肤中胶原蛋白和弹性蛋白的降解，从而达到抗皱的效果。
溶胞物，是指微生物液态培养结束后，除去发酵上清液，收集微生物菌体，将菌体破碎、过滤，收集滤清部分，即得到溶胞物。制备溶胞物时，活性益生菌破壁条件是900～1200Bar，破壁次数为3～5遍，过滤所用膜孔径为50～220nm。例如，在离心管底部分别收集每株菌的菌泥，用适量无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心10min后去除上清；如此清洗3遍后，收集底部的菌体备用。将清洗干净的菌体，按照菌泥：无菌纯净水＝1：9的比率，加纯净水重悬。重悬后的菌体分别采用高压匀浆机破壁，破壁压力为1000Bar，循环5次，温度控制在40℃以下。破壁后，分别收集破壁液，在9000rpm条件下离心10min，取上清液，分别用220nm的滤膜过滤得到上清液，分装在干净离心管中，即为乳酸杆菌溶胞物。
上清液，是指微生物液态培养结束后，除去菌体后得到的液体。例如，将发酵液，分别用50mL离心管分装，9000rpm离心10min，收集上清液，采用0.22μm滤膜过滤，放置在干净离心管中，得到上清液。
方法：
胶原酶是基质金属蛋白酶家族中的一种酶，主要由成纤维细胞合成分泌，能够降解皮肤中的胶原蛋白，导致皮肤老化。
胶原酶活性抑制率的测定：配制含有400mmol/L NaCl和10mmol/L CaCl2的Tricine缓冲液(50mmol/L、pH 7.5)，利用Tricine缓冲液配制0.8U/mL的胶原酶溶液和2mmol/L的(N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰基]-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸)FALGPA溶液。将40μL不同质量浓度的样品溶液与100μL Tricine缓冲液混合后加入20μL 0.8U/mL的胶原酶溶液，混匀后于25℃恒温孵育15min，再加入40μL 2mmol/L的FALGPA溶液，15min后在335nm处测定吸光度值，平行测定3次。按照公式(1)计算样品对胶原酶的抑制率：
Figure BDA0003421688380000041
式中：A为不含样品中的反应溶液的吸光度；
B为不含样品和酶的反应液吸光度；
C为含有样品和酶的反应液吸光度；
D为不含酶的反应液吸光度。
弹性蛋白酶酶是基质金属蛋白酶家族中的一种酶，主要由成纤维细胞合成分泌，能够降解皮肤中的弹性蛋白，导致皮肤老化，丧失弹性。
弹性蛋白酶抑制率的测定：
取85μL 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)与15μL不同质量浓度的样品溶液混合后加入25μL弹性蛋白酶溶液(60mU/mL)，在25℃下孵育15min，随后加入25μL 1.015mmol/L(N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-p-硝基苯胺)AAAPAN溶液，15min后在410nm处测定吸光度值，弹性蛋白酶溶液和AAAPAN溶液均用50mmol/L Tris-HCl的缓冲液(pH 8.0)配制，平行测定3次。按照公式(2)计算样品对弹性蛋白酶的抑制率。
Figure BDA0003421688380000051
式中：A为不含样品中的反应溶液的吸光度；
B为不含样品和酶的反应液吸光度；
C为含有样品和酶的反应液吸光度；
D为不含酶的反应液吸光度。
具有耐高渗条件的益生菌筛选培养基含有高浓度的糖分和无机盐，组分为：蛋白胨5～10g/L，酵母粉5～10g/L、葡萄糖10～50g/L、牛肉膏5～10g/L、吐温-80～0.5～2g/L、磷酸氢二钾1～4g/L、乙酸钠2～5g/L、柠檬酸氢二铵1～4g/L、七水硫酸镁0.5～2g/L、硫酸锰0.2～0.5g/L、NaCl 5～20g/L。
具有抗皱功效的三重益生菌发酵培养基组分为：蛋白胨5～10g/L、酵母粉5～10g/L、葡萄糖10～50g/L、可溶性淀粉4～10g/L、氯化钠10～30g/L、七水硫酸镁0.25～0.58g/L、硫酸锰0.1～0.25g/L。
实施例1：耐高渗益生菌的筛选
益生菌培养基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母粉5.0、葡萄糖20.0、吐温-80 1mL、磷酸氢二钾2.0、乙酸钠5.0、柠檬酸氢二铵2.0、七水硫酸镁0.58、硫酸锰0.25、pH 6.5～6.8，固体含有20g/L琼脂，121℃灭菌20min备用。
耐高渗(高盐、高糖)益生菌筛选培养基(g/L)：蛋白胨10g/L，酵母粉5、葡萄糖40、牛肉膏1、吐温-80 2、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸氢二铵4、七水硫酸镁2、硫酸锰0.5、NaCl25、pH 6.5～6.8，固体含有20g/L琼脂，121℃灭菌20min备用。
操作步骤：
步骤1：菌种活化
将双歧杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、副干酪乳杆菌共24株益生菌，于厌氧手套箱内，将菌种冻存管分别均匀涂布于益生菌固体平板上，放在厌氧培养箱中，37℃培养24h。
步骤2：菌种传代、种子培养
长出单菌落后，于厌氧手套箱中，分别挑取单菌落，接种在装有5mL液体益生菌培养基的摇菌管中，在厌氧培养箱中37℃条件下，培养16～18h，OD600约为1.0作为乳酸杆菌种子液。
步骤3：
将培养好的乳酸杆菌种子液，于厌氧手套箱中，按照初始OD600＝0.3的量，接种至装有无菌新鲜耐高渗筛选培养基的摇瓶中，规格为500mL三角瓶装液400mL，放置在厌氧培养箱中，37℃条件下培养24h。
步骤4：
培养结束后，取混合均匀的培养液，分别测定对应菌株的菌体浓度OD600。
表1
菌种 OD<sub>600</sub> 菌种 OD<sub>600</sub>
双歧杆菌H1 1.90 鼠李糖乳杆菌H1 0.31
双歧杆菌H2 0.44 鼠李糖乳杆菌H2 0.55
双歧杆菌H3 0.36 鼠李糖乳杆菌H3 0.93
双歧杆菌H4 0.53 鼠李糖乳杆菌H4 1.17
植物乳杆菌H1 0.44 唾液乳杆菌H1 0.32
植物乳杆菌H2 2.58 唾液乳杆菌H2 0.30
植物乳杆菌H3 0.52 唾液乳杆菌H3 1.24
植物乳杆菌H4 1.54 唾液乳杆菌H4 0.87
嗜酸乳杆菌H1 0.97 副干酪乳杆菌H1 1.53
嗜酸乳杆菌H2 0.99 副干酪乳杆菌H2 1.19
嗜酸乳杆菌H3 1.43 副干酪乳杆菌H3 0.62
嗜酸乳杆菌H4 3.21 副干酪乳杆菌H4 0.56
试验筛选出具有高渗耐受性的3株乳酸杆菌，分别是：双歧杆菌H1(即：双歧杆菌Bicilia-B01)、植物乳杆菌H2(即：植物乳杆菌Bicilia-Lp01)、嗜酸乳杆菌H4(即：嗜酸乳杆菌Bicilia-La01)。将筛选出的3株菌，分别划线在耐高渗筛选培养基上进行复筛，待长出单菌落后，放置于4℃冰箱，密封保存备用。
实施例2：实施例1中筛选得到的三株益生菌发酵物对胶原蛋白酶抑制率试验
胶原蛋白酶活性抑制率测定方法：
配制含有400mmol/L NaCl和10mmol/L CaCl2的Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)缓冲液(50mmol/L、pH7.5)，利用Tricine缓冲液配制0.8U/mL的胶原酶溶液和2mmol/L的FALGPA(N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰基]-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸)溶液。
不含样品的反应溶液：将40μL纯化水与100μL Tricine缓冲液混合后加入20μL0.8U/mL的胶原酶溶液，混匀后于25℃恒温孵育15min，再加入40μL 2mmol/L的FALGPA溶液，15min后在335nm处测定吸光度值，平行测定3次。
不含样品和酶的反应液：将40μL纯化水与100μL Tricine缓冲液混合后加入20μL纯化水，混匀后于25℃恒温孵育15min，再加入40μL 2mmol/L的FALGPA溶液，15min后在335nm处测定吸光度值，平行测定3次。
含有样品和酶的反应液：将40μL不同质量浓度的样品溶液与100μL Tricine缓冲液混合后加入20μL 0.8U/mL的胶原酶溶液，混匀后于25℃恒温孵育15min，再加入40μL2mmol/L的FALGPA溶液，15min后在335nm处测定吸光度值，平行测定3次。按照公式(1)计算样品对胶原酶的抑制率。
操作步骤：
步骤1：
将筛选得到的3株耐高渗乳酸杆菌，于厌氧手套箱中，挑取单菌落接种至装有400mL无菌益生菌发酵培养基的摇瓶中，摇瓶规格为500mL，放置在厌氧培养箱中，37℃培养24h。
具有抗皱功效益生菌发酵培养基配方：蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖40g/L、可溶性淀粉10g/L、氯化钠10g/L、七水硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.1g/L。
步骤2：
益生菌发酵滤液制备：将培养好的乳酸杆菌发酵液，分别用50mL离心管分装，9000rpm离心10min，收集上清液，采用0.22μm滤膜过滤，放置在干净离心管中，得到乳酸杆菌发酵滤液；
乳酸杆菌溶胞物制备：在离心管底部分别收集每株菌的菌泥，用适量无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心10min后去除上清；如此清洗3遍后，收集底部的菌体备用。将清洗干净的菌体，按照菌泥：无菌纯净水＝1：9的比率，加纯净水重悬。重悬后的菌体分别采用高压匀浆机破壁，破壁压力为1000Bar，循环5次，温度控制在40℃以下。破壁后，分别收集破壁液，在9000rpm条件下离心10min，取上清液，分别用220nm的滤膜过滤得到上清液，分装在干净离心管中，即为乳酸杆菌溶胞物。
按照胶原蛋白酶测试方法测定，得到不同益生菌发酵产物对胶原蛋白酶抑制的活性，如表2所示。
表2
Figure BDA0003421688380000071
Figure BDA0003421688380000081
筛选得出，双歧杆菌H1溶胞物(BH1L)、植物乳杆菌H2发酵滤液(PH2F)、嗜酸乳杆菌H4溶胞物(AH4L)具有很高的胶原蛋白酶抑制率。
实施例3：胶原蛋白酶抑制率活性益生菌发酵物的配比试验
将实施例2中筛选所得的三株活性益生菌溶胞物进行复配，筛选出按照不同比率混合后具有协同增效胶原蛋白酶抑制率的配比组合。
步骤1：
将实施例2制得的双歧杆菌H1溶胞物(BH1L)、植物乳杆菌H2发酵滤液(PH2F)、嗜酸乳杆菌H4溶胞物(AH4L)，按照一定质量比率一起混合，用超纯水稀释2倍后作为样品备用。
胶原蛋白酶抑制率测试，结果如表3所示。
表3
组号 BH1L PH2F AH4L CI指数
1 1 1 4 0.82
2 1 2 3 0.75
3 1 3 2 0.77
4 1 4 1 0.95
5 2 1 3 0.89
6 2 2 2 0.49
7 2 3 1 0.91
8 3 1 2 0.68
9 3 2 1 0.75
10 4 1 1 0.79
注：BH1L为双歧杆菌H1溶胞物；PH2F为植物乳杆菌H2发酵上清液；AH4L为嗜酸乳杆菌H4溶胞物。
实施例4：三种益生菌发酵物配方复合物在细胞水平上测试丝聚蛋白含量
测试方法：
细胞接种：HaCaT细胞在完全培养基中生长(含10％FBS和1％双抗的高糖DMEM培养基)。用胰蛋白酶消化细胞，按照2×105个/mL接种于6孔板中，每孔2mL，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
样品处理：待细胞的融合度达到约80％，吸出培养基并用PBS洗去残余培养液，空白组加入2mL DMEM，其余加入2mL DMEM配制的样品，每组3个平行，在培养箱中孵育6h。去除培养基，用PBS小心冲洗2次，每孔加入1mL PBS，暴露于UVA照射(9J/cm2，约1.5h)下，随后更换为新鲜培养液(完全培养基)，继续孵育12h。
丝聚蛋白(FLG)检测：每孔细胞加入100μL裂解液，离心并收集上清液，用ELISA试剂盒检测(Human Filaggrin ELISA Kit；CUSABIO)。
操作步骤：
取实施例2制备的三种益生菌溶胞物：双歧杆菌H1溶胞物(BH1L)、植物乳杆菌H2发酵上清液物(PH2F)、嗜酸乳杆菌H4溶胞物(AH4L)按照质量比2：2：2混合后，按照上述测试方法进行，测定丝聚蛋白含量，结果如图1所示，当复合物浓度达到10％(即复合物在2mL体系中浓度为100mg/mL)时，能显著提丝聚蛋白含量。
实施例5：具有抗皱功效的三重益生菌发酵复合物的制备
种子培养：
将筛选得到的双歧杆菌H1、植物乳杆菌H2、嗜酸乳杆菌H4，于厌氧手套箱中分别接种在益生菌液体培养基，放置在厌氧培养箱中培养24h，获得益生菌种子液；
抗皱功效的三重益生菌发酵培养基组分为：蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖40g/L、可溶性淀粉10g/L、氯化钠10g/L、七水硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.1g/L；
发酵罐发酵：发酵罐接种，将培养好的益生菌种子，按照1％接种量分别接种至3只装有7L无菌益生菌发酵培养基的10L发酵罐中培养，37℃，200rpm搅拌开始发酵，过程通入氮气保压，用2mol/L氢氧化钠调节pH在6.5～7.0范围内。当发酵至罐内葡萄糖消耗完全，菌种OD600不再上升时，发酵结束。
发酵液后处理：将三株益生菌的发酵液，分别离心、重悬、破壁、过滤。
以离心力为5000g离心5min，将菌泥用纯净水按照1：9比率重悬起来，采用高压匀浆机，1200Bar破壁4遍，过程温度控制在37℃以下。破壁液采用200nm陶瓷膜过滤，得到双歧杆菌H1溶胞物、植物乳杆菌H2发酵上清液、嗜酸乳杆菌H4溶胞；并分别按照2：2：2的比率混合，得到具有抗皱功效的三重益生菌发酵复合物。
实施例6具有抗皱功效的三重益生菌发酵复合物对弹性蛋白酶的抑制率测试
弹性蛋白酶抑制率测试方法：
不含样品的反应溶液：取85μL 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)与15μL纯化水混合后加入25μL弹性蛋白酶溶液(60mU/mL)，在25℃下孵育15min，随后加入25μL1.015mmol/L AAAPAN溶液，15min后在410nm处测定吸光度值，平行测定3次。
不含样品和酶的反应液：取85μL 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)与40μL纯化水混合后，在25℃下孵育15min，随后加入25μL 1.015mmol/L AAAPAN溶液，15min后在410nm处测定吸光度值，平行测定3次。
含有样品和酶的反应液：取85μL 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)与15μL不同质量浓度的样品溶液混合后加入25μL弹性蛋白酶溶液(60mU/mL)，在25℃下孵育15min，随后加入25μL 1.015mmol/L AAAPAN溶液，15min后在410nm处测定吸光度值，平行测定3次。弹性蛋白酶溶液和N-琥珀酰丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-p-硝基苯胺(AAAPAN)溶液均用50mmol/LTris-HCl的缓冲液(pH 8.0)配制。按照公式(2)计算样品对弹性蛋白酶的抑制率。
测试结果如图2所示，当复合物浓度达到80％时，对弹性蛋白酶的抑制率最高(复合物浓度80％，指的是用DMEM稀释至80％浓度，即2mL样品溶液含1.6mL复合物样品、0.4mLDMEM)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.具有抗皱功能的组合物，其特征在于，含有双歧杆菌Bicilia-B01的溶胞物、植物乳杆菌Bicilia-Lp01的发酵上清液、嗜酸乳杆菌Bicilia-La01的溶胞物，三者的质量比例是1：1：1或1：2：3或1：3：2；
所述溶胞物是指液态培养结束后，离心除去发酵上清液，收集微生物菌体，将菌体破碎、过滤，收集滤清部分，即得到溶胞物；
所述发酵上清液是指微生物液态培养结束后，除去菌体后得到的液体；
所述双歧杆菌Bicilia-B01(Bifidobacterium sp.Bicilia-B01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021469；
所述植物乳杆菌Bicilia-Lp01(Lactobacillus plantarum Bicilia-Lp01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021472；
所述嗜酸乳杆菌Bicilia-La01(Lactobacillus acidophilus Bicilia-La01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021471。
2.应用权利要求1所述所述具有抗皱功能的组合物制备的化妆品。
3.根据权利要求2所述的化妆品，其特征在于，包括肤用化妆品、发用化妆品，包括：胭脂、口红、眼影、粉饼、头发染烫剂。
4.应用权利要求1所述所述具有抗皱功能的组合物制备的护肤品。
5.根据权利要求4所述的护肤品，其特征在于，包括面霜、乳液、精华液、蜜、化妆水、面膜、发乳、发胶。
6.权利要求1所述所述具有抗皱功能的组合物在制备化妆品、护肤品中的用途。
7.双歧杆菌Bicilia-B01或植物乳杆菌Bicilia-Lp01或Bicilia-La01在制备具有抗皱功效的产品中的用途，
所述双歧杆菌Bicilia-B01(Bifidobacterium sp.Bicilia-B01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021469，
所述植物乳杆菌Bicilia-Lp01(Lactobacillus plantarum Bicilia-Lp01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021472，
所述嗜酸乳杆菌Bicilia-La01(Lactobacillus acidophilus Bicilia-La01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021471。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述产品包括化妆品、护肤品。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，包括：胭脂、口红、眼影、粉饼、头发染烫剂。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，包括面霜、乳液、精华液、蜜、化妆水、面膜、发乳、发胶。
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