KR102280751B1

KR102280751B1 - 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물

Info

Publication number: KR102280751B1
Application number: KR1020200179188A
Authority: KR
Inventors: 민진우; 권정화; 한우리자랑; 임미진; 최정주; 강현수; 강희철
Original assignee: (주)지에프씨생명과학; 주식회사 한국화장품제조
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-07-22

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P), 이를 이용하여 제조된 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P) 및를 통해 발효된 센탈라아시아티카 정량 출물은 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

Description

락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물{Lactobacillus plantarum YoungBiome2 and Titrated Extract of Fermented Centella Asiatica Manufactured Using Thereof}

본 발명은 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P) 및 이를 이용하여 제조된 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물에 관한 것이다.

피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 숙주인 사람은 이들과 공생관계를 이루고 있으며, 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다. 피부는 함입부, 특화되어있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성 물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속지점이 되며, 다양한 미생물들(진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적 및 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 일반적으로 피부는 차갑고, 산성 성질을 나타내며, 건조된 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어 있고, 각질세포(keratinocyte)와는 분화하여 떨어져 있다. 상기 표피는, 일명 "벽돌과 몰탈 구조"라고 불리는 형태를 띄고 있다. 피부 조직은 계속적인 자가회복과정을 거치는데, 분화과정의 마지막을 거친 인설(squames)은 끊임없이 피부조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 된다.

한편, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균을 총칭하여 유산균(Lactic acid bacteria)이라고 한다. 유산균은 장내에 서식하면서 인체의 소화계와 공생을 하며 섬유질 및 복합 단백질을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당한다. 또한, 장내 환경을 산성으로 유지시킴으로 유해세균의 성장을 억제하고 설사 및 변비 개선, 비타민 합성, 혈중 콜레스테롤 저해 등의 역할을 한다. 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특성이 있어 정장작용에 많은 도움을 주며, 대식세포 및 비장의 활성을 증진하여 면역반응에 관여하는 물질을 분비 및 촉진하는 효과를 나타낸다. 또한, 면역 조절 기능도 가지고 있어 아토피 및 알러지 관련 질환에 효과가 있다.

락토바실러스(Lactobacillus) 속을 이용하여 다양한 용도에 적용되고 있는 기술로는, 대한민국 등록특허공보 제10-1846796호「한국형 유산균으로 발효하여 얻은 유청을 포함하는 탄력 개선 또는 보습용 화장품」, 대한민국 등록특허공보 제10-1492003호「피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 플란타룸 HY7714 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품」 및 대한민국 등록특허공보 제 10-1998067호 「비피도박테리움 속 GFC-B09 및 이를 이용하여 제조된 발효물」등이 개시되어 있다.

이에, 본 발명자들은 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)를 20대의 피부로부터 분리 동정하였고, 이를 이용하여 센텔라아시아티카 정량 추출물을 발효하는 단계를 통해 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물을 제조할 경우, 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 부여할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허공보 제10-1846796호 대한민국 등록특허공보 제10-1492003호 대한민국 등록특허공보 제10-1998067호

본 발명의 목적은 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 갖는 신규한 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 균주를 효능 활성이 극대화 되게 조성된 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물의 제조방법 및 이로부터 제조된 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 균주를 통하여 발효된 센텔라아시아티카 정량 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 갖는 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 균주는 피부 유래인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)를 MRS 배지, Maltose 0.5g/L 및 센텔라아시티카 정량 추출물(아시티코사이드 40%, 마테카트산 30% 및 아시아트산 30%) 0.1g/L이 포함된 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양은 32 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)로 발효된 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 한다.

본 발명으로부터 제공되는 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)로 발효된 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물은 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

이에, 본 발명에서는 20대의 여성 피부로부터 분리된 미생물로부터 피부-마이크로바이옴피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(C. acne의 감소 및 S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 갖는 균주를 스크리닝하여 우수한 균주를 선발하고, 16s rRNA 염기서열 분석을 실시한 결과, 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum)와 유사한 염기서열을 가진 신규 미생물임을 확인하였다. 이에, 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주로 명명하고 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁하였다.

따라서, 본 발명은 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 갖는 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)(이하 'YoungBiome2'로 약칭함)에 관한 것이다.

이때, 상기 YoungBiome2 균주는 피부 유래인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)를 효능 활성이 극대화 되게 조성된 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 배양에 사용되는 배지는 MRS 배지에 Maltose 및 센텔라아시아티카 정량 추출물(아시티코사이드 40%, 마테카트산 30% 및 아시아트산 30%)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 그 중에서도 MRS 배지(proteose peptone No.3 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, dextrose 20g, Polyoxyethylene sorbitan monooleate 1g, ammonium citrate 2g, maganessium sulfate 0.1g, manganesse selfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g/L, pH 6.5)를 기본으로 하여 Maltose 0.5g/L 및 센텔라아시아티카 정량 추출물(아시티코사이드 40%, 마테카트산 30% 및 아시아트산 30%) 0.1g/L를 추가시킨 배지를 사용하여 발효된 것이 발효물의 수율을 가장 효과적으로 향상시키고 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 극대화 시킬 수 있는 측면에서 바람직하다.

상기 YoungBiome2 균주를 Maltose 및 센텔라아시아티카 정량 추출물(아시티코사이드 40%, 마테카트산 30% 및 아시아트산 30%)이 첨가된 MRS 액체배지에 1.0x10⁷내지1.0x10⁹의 세균수가 되도록 하여 1~3% 수준으로 접종하고, 배양하는 단계는 혐기성 조건에서 정치 배양을 32 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다. 만일, 배양 온도 및 시간이 상기 범위를 벗어날 경우에는 발효균주의 배양조건이 맞지 않아 충분한 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 나타낼 수 없을 뿐만 아니라, 균주 증식이 되지 않기 때문에 바람직하지 않다.

상기와 같이, 배양된 균주를 pH 3.8~4.2 조건에서 여과한 다음, 상기 여과된 균주를 20~30℃에서 10~16일 동안 숙성하여 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)의 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과가 있어 화장료 조성물로서의 효과가 매우 우수하다.

따라서, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)로 발효된 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물(아시티코사이드 40%, 마테카트산 30% 및 아시아트산 30%)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 화장료 조성물은 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것일 수 있다.

본 발명의 주름 개선, 피부 상처 회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 주름 개선 및 피부 상처 회복용 화장료 조성물에서, 상기 발효물은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 90 중량% 함유되어 있을 수 있고, 바람직하게는 3 내지 15 중량% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> Lactobacillus plantrum YoungBiome2 균주의 분리

20대 여성 얼굴 피부를 거즈로 스왑하여 MRS 배지에 진탕한 후 이를 10^-4배(부피)로 희석한 샘플 0.1mL을 MRS 한천배지(Peptospecial 10 g, beef extract 10g, yeast extract 5g, Glucose 20g, Triammonium Citrate 2g, sodium acetate 5g, maganessium sulfate 0.2g, manganesse selfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g, Agar 15g, Tween80 1g/L, pH 6.2ㅁ0.2, MBcell(Cat.No. MB-M1025))에 도말하여 혐기성 인큐베이터에서 37℃에서 2일간 배양하였다. 형성된 집락을 순수 분리 배양하여, 24 시간 동안 혐기 인큐베이터에서 재배양한 후 형성된 단일 colony를 분리하였다. 분리된 균주들 중 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과가 우수한 Youngbiome2 균주를 선발하였다.

<실시예 2> 선발균주 16s rRNA 염기서열 분석

최종 선발된 Youngbiome2 균주의 gDNA와 Universal primer인 서열번호 1: 27F(5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3')와 서열번호 2: 1492R(5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3')를 이용하여 16s DNA 염기서열 분석을 통하여 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners)와 상동성이 높은 균주인 것으로 확인하였으며, 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(서열번호 3)로 명명하였고, 국제미생물특허 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하고, 수탁번호 KCCM12765P를 부여받았다.

<실시예 3> 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물 제조

분리된 YoungBiome2 균주의 발효물을 제조하기 위해 MRS 배지에 Maltose 0.5g/L 및 센텔라아시아티카 정량 추출물(아시티코사이드 40%, 마테카트산 30% 및 아시아트산 30%) 0.1g/L를 첨가하여 제조한 후 YoungBiome2 균주를 1.0x10⁹의 균수가 되도록 하여 1% 접종하였다. 접종 후 혐기상태가 유지되도록 산소공급은 없으며, 정치배양을 37℃에서 120시간 동안 실시하였다. 배양을 마치고 pH가 4.0(오차 0.2)으로 형성되는지 확인한 뒤, 육안상으로 짙은 갈색인 것이 확인되면 배양을 마치고 0.2㎛필터(밀리포어) 제균을 실시하였다. 필터가 완료되면 상온에서 2주간 숙성기간을 거쳐 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물을 제조하였다.

<비교예 1> 일반 락토바실러스 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물 제조

공시균주인 락토바실러스 플란타럼 ATCC14917^T (Lactobacillus plantarum ATCC14917^T) 균주의 발효물을 제조하기 위해 MRS 배지에 Maltose 0.5g/L, 센텔라아시아티카 정량 추출물(아시티코사이드 40%, 마테카트산 30% 및 아시아트산 30%) 0.1g/L를 첨가하여 제조한 후 ATCC14917^T균주를 1.0x10⁹의 균수가 되도록 하여 1% 접종하였다. 접종 후 혐기상태가 유지되도록 산소공급은 없으며, 정치배양을 37℃에서 120시간 동안 실시하였다. 배양을 마치고 pH가 4.0(오차 0.2)으로 형성되는지 확인한 뒤, 육안상으로 짙은 갈색인 것이 확인되면 배양을 마치고 0.2㎛필터(밀리포어) 제균을 실시하였다. 필터가 완료되면 상온에서 2주간 숙성기간을 거쳐 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물을 제조하였다.

<비교예 2> YoungBiome2 균주의 MRS 일반 배지 활용 발효물 제조

분리된 YoungBiome2 균주의 일반 배지를 활용한 발효물을 제조하기 위하여 일반 MRS 배지만을 활용하고 Maltose 및 센텔라아시아티카 정량 추출물을 첨가하지 않은 것을 제외하면 <실시예 3>과 동일한 방법으로 비교예 2를 제조하였다.

<비교예 3> 센텔라아시아티카 정량 추출물

센텔라아시아티카 정량 추출물 0.1g/L 농도로 정제수에 녹여 비교예 3을 제조하였다.

<실험예 1> 항주름 효능 시험 : MMP-1 억제 및 PIP Assay

실시예 3 및 비교예 1~3을 이용하여 MMP-1(콜라겐분해효소) 억제와 PIP(Procollagen type 1 C-Peptide) 생성 정도를 평가하였다.

(1) MMP-1 억제

실시예 3 및 비교예 1~3을 각각 50(㎍/㎖)의 농도로 희석하여 주름 억제 활성을 확인하기 위하여, MMP-1에 대한 assay 실험을 진행하였다. UVA의 조사에 의하여 발현되는 MMP-1의 억제 활성을 Real-time PCR을 통하여 확인 하였으며, 샘플 처리 농도 별로 조제하여 처리함으로써 MMP-1의 억제 활성에 영향을 주는지 확인하였다.

구분	MMP-1 저해 활성(%)
양성 대조군 (EGCG)	55.10±0.39
실시예 3(발효 센텔라아시아티카 정량 추출물)	71.85±0.40
비교예 1	44.34±0.65
비교예 2	32.94±0.50
비교예 3	19.05±0.60

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 실시예 3는 비교예 1~3 대비 MMP-1 저해 활성이 우수한 것을 확인하였다.

(2) Procollagen Type Ⅰ C-peptide(PIP) Assay

실시예 3 및 비교예 1~3이 시료가 인체 진피 섬유아세포의 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하였다. 실시예 3 및 비교예 1~3을 각각 50(㎍/㎖)의 농도로 희석하여 처리하고 24시간 배양 후 Procollagen TypeⅠC-peptide(PIP) kit인 96well plate에 각각 농도별로 처리한 배양액을 100㎕씩 분주해주고 37℃ incubator에 넣고 2시간동안 반응시켰다. 그리고 D-PBS로 세척해준 뒤, antibody-POD conjugate solution을 각각 100㎕씩 분주해주고 37℃ incubator에 넣고 1시간 동안 반응시켜주었다. 다시 D-PBS로 세척해준 뒤, substrate solution (3,3',5,5'- Tetrametylbenzidine)을 각각 100㎕씩 분주해주고 상온에서 15분간 반응시켜주었다. 15분 뒤, multi-reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

구분	PIP 생성(%)
Control	100±0.3
양성 대조군 (EGCG)	165±3.9
실시예 3(발효 센텔라아시아티카 정량 추출물)	155±3.5
비교예 1	130±2.5
비교예 2	142±2.5
비교예 3	110±2.0

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 실시예 3는 비교예 1~3 대비 콜라겐 생성 활성이 우수한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 발효 과정 시 첨가되는 물질에 의하여 균주의 생장량의 차이 및 유효 postbiotics의 생성량이 달라지는 것에 기인한 효과로 예측할 수 있다.

<실험예 2> 상처 치유 효능 시험 : Wound healing assay

실시예 3 및 비교예 1~3을 이용하여 피부의 상처 치유효과를 확인하기 위하여 Wound healing assay를 수행하였다.

섬유아세포(Human fibroblast)를 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 12well plate dish에 배양하여 세포가 plate에 80% 이상 되도록 하였다. Tip을 이용하여 plate 바닥을 그어 균일한 너비로 선을 만들었다. PBS로 세척한 후 실시예 3 및 비교예 1~3을 포함한 세포 배양배지를 처리하였다. 상처 치유 시험은 현미경 배율 x100으로 12, 24, 48시간에서 세포의 이동성을 통하여 양단간 간격을 측정하여 확인하였다.

구분	Wound Healing (%)
실시예 3(발효 센텔라아시아티카 정량 추출물)	93.05±2.0
비교예 1	82.00±0.9
비교예 2	85.15±1.0
비교예 3	80.05±1.5

그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 실시예 3의 상처 치유 활성이 우수한 것이 확인되었다. 이러한 결과는 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물에 상처 치유효과 있다는 것을 의미한다.

<실험예 3> 항염 효능 시험 : Nitric Oxide(NO)를 억제 활성

실시예 3 및 비교예 1~3을 이용하여 항염증 활성 효과를 확인하기 위해 니트릭 옥사이드(Nitric oxide)를 억제하는 정도를 측정하였다.

대식세포의 일종인 RAW 264.7 cell을 1% 페니실린/스크랩토마이신 및 10% FBS(fetal bovineserum)가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 24Well plate에 1.0x10⁴ cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 RAW 264.7 cell에 실시예 3 및 비교예 1~3을 50(㎍/㎖) 농도로 배지와 혼합 후, 각 Well에 1ml씩 첨가하고 37℃ 및 5% CO₂조건의 인큐베이터에서 24시간 반응시켰다. 이때, NO를 발현시키는 염증유발인자인 LPS(Lipo poly saccharide)를 1㎍/㎖의 농도로 같이 처리하고 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 각 well의 상등액 만을 따로 취한 뒤 각 Well에 Nitric Oxide detection kit를 이용하여 배양액 중 100㎖ 를 96 Well plate에 취하고 Griess reagent A(N-1-Naphthylethylenediamine (NEDHC)) 50㎕ 및 Griess reagent B(Sulfanilamide) 50㎕를 각각 넣어준 뒤 각각 10분 동안 반응시킨 뒤, ELISA plate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.

구분	No 억제효과
Control	2%±0.5
양성 대조군 (덱사마타손)	70%±1.5
실시예 3(발효 센텔라아시아티카 정량 추출물)	85%±1.0
비교예 1	54%±0.5
비교예 2	67%±0.5
비교예 3	35%±0.5

그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 실시예 4은 비교예 1~3 대비 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성농도가 낮은 것으로 확인되어 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물에 항염 효과가 있다는 것을 의미한다.

<제조예 1> 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물을 함유하는 화장료 제조

(1) 화장수 제조

하기 표 5에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예３（발효 센텔라아시아티카 정량 추출물）	3.00
히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액)	12.00
잔탄검(2% 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글라이콜	6.00
글리세린	4.00
히알루론산나트륨(1% 수용액)	5.00
정제수	68.00
합계	100.00

(2) 로션 제조

하기 표 6에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 로션을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예３（발효 센텔라아시아티카 정량 추출물）	3.00
아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
수용성 콜라겐 (1% 수용액)	1.00
시트르산나트륨	0.01
시트르산	0.05
1,3-부틸렌글리콜	3.00
정제수	91.94
합계	100.0

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(KCCM)

KCCM12765P

20200616

<110> GFC Life Science Co., Ltd. HANKOOK COSMETICS MANUFACTURING CO., LTD. <120> Lactobacillus plantarum YoungBiome2 and Titrated Extract of Fermented Centella Asiatica Manufactured Using Thereof <130> P20201218 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 27F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 1492R <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus plantarum YoungBiome2 <400> 3 tganttttgg agtttggatt cggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca 60 agtcgaacga actctggtat tgattggtgc ttgcatcatg atttacattt gagtgagtgg 120 cgaactggtg agtaacacgt gggaaacctg cccagaagcg ggggataaca cctggaaaca 180 gatgctaata ccgcataaca acttggaccg catggtccga gtttgaaaga tggcttcggc 240 tatcactttt ggatggtccc gcggcgtatt agctagatgg tgaggtaacg gctcaccatg 300 gcaatgatac gtagccgacc tgagagggta atcggccaca ttgggactga gacacggccc 360 aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc 420 aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaaact ctgttgttaa agaagaacat 480 atctgagagt aactgttcag gtattgacgg tatttaacca gaaagccacg gctaactacg 540 tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag 600 cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccttc ggctcaaccg aagaagtgca 660 tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg tagcggtgaa 720 atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tgtctggtct gtaactgacg 780 ctgaggctcg aaagtatggg tagcaaacag gattagatac cctggtagtc cataccgtaa 840 acgatgaatg ctaagtgttg gagggtttcc gcccttcagt gctgcagcta acgcattaag 900 cattccgcct ggggagtacg gccgcaaggc tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 960 acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agctacgcga agaaccttac caggtcttga 1020 catactatgc aaatctaaga gattagacgt tcccttcggg gacatggata caggtggtgc 1080 atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1140 ttattatcag ttgccagcat taagttgggc actctggtga gactgccggt gacaaaccgg 1200 aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1260 acaatggatg gtacaacgag ttgcgaactc gcgagagtaa gctaatctct taaagccatt 1320 ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg 1380 gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg 1440 agagtttgta acacccaaag tcggtggggt aacctttaga accaccgcta agtgacgtgg 1500 1500

Claims

주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 갖는 피부 유래의 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P).
삭제
피부 유래의 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)를 (a) MRS 배지, (b) Maltose 0.5g/L 및 (c) 아시티코사이드 40중량%, 마테카트산 30중량% 및 아시아트산 30중량%로 이루어진 센텔라아시아티카 정량 추출물 0.1g/L이 포함된 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 배양은 32 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물의 제조방법.
피부 유래의 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)로 발효된 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물.
제5항의 발효 센텔라아시아티카 정량 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.