KR102606937B1 - 락토바실러스 브레비스 gfc0707p 균주 및 이를 이용하여 제조된 분홍바늘꽃 발효 추출물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 브레비스 GFC0707P 균주 및 이를 이용하여 제조된 분홍바늘꽃 발효 추출물에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주(기탁번호:KCCM12764P)를 이용하여 분홍바늘꽃(Epilobium angustifolium) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 통해 분홍바늘꽃 발효 추출물을 제조할 경우, 항염, 항산화 및 주름 개선 효능이 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주(기탁번호:KCCM12764P)를 이용하여 분홍바늘꽃(Epilobium angustifolium) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 통해 분홍바늘꽃 발효 추출물을 제조할 경우, 항염, 항산화 및 주름 개선 효능이 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.
Description
본 발명은 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주(기탁번호:KCCM12764P) 및 이를 이용하여 제조된 분홍바늘꽃 발효 추출물에 관한 것이다.
분홍바늘꽃(Epilobium angustifolium)은 바늘꽃속에 속하는 여러해살이풀이며, 해발 1,000m 이상의 고산지대에 자생하는 식물이다. 두메바늘꽃, 큰바늘꽃이라고도 불리며, 불이 난 지역에 제일 먼저 자리 잡는 식물이라 하여 'fireweed'라고도 불린다. 잎은 어긋나기하며 길이 8~15cm이고, 꽃은 7~8월에 피고 분홍색이며, 원줄기 끝에서 모여 달린다. 열매는 삭과로서 길이 8~10cm이고 굽은 털이 있으며 종자에 관모가 있다. 한의학에서는 분홍바늘꽃 풀 전체를 약용하며, 전초말린 것을 '홍쾌자'라 하여 소화불량으로 인한 복부팽만을 치료하는데 사용하고, 뿌리는 '나우'라고 하여 염증 및 통증 완화에 사용한다. 또한, 껍질을 벗긴 줄기는 예로부터 아메리카 원주민들이 찰과상이나 곪은 피부의 치료에 사용한 것으로 전해진다.
분홍바늘꽃을 이용하는 기술로는, 국내의 경우 대한민국 등록특허공보 제10-1319997호「분홍바늘꽃 및 구슬꽃나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물」, 대한민국 등록특허공보 제10-1121949호「수분 함량을 높인 화장품 스팀 크림의 조성물 및 이의 제조방법」등이 개시되어 있다.
한편, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균을 총칭하여 유산균(Lactic acid bacteria)이라고 한다. 유산균은 장내에 서식하면서 인체의 소화계와 공생을 하며 섬유질 및 복합 단백질을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당한다. 또한, 장내 환경을 산성으로 유지시킴으로 유해세균의 성장을 억제하고 설사 및 변비 개선, 비타민 합성, 혈중 콜레스테롤 저해 등의 역할을 한다. 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특성이 있어 정장작용에 많은 도움을 주며, 대식세포 및 비장의 활성을 증진하여 면역반응에 관여하는 물질을 분비 및 촉진하는 효과를 나타낸다. 또한, 면역 조절 기능도 가지고 있어 아토피 및 알러지 관련 질환에 효과가 있다.
화장품 분야에서는 유산균 배양액이 1955년 상품화된 이후 현재까지 사용되고 있는데 주로 스트랩토코커스(Streptococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 등을 이용하여 직접 배양액에 발효하여 여과하거나 추출하는 등의 원료 형태 및 활성 소재에 접종하여 발효한 후 여과하거나 추출하는 등의 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
특히, 유용성과 안전성을 모두 갖춘 유익균으로 알려진 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)는 락토바실러스 속 유산균으로 사람의 장내에 상재하며, 항균, 항산화, 콜레스테롤 저하 효과를 가지며, 항염 작용, 면역 증강 작용에도 관여하는 매우 유용한 균주로서 유제품이나 건강기능식품, 화장품 등 다방면의 산업에서 유익하게 활용되고 있다.
락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 이용하여 다양한 용도에 적용되고 있는 기술로는, 대한민국 등록특허공보 제10-1908976호「락토바실러스 발효 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물」, 대한민국 등록특허공보 제10-1968242호「락토바실러스 브레비스 AMI-1109 균주 및 이의 용도」 등이 개시되어 있다.
이에, 본 발명자들은 분홍바늘꽃으로부터 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주(기탁번호:KCCM12764P)를 분리 동정하였고, 이를 이용하여 분홍바늘꽃(Epilobium angustifolium) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 통해 분홍바늘꽃 발효 추출물을 제조할 경우, 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 억제 활성, DPPH 자유라디칼 소거능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 효능을 부여할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 억제 활성, DPPH 자유라디칼 소거능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성을 갖는 신규한 균주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 균주를 분홍바늘꽃(Epilobium angustifolium) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분홍바늘꽃 발효 추출물의 제조방법 및 이로부터 제조된 분홍바늘꽃 발효 추출물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 분홍바늘꽃 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 억제 활성, DPPH 자유라디칼 소거능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성을 갖는 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주(기탁번호:KCCM12764P)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 균주는 분홍바늘꽃 유래인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주(기탁번호:KCCM12764P)를 분홍바늘꽃(Epilobium angustifolium) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분홍바늘꽃 발효 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 30 ~ 37℃에서 3 ~ 7일 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주(기탁번호:KCCM12764P)로 발효된 분홍바늘꽃 발효 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 분홍바늘꽃 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항염, 항산화 및 주름 개선용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 한다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주(기탁번호:KCCM12764P)를 이용하여 분홍바늘꽃(Epilobium angustifolium) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 통해 분홍바늘꽃 발효 추출물을 제조할 경우, 항염, 항산화 및 주름 개선 효능이 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.
도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 분홍바늘꽃 추출물(발효 전) 및 분홍바늘꽃 발효 추출물(발효 후)의 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 분홍바늘꽃 추출물(발효 전) 및 분홍바늘꽃 발효 추출물(발효 후)의 Nitric oxide 생성 억제 활성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 분홍바늘꽃 추출물(발효 전) 및 분홍바늘꽃 발효 추출물(발효 후)의 DPPH 라디칼 소거 활성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 분홍바늘꽃 추출물(발효 전) 및 분홍바늘꽃 발효 추출물(발효 후)의 엘라스타제(Elastase) 억제 활성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 분홍바늘꽃 추출물(발효 전) 및 분홍바늘꽃 발효 추출물(발효 후)의 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 분홍바늘꽃 추출물(발효 전) 및 분홍바늘꽃 발효 추출물(발효 후)의 Nitric oxide 생성 억제 활성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 분홍바늘꽃 추출물(발효 전) 및 분홍바늘꽃 발효 추출물(발효 후)의 DPPH 라디칼 소거 활성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 분홍바늘꽃 추출물(발효 전) 및 분홍바늘꽃 발효 추출물(발효 후)의 엘라스타제(Elastase) 억제 활성 평가를 나타낸 그래프이다.
이에, 본 발명에서는 분홍바늘꽃으로부터 분리된 미생물로부터 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 억제 활성, DPPH 자유라디칼 소거능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 효과를 갖는 균주를 스크리닝하여 우수한 균주를 선발하고, 16s rRNA 염기서열 분석을 실시한 결과, 락토바실러스 (Lactobacillus) 속(genus)에 속하는 신규 미생물임을 확인하였다. 이에, 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주로 명명하고 2020년 7월 16일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁하였다.
따라서, 본 발명은 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 억제 활성, DPPH 자유라디칼 소거능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성을 갖는 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주(기탁번호:KCCM12764P(이하 'GFC0707P'로 약칭함)에 관한 것이다.
이때, 상기 GFC0707P 균주는 분홍바늘꽃 유래인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 GFC0707P 균주를 분홍바늘꽃(Epilobium angustifolium) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분홍바늘꽃 발효 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
상기 분홍바늘꽃 추출물은 분홍바늘꽃 열수 추출물, 분홍바늘꽃 유기용매 추출물 또는 유기용매 추출물의 분획물인 것을 특징으로 한다. 즉, 분홍바늘꽃을 80 ~ 100℃에서 6 ~ 48시간 동안 열수 추출하거나, 25 ~ 80℃에서 1 ~ 7일 동안 유기용매에 침지하여 추출하는 방법 또는 유기용매 추출물을 분획하는 방법 중에서 선택된 적어도 하나의 추출 방법을 사용하여 추출된 것이 추출물의 수율을 가장 효과적으로 향상시킬 수 있는 측면에서 바람직하다.
상기 GFC0707P 균주를 분홍바늘꽃 추출물에 1.0~107 CFU 로 접종하고, 배양하는 단계는 30 ~ 37 ℃에서 3 ~ 7일 동안 수행되는 것을 특징으로 한다. 만일, 배양 온도 및 시간이 상기 범위를 벗어날 경우에는 발효균주의 배양조건이 맞지 않아 충분한 항염, 항산화 및 주름 개선 효과를 나타낼 수 없을 뿐만 아니라, 균주 증식이 되지 않기 때문에 바람직하지 않다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주(기탁번호:KCCM12764P)로 발효된 분홍바늘꽃 발효 추출물에 관한 것이다.
상기 분홍바늘꽃 발효 추출물은 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 억제 활성, DPPH 자유라디칼 소거능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 효과가 있어 화장료 조성물로서의 효과가 매우 우수하다.
따라서, 본 발명은 분홍바늘꽃 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 화장료 조성물은 항염, 항산화 및 주름 개선용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것일 수 있다.
본 발명의 항염, 항산화 및 주름 개선용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 항염, 항산화 및 주름 개선용 화장료 조성물에서, 상기 분홍바늘꽃 발효 추출물은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 50 중량% 함유되어 있을 수 있고, 바람직하게는 3 내지 15 중량% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 억제 활성, DPPH 자유라디칼 소거능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 유산균주의 분리 및 선발
먼저, 분홍바늘꽃 시료로부터 유용한 기능을 갖는 유산균을 분리하기 위해, 분홍바늘꽃을 MRS 배지에 정치배양한 시료를 10진 희석법으로 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 으로 희석한 후 Bromopurple blue 0.002%를 첨가한 MRS 배지(프로티오스 펩톤(Proteose peptone) No. 3. 10g, 쇠고기 추출물(Beef extract) 10g, 효모 추출물(Yeast extract) 5.0g, 덱스트로오스(Dextrose) 20g, 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80) 1.0g, 시트르산암모늄(Ammonium citrate) 2.0g, 아세트산나트륨(Sodium acetate) 5.0g, 황산마그네슘(Magnesium sulfate) 0.1g, 황산망간(Manganese sulfate) 0.05g, 디포타슘포스페이트(Dipotassium phosphate) 2.0g, 한천(agar) 15.0g / 1L, Difco, USA)에 도말하여, 주변에 노란색 환을 형성하는 콜로니(Colony)를 유산균 속 후보군을 분리하였다.
분리된 균주들 중 세포독성, Nitric oxide(NO) 생성 저해 활성, DPPH 자유라디칼 소거능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 실험을 통해 가장 효능이 우수한 GFC0707P 균주를 선발하였다.
<실시예 2> 선발균주 16s rRNA 염기서열 분석
최종 선발된 GFC0707P 균주의 gDNA와 Universal primer인 서열번호 1: 27F(5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3')와 서열번호 2: 1492R(5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACTT 3')을 이용하여 PCR을 수행한 다음, 16S rDNA sequence 분석을 수행하여 염기서열(서열번호 3)을 확인하였다.(도 1) 16s rDNA sequencing 결과를 바탕으로 NCBI에서 제공하는 BLAST search를 통하여 상동성 분석을 수행하였다. 상동성 분석 결과 GFC0707P 균주는 락토바실러스 (Lactobacillus) 속(genus)에 속하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)와 99.66%의 유사성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P)로 명명하였고, 국제미생물특허 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2020년 7월 16일자자로 기탁하고, 기탁번호:KCCM12764P를 부여받았다.
<실시예 3> 분홍바늘꽃 발효 추출물 제조
건조된 분홍바늘꽃 전초 1kg에 유기용매 70% 에탄올 20L를 첨가하여 7일간 상온에서 침지 추출하였다. 추출물은 Watman No.2로 감압여과한 후 Rotary vacuum evaporator(400 series, Eyela, Tokyo, Japan)로 감압농축하였으며, 농축액을 동결건조하여 분홍바늘꽃 추출물 분말을 제조하였다.
다음으로, 분홍바늘꽃 추출물 분말을 1% 함유하는 배지를 제조하여 121℃, 1.5 기압에서 15분 동안 가압 멸균하고 상온까지 냉각시켰으며, 분홍바늘꽃에서 분리한 GFC0707P 균주를 MRS broth(BD Difco, USA)에서 계대 배양한 뒤 1%(v/v)로 접종하였다. 접종 후 37℃의 incubator에서 72시간 동안 배양하여 분홍바늘꽃 추출물을 발효하였으며, Syringe filter 0.2㎛로 제균하여 최종 분홍바늘꽃 발효 추출물을 제조하였다.
<실험예 1> 세포독성 시험: WST(Water-soluble tetrazolium salt) assay
실시예 3으로부터 제조된 분홍바늘꽃 추출물 및 분홍바늘꽃 발효 추출물의 세포에 대한 자극성을 확인하기 위하여 RAW 264.7 cell을 대상으로 세포독성 실험을 진행하였다.
마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 분양받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS와 1% Penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 24well plate에 5 x 104 cell/well 씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 후 얻은 세포 배양액을 제거하고, 실시예 3으로부터 제조된 분홍바늘꽃 추출물 및 분홍바늘꽃 발효 추출물을 다양한 농도로 희석하여 시료들을 준비하였다. 농도별로 1㎕를 취하여 DMEM 배지와 혼합하고 각 well 농도별로 처리한 뒤, 이를 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배양된 배지는 제거하고, well당 10% WST-1(high sensitive Water Soluble Tetrazolium salt) 시약과 DMEM 배지와 혼합한 뒤 각 well에 처리하고 동일한 조건에서 2시간 동안 더 배양하였다. 2시간 뒤, Multi-reader(Biotec, synergy)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군으로는 시료 대신 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
세포 생존율은 아래의 수학식 1을 이용하여 계산하였다.
[수학식 1]
세포 생존율(%) = (실험군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) X 100
| Cell viability(%) | |||||||
| 농도(㎍/㎖) | 0 | 3.125 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 | 100 |
| 분홍바늘꽃 추출물 | 100.00 | 100.14 | 99.16 | 98.63 | 98.28 | 96.82 | 95.64 |
| 분홍바늘꽃 발효 추출물 | 100.00 | 96.05 | 97.79 | 99.19 | 98.55 | 96.41 | 92.65 |
그 결과, 상기 표 1 및 도 2에 나타난 바와 같이 분홍바늘꽃 추출물 및 분홍바늘꽃 발효 추출물은 사용 농도가 최고 농도인 100㎍/㎖에서도 모두 세포독성이 없는 것으로 나타난 것으로 보아, 독성이 없는 안전한 원료로 사용이 가능함을 확인하였다.
<실험예 2> Nitric oxide(NO) assay를 통한 염증유발인자 억제 시험
실시예 3으로부터 제조된 분홍바늘꽃 추출물 및 분홍바늘꽃 발효 추출물의 항염 효능을 확인하기 위하여 Nitric oxide (NO) 억제 활성을 측정하였다.
Nitric oxide(NO)는 체내에서 L-아르기닌이 시트룰린을 생성할 때 생성되는 것으로, 과잉 생성 시 우리 몸의 산화를 촉진시키는 자유 라디칼(free radial)로 알려져 있다. 염증 유발 인자인 LPS(Lipopoly- saccharide)를 RAW 264.7 cell에 처리하여 NO의 생성량을 활성화 시킨 후, Griess 분석 방법을 통해 Nitric oxide 발현양을 측정한다. LPS는 그람음성균 표층의 펩타이드글리칸을 둘러싸는 외막의 중요한 구성성분으로, 염증 유발 인자라고 알려져 있다. 이 LPS가 macrophage의 표면에 있는 receptor를 통해 macrophage에 activating signal을 주고, iNOS의 발현에 영향을 주어 NO를 많이 합성할 수 있게 한다고 알려져 있다. 이 반응을 통해 monocyte 형태인 RAW 264.7 cell이 macrophage 형태로 변하게 된다. 이러한 실험 원리에 따라 항염증 효과를 알아보기 위하여, RAW 264.7 cell을 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 24well plate에 5 x 104 cell/well 씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 후 얻은 세포 배양액을 제거하고, 실시예 3으로부터 제조된 분홍바늘꽃 추출물 및 분홍바늘꽃 발효 추출물을 다양한 농도로 희석하여 준비한 시료들을 농도별로 1㎕를 취하여 DMEM 배지와 혼합한 뒤, 각 well에 농도별로 처리하였다. 이를 다시 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이때, NO를 발현시키기 위해, LPS를 1㎍/㎖도 같이 처리하였다. 그 후 배양액 중 100㎕를 96 well plate에 취하고 Griess reagent A 50㎕와 Griess reagent B 50㎕를 각각 넣어준 뒤 각각 10분 간 반응시킨 뒤, Multi-reader(Biotec, synergy)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, Sodium nitrite를 standard로 하여 측정하였으며, LPS를 처리하지 않은 군을 대조군으로 하여, LPS와 실시예 3으로부터 제조된 분홍바늘꽃 추출물 및 분홍바늘꽃 발효 추출물을 각각 농도별로 처리한 실험군의 NO 생성 농도를 비교하였다. NO 생성 저해효과는 아래의 수학식 2를 이용하여 계산하였다.
[수학식 2]
니트릭 옥사이드 생성 저해율(%)= 100-(각 시료의 흡광도/대조군 흡광도)X100
| Nitric Oxide inhibition(%) | |||||||
| 농도(㎍/㎖) | 0 | 3.125 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 | 100 |
| 분홍바늘꽃 추출물 | 0.00 | 15.34 | 9.14 | 8.48 | 6.46 | 3.72 | 11.10 |
| 분홍바늘꽃 발효 추출물 | 0.00 | 26.77 | 29.58 | 29.58 | 35.80 | 36.00 | 37.78 |
그 결과, 상기 표 2 및 도 3에 나타난 바와 같이 분홍바늘꽃 추출물 대비 분홍바늘꽃 발효 추출물이 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 억제 활성이 현저하게 높은 것을 확인하였다. 따라서, 분홍바늘꽃 발효 추출물이 GFC0707P 균주에 의한 발효 과정을 거쳐 피부 항염 효과가 증진된 것을 확인하였다.
<실험예 3> DPPH assay를 통한 Free radical 소거 활성
실시예 3으로부터 제조된 분홍바늘꽃 추출물 및 분홍바늘꽃 발효 추출물의 항산화 효능을 평가하기 위하여 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 이용하여 자유 라디칼 소거 활성을 측정하였다.
먼저, 실시예 3으로부터 제조된 분홍바늘꽃 추출물 및 분홍바늘꽃 발효 추출물을 각각 다양한 농도로 희석하여 시료를 준비한 후, 이들 시료 50㎕와 100μM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 450㎕를 혼합하고 4℃의 암실에서 30분 동안 반응시킨 후, 96well plate에 100㎕씩 분주하여 520nm에서 흡광도를 측정하고, 자유라디칼 소거능(Free radical scavenging activity, %)을 아래의 수학식 3을 이용하여 계산하였다.
[수학식 3]
자유 라디칼 소거능(%)=100-(시료를 처리한 군의 흡광도/시료를 처리하지 않은 군의 흡광도 X 100)]
| Free radical scavenging(%) | ||||||||
| 농도(㎍/㎖) | 0 | 1.56 | 3.125 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 | 100 |
| 분홍바늘꽃 추출물 | 0.00 | 11.14 | 19.87 | 38.21 | 50.00 | 51.97 | 54.37 | 58.08 |
| 분홍바늘꽃 발효 추출물 | 0.00 | 29.19 | 53.25 | 86.59 | 90.14 | 90.93 | 91.52 | 93.49 |
그 결과, 상기 표 3 및 도 4에 나타난 바와 같이 분홍바늘꽃 추출물 및 분홍바늘꽃 발효 추출물 모두 유의성 있는 라디칼 소거 효과를 보였으며, 최고농도에서 각각 58.08%, 93.49%의 자유 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 즉, 분홍바늘꽃 추출물 대비 분홍바늘꽃 발효 추출물이 GFC0707P 균주에 의한 발효 과정을 거쳐 DPPH 라디칼소거 활성이 약 1.6배 증가하여 항산화 효과가 증진된 것을 확인하였다.
<실험예 4> Elastase inhibition assay를 통한 엘라스타아제 억제 시험
실시예 3으로부터 제조된 분홍바늘꽃 추출물 및 분홍바늘꽃 발효 추출물의 주름개선 효능을 평가하기 위하여 엘라스타아제(Elastase) 활성의 억제 효과를 측정하였다.
시험을 하기에 앞서, 엘라스타아제(Elastase)는 동물 결합조직의 불용성 탄성 섬유 단백질인 엘라스틴(Elastin)을 분해시켜 피부의 진피조기의 그물망 구조 결합을 끊어줌으로서 주름생성의 주원인인 효소로 알려져 있다. 피부의 진피 조직 속에는 콜라겐(Collagen)과 피부의 탄력성에 관련된 엘라스틴(Elastin)이 그물망 구조를 형성하고 있는데, 이러한 그물망 구조가 깨어지면서 즉 엘라스틴(Elastin)이 엘라스타아제(Elastase)에 의해 분해되어 피부가 처지고 주름이 생기므로 내인성 피부노화가 발생한다. 그러므로 피부노화의 주원인 중의 하나인 엘라스틴(Elastin) 분해효소인 엘라스타아제(Elastase)의 활성을 저하시킴으로서 피부노화를 억제할 수 있다.
주름개선 효과를 알아보기 위하여, 먼저, 실시예 3으로부터 제조된 분홍바늘꽃 추출물 및 분홍바늘꽃 발효 추출물을 각각 다양한 농도로 희석하여 농도에 따른 엘라스타아제(Elastase)억제 활성을 평가하였다. 농도별로 희석한 시료를 10mM Tris-HCl buffer(pH8.0)에 녹인 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide (S4760, Sigma) 1.6 mM 농도의 기질과 10mM Tris-HCl buffer(pH8.0)에 녹인 Elastase from porcine pancreas Type Ⅳ(E0258, Sigma) 0.4U/mL의 효소를 혼합하여 25℃에서 5분 동안 반응한 후 분광분석기 410nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 시료를 넣지 않은 것을 대조군으로 하였으며, 엘라스타아제 저해활성은 아래의 수학식 4에 의해 계산하였다.
[수학식 4]
엘라스타아제 저해활성(%)=100-(시료를 처리한 군의 흡광도/시료를 처리하지 않은 군의 흡광도 X 100)
| Elastase inhibition(%) | ||||||||
| 농도(㎍/㎖) | 0 | 1.56 | 3.125 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 | 100 |
| 분홍바늘꽃 추출물 | 0.00 | -1.97 | -4.87 | -8.70 | -7.56 | -5.49 | -4.25 | 2.80 |
| 분홍바늘꽃 발효 추출물 | 0.00 | 3.94 | 5.93 | 8.14 | 7.88 | 11.10 | 18.98 | 54.88 |
그 결과, 상기 표 4 및 도 5에 나타난 바와 같이 분홍바늘꽃 추출물 대비 분홍바늘꽃 발효 추출물이 엘라스타아제(Elastase) 억제 활성이 현저하게 높은 것을 확인하였다. 따라서, 분홍바늘꽃 발효 추출물이 GFC0707P 균주에 의한 발효 과정을 거쳐 피부 주름개선 효과가 증진된 것을 확인하였다.
결과적으로, 상기 데이터로부터 본 발명이 분홍바늘꽃 추출물 대비 분홍바늘꽃 발효 추출물이 GFC0707P 균주에 의한 발효 과정을 거쳐 항염증, 항산화 및 주름개선 효과를 현저하게 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
<제조예 1> 분홍바늘꽃 발효 추출물을 함유하는 화장료 제조
(1) 화장수 제조
하기 표 5에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 화장수를 제조하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 실시예 3 (분홍바늘꽃 발효 추출물) | 3.00 |
| 히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액) | 12.00 |
| 잔탄검(2% 수용액) | 2.00 |
| 1,3-부틸렌글라이콜 | 6.00 |
| 글리세린 | 4.00 |
| 히알루론산나트륨(1% 수용액) | 5.00 |
| 정제수 | 68.00 |
| 합계 | 100.00 |
(2) 로션 제조
하기 표 6에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 로션을 제조하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 실시예 3 (분홍바늘꽃 발효 추출물) | 3.00 |
| 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 | 1.00 |
| 수용성 콜라겐 (1% 수용액) | 1.00 |
| 시트르산나트륨 | 0.01 |
| 시트르산 | 0.05 |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 3.00 |
| 정제수 | 91.94 |
| 합계 | 100.0 |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GFC Life Science Co., Ltd
<120> Lactobacillus brevis GFC0707P and Epilobium angustifolium
Fermented extract Manufactured Using Thereof
<130> P20061
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> niversal primer 27F
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> niversal primer 1492R
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1499
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactobacillus brevis GFC0707P
<400> 3
tttgagggtg gnnnancccg tcaggacgaa cgctggcggc atgcctaata catgcaagtc 60
gaacgagctt ccgttgaatg acgtgcttgc actgatttca acaatgaagc gagtggcgaa 120
ctggtgagta acacgtggga aatctgccca gaagcagggg ataacacttg gaaacaggtg 180
ctaataccgt ataacaacaa aatccgcatg gattttgttt gaaaggtggt ttcggctatc 240
acttctggat gatcccgcgg cgtattagtt agttggtgag gtaaaggccc accaagacga 300
tgatacgtag ccgacctgag agggtaatcg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac 360
tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatggac gaaagtctga tggagcaatg 420
ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt aaaactctgt tgttaaagaa gaacaccttt 480
gagagtaact gttcaagggt tgacggtatt taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc 540
agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag 600
cgcaggcggt tttttaagtc tgatgtgaaa gccttcggct taaccggaga agtgcatcgg 660
aaactgggag acttgagtgc agaagaggac agtggaactc catgtgtagc ggtggaatgc 720
gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa ggcggctgtc tagtctgtaa ctgacgctga 780
ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga 840
tgagtgctaa gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgctg cagctaacgc attaagcact 900
ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 960
gcggtggagc atgtggttta attcgaagct acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc 1020
ttctgccaat cttagagata agacgttccc ttcggggaca gaatgacagg tggtgcatgg 1080
ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat 1140
tatcagttgc cagcattcag ttgggcactc tggtgagact gccggtgaca aaccggagga 1200
aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1260
tggacggtac aacgagtcgc gaagtcgtga ggctaagcta atctcttaaa gccgttctca 1320
gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagttgga atcgctagta atcgcggatc 1380
agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgagag 1440
tttgtaacac ccaaagccgg tgagataacc ttcgggagtc agcctctagt gtcaggttt 1499
Claims (7)
- 삭제
- 삭제
- 분홍바늘꽃 유래의 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주(기탁번호:KCCM12764P)를 분홍바늘꽃(Epilobium angustifolium) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분홍바늘꽃 발효 추출물의 제조방법.
- 제3항에 있어서, 상기 배양은 30 ~ 37℃에서 3 ~ 7일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 분홍바늘꽃 발효 추출물의 제조방법.
- 분홍바늘꽃 유래의 락토바실러스 브레비스 GFC0707P(Lactobacillus brevis GFC0707P) 균주(기탁번호:KCCM12764P)로 발효된 분홍바늘꽃 발효 추출물.
- 제5항의 분홍바늘꽃 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항염, 항산화 및 주름 개선용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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Applications Claiming Priority (1)
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-
2020
- 2020-12-24 KR KR1020200182960A patent/KR102606937B1/ko active IP Right Grant
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| Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2018,46(sup1):1051-10. |
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