KR101906309B1 - 락토바실러스 쿠르바투스 gfc-am5 균주 및 이를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

락토바실러스 쿠르바투스 gfc-am5 균주 및 이를 포함하는 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5 균주 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주(기탁번호:KCCM12245P)는 멜라닌(Melanin) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성이 우수하므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하여 화장료 조성물을 제조할 경우, 미백 및 주름 개선 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

Description

락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5 균주 및 이를 포함하는 화장료 조성물{Lactobacillus curvatus GFC-AM5, Sauerkraut Fermented Extract and The Cosmetic Composition Including The Same}
본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
사워크라우트(Sauerkraut)는 잘게 썬 양배추를 발효시켜 만든 시큼한 맛이 나는 독일식 양배추 절임이다. 채썬 양배추를 소금에 버무린 다음, 병이나 질그릇 등에 넣어 발효시켜 만든다. 발효시킬 때 향신료의 일종인 캐러웨이 씨앗을 조금 넣기도 한다. 배추를 절여 고춧가루와 버무린 뒤 발효시키는 김치를 생각하면 일종의 '독일식 김치'다. 실제로 독일인들의 식탁에 김치처럼 자주 오른다. 체코, 네덜란드, 프랑스에서도 먹는 식품이다. 독일의 경우에는 지역에 따라 사워크라우트(Sauerkraut)의 형태가 약간씩 다르다. 서부·남부에서는 푹 절여진 사워크라우트(Sauerkraut)를 따뜻하게 해 먹고, 동부·북부에서는 피클처럼 차게 해 먹는다.
사워크라우트(Sauerkraut)를 만드는 방법은, 먼저 양배추를 얇게 썰어 소금을 넉넉히 뿌린다. 으깨는 기구(Masher)를 사용하여 즙이 배어 나올 정도로 양배추를 으깬다. 양배추가 모두 잠길 정도로 충분한 양의 즙을 내야 하는데, 즙이 모자라면 물로 보충한다. 양배추와 양배추 즙을 밀폐용기에 담아 4~6주간 저장한다.
사워크라우트(Sauerkraut)는 저장 기간 중 별도로 박테리아를 주입하지 않아도 양배추 표면에 존재하는 루코노스톡(Leuconostoc), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코쿠스(Pediococcus) 등의 유산균에 의하여 발효가 진행되고, 이 과정에서 양배추의 당분이 유기산으로 전환된다. 유기산은 신맛을 낼 뿐 아니라 유해 박테리아의 활동을 저해하여 보존성을 높인다. 사워크라우트(Sauerkraut)는 15℃ 이하의 저온 환경에서 밀폐용기에 담아두면 한 달 이상 보관이 가능하다.
한편, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균을 총칭하여 유산균(Lactic acid bacteria)이라고 한다. 유산균은 장내에 서식하면서 인체의 소화계와 공생을 하며 섬유질 및 복합 단백질을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당한다. 또한, 장내 환경을 산성으로 유지시킴으로 유해세균의 성장을 억제하고 설사 및 변비 개선, 비타민 합성, 혈중 콜레스테롤 저해 등의 역할을 한다. 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특성이 있어 정장작용에 많은 도움을 주며, 대식세포 및 비장의 활성을 증진하여 면역반응에 관여하는 물질을 분비 및 촉진하는 효과를 나타낸다. 또한, 면역 조절 기능도 가지고 있어 아토피 및 알러지 관련 질환에 효과가 있다.
화장품 분야에서는 유산균 배양액이 1955년 상품화된 이후 현재까지 사용되고 있는데 주로 스트랩토코커스(Streptococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 등을 이용하여 직접 배양액에 발효하여 여과하거나 추출하는 등의 원료 형태 및 활성 소재에 접종하여 발효한 후 여과하거나 추출하는 등의 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 특히, 유용성과 안전성을 모두 갖춘 유익균으로 알려진 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus)는 락토바실러스 속 유산균으로 항암·항산화·장 질환 개선 효과를 가지는 매우 유용한 균주로서 유제품이나 건강기능식품, 화장품 등 다방면의 산업에서 유익하게 활용되고 있다.
락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus)를 이용하여 다양한 용도에 적용되고 있는 기술로는, 대한민국 등록특허공보 제10-1801764호「양모 촉진 활성을 갖는 락토바실러스 커베투스 WIKIM55 및 이를 포함하는 조성물」, 대한민국 등록특허공보 제10-1453837호「사카로미세스 세르바찌 MY7 및 락토바실러스 쿠르바투스 ML17를 유효성분으로 하는 묵은지 제조용 스타터」, 대한민국 등록특허공보 제10-1407980호「고인슐린혈증, 고혈당증 및 고중성지방혈증을 개선하는 효능을 갖는 락토바실러스 커베터스 에이취와이7601과 락토바실러스 플란타룸 케이와이1032를 유효성분으로 함유하는 제품」, 대한민국 등록특허공보 제10-0996577호「혈중 콜레스테롤 강하와 비만 억제 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 커베터스 에이취와이7601 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품」등이 개시되어 있다.
이에, 본 발명자들은 사워크라우트(Sauerkraut) 발효물에서 멜라닌(Melanin) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성을 갖는 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주(기탁번호:KCCM12245P)를 분리 동정하였고, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하여 화장료 조성물을 제조할 경우, 우수한 미백 및 주름 개선 효과를 부여할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 등록특허공보 제10-1801764호 대한민국 등록특허공보 제10-1453837호 대한민국 등록특허공보 제10-1407980호 대한민국 등록특허공보 제10-0996577호
본 발명의 목적은 사워크라우트(Sauerkraut) 발효물에서 분리된 멜라닌(Melanin) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성을 갖는 신규한 균주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 사워크라우트(Sauerkraut) 발효물에서 분리된 신규한 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 멜라닌(Melanin) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성을 갖는 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주(기탁번호:KCCM12245P)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 균주는 사워크라우트(Sauerkraut) 발효물 유래인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 사워크라우트(Sauerkraut) 발효물은 양배추와 소금을 혼합한 다음, 10 ~ 28 ℃에서 12 ~ 36시간 동안 숙성시킨 후, 4 ~ 25 ℃에서 7 ~ 28일 동안 발효된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주(기탁번호:KCCM12245P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 미백 및 주름 개선용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 한다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5 (Lactobacillus curvatus GFC-AM5 ) 균주(기탁번호:KCCM12245P)는 멜라닌(Melanin) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성이 우수하므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하여 화장료 조성물을 제조할 경우, 미백 및 주름 개선 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.
도 1은 사워크라우트(Sauerkraut) 발효물의 DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 분석 결과를 나타낸 것이다.
이에, 본 발명에서는 사워크라우트 발효물로부터 분리된 미생물로부터 멜라닌(Melanin) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성을 갖는 균주를 스크리닝하여 우수한 균주를 선발하고, 16s rRNA 염기서열 분석을 실시한 결과, 락토바실러스(Lactobacillus) 속(genus)에 속하는 신규 미생물임을 확인하였다. 이에, 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주로 명명하고 2018년 03월 30일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁하였다.
따라서, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5)(기탁번호:KCCM12245P)(이하 'GFC-AM5'로 약칭함)에 관한 것이다.
이때, 상기 GFC-AM5 균주는 사워크라우트(Sauerkraut) 발효물 유래인 것을 특징으로 한다.
상기 사워크라우트(Sauerkraut) 발효물은 양배추와 소금을 혼합한 다음, 10 ~ 28 ℃에서 12 ~ 36시간 동안 숙성시킨 후, 4 ~ 25 ℃에서 7 ~ 28일 동안 발효된 것이 GFC-AM5 균주의 멜라닌(Melanin) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성능이 현저하게 증가한다는 측면에서 바람직하다. 만일, 숙성 및 발효 조건이 상기 범위를 벗어날 경우에는 균주의 발현조건이 맞지 않아 충분한 미백 및 주름 개선 효과를 나타낼 수 없을 뿐만 아니라, 균주 증식이 되지 않기 때문에 바람직하지 않다.
상기 양배추와 소금을 혼합할 경우에는 예를들어, 심지를 제외한 양배추의 잎 부분을 얇게 채를 썰어 물에 한번 헹군 뒤 물이 완전히 빠진 후 사용하는 것일 수 있다. 다음으로 얇게 채를 썬 양배추에 소금을 넣은 후 막자사발 또는 손으로 물이 생길 때까지 으깨는 것을 특징으로 한다. 으깨어진 양배추를 소독한 유리병에 넣고, 발효시켜 최종 사워크라우트 발효물을 수득하는 것일 수 있다. 이때, 양배추를 발효시킬 유리병은 끓는 물에 소독하거나 알코올과 자외선을 이용하여 표면 살균한 후 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주(기탁번호:KCCM12245P) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 화장료 조성물은 미백 및 주름 개선용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것일 수 있다.
본 발명의 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에서, 상기 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주(기탁번호:KCCM12245P)의 배양액은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 90 중량% 함유되어 있을 수 있고, 바람직하게는 3 내지 15 중량% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 미백 및 주름 개선 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 사워크라우트 발효물 제조
국내에서 재배한 양배추(Cabbage)를 대형마트에서 구매하였다. 심지를 제외한 양배추의 잎 부분을 얇게 채를 썰어 물에 한번 헹군 뒤 물이 완전히 빠진 후 사용하였다. 얇게 채를 썬 양배추 250g에 소금 10g을 넣은 후 막자사발로 물이 생길 때까지 으깨었다. 양배추를 발효시킬 유리병은 끓는 물에 소독하거나 알코올과 자외선을 이용하여 표면 살균한 후 사용하였다. 으깨어진 양배추를 소독한 유리병에 넣고, 상온에서 24시간 동안 보관한 후 4℃에 냉장보관하여 1주일 간격으로 4주 동안 발효시켜 최종 사워크라우트 발효물을 제조하였다.
<실시예 2> 사워크라우트 발효물의 생리활성 효능
(1) 세포독성 시험 : WST assay
실시예 1로부터 제조된 사워크라우트 발효물의 발효 기간에 따른 세포에 대한 자극성을 확인하기 위해 B16-F10 멜라노마 세포와 RAW 264.7 세포를 대상으로 세포독성 실험을 진행하였다.
B16-F10 멜라노마 세포(ATCCⓡ CRL 6475™)와 RAW 264.7 세포는 96well plate(Corning 3590)에 5X10^3/well로 배양하였다. 사워크라우트 발효물을 농도별로 처리하고 48시간 이후에 DMEM media에 10% EZ-Cytox(대일, 99-EZ3000)을 혼합하여 시료 처리한 Media를 Suction한 후 1well당 100ul씩 분주하였다. 2시간 배양 후 마이크로플레이트 리더기(Microplate reader; Biotek, Synergy HT)로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
세포 생존율은 시료를 처리하지 않은 처리군(무처리군)과 비교하여 아래의 수학식 1을 이용하여 계산하였다.
[수학식 1]
세포 생존율(%) = (시료 처리군의 흡광도 / 무처리군의 흡광도) X 100
B16-F10 멜라노마 세포: Cell viability(%)
농도(㎍/㎖) 0 0.125 0.25 0.5 1 2 4
발효 0주
(발효전)		 100 101.02 99.30 96.41 94.73 84.92 72.44
발효 1주
(1일~7일)		 100 96.86 97.89 103.79 108.16 108.74 99.30
발효 2주
(8일~14일)		 100 99.48 101.54 105.01 110.87 110.05 94.97
발효 3주
(15일~21일)		 100 100.35 101.07 98.72 98.23 97.87 96.22
발효 4주
(22일~28일)		 100 99.14 98.81 98.24 96.44 95.65 94.17
RAW 264.7 세포: Cell viability(%)
농도(㎍/㎖) 0 0.125 0.25 0.5 1 2 4
발효 0주
(발효전)		 100 106.61 105.81 107.20 109.44 104.30 76.42
발효 1주
(1일~7일)		 100 104.77 105.19 109.81 110.92 102.60 87.00
발효 2주
(8일~14일)		 100 105.50 106.84 107.28 106.40 102.05 90.12
발효 3주
(15일~21일)		 100 98.77 98.00 97.52 95.82 94.22 58.44
발효 4주
(22일~28일)		 100 100.44 100.33 98.22 97.51 96.61 68.11
그 결과, 상기 표 1~2에서 확인할 수 있듯이, 발효 기간에 따른 사워크라우트 발효물은 4% 이하의 농도에서도 모두 B16-F10 멜라노마 세포와 RAW 264.7 세포에서 세포 독성이 나타나지 않아 발효 후에도 화장품에 안전한 소재로 사용이 가능함을 확인하였다.
(2) 미백 효능 시험 : 세포외 멜라닌 분석
실시예 1로부터 제조된 사워크라우트 발효물의 발효 기간에 따른 미백 효능을 확인하기 위해 세포외 멜라닌 생성 저해 효능을 확인하였다.
B16-F10 멜라노마 세포는 6well에 1.2X10^5/well로 배양하였다. 24시간 동안 배양한 이후, 멜라닌 분비를 유도하기 위해 α-MSH(Sigma M4135)를 50nM로 처리하였고 동시에 사워크라우트 발효물을 농도별로 각각 세포에 처리하였다. 이때, 멜라닌 분석을 위해 페놀이 없는 DMEM media(10% FBS, 페니실린(100 unit/ml), 스트렙토마이신(100 ug/ml)을 사용하였다. 시료 처리 48~60시간 후 세포와 배양액을 15ml Conical tube에 옮긴 후 상온에서 3,000RPM에서 10분간 원심분리를 진행하였다. 세포 외 멜라닌 분석을 위해 세포의 배양액을 96 well plate(Corning 3595)에 1well 당 100ul씩 농도별로 총 4well을 분주한 후 마이크로 플레이트 리더기로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 아래의 수학식 2를 이용하여 계산하였다.
[수학식 2]
세포 외 멜라닌 함량(%)= (시료를 처리군의 흡광도 / control군의 흡광도) X 100
Melanin inhibition(%)
농도(㎍/㎖) 0 0.25 0.5 1 2 4
발효 0주
(발효전)		 0 5.83 10.89 14.39 - -
발효 1주
(1일~7일)		 0 27.92 55.21 82.26 84.41 81.18
발효 2주
(8일~14일)		 0 30.11 60.23 81.18 80.11 75.27
발효 3주
(15일~21일)		 0 31.05 55.21 89.88 88.27 88.81
발효 4주
(22일~28일)		 0 44.44 70.97 92.03 92.57 93.65
그 결과, 상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, 발효 전 사워크라우트 발효물은 4% 적용 시 멜라닌 억제율이 나타나지 않아 미백 효과가 없는 것을 확인하였다. 반면, 사워크라우트 발효물은 4% 적용 시 발효 1주차 81.18%, 발효 2주차 75.27%, 발효 3주차 88.81%, 발효 4주차 93.65%의 멜라닌 억제율을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 발효 4주차 사워크라우트 발효물이 미백 효과가 가장 현저하게 증진된 것을 확인하였다.
(3) 항주름 효능 시험 : 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성
실시예 1로부터 제조된 사워크라우트 발효물의 발효 기간에 따른 주름 개선 효능을 확인하기 위해 세포외 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 효능을 확인하였다.
먼저, 사워크라우트 발효물을 다양한 농도로 희석한 시료를 10mM Tris-HCl buffer(pH8.0)에 녹인 1.6 mM N-석시닐-알라닌-알라닌-알라닌-p-니트로아닐라이드(N-succinyl-(Ala) 3-p-nitroanilide)(S4760, Sigma) 200㎕를 첨가한 후, 10mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)에 녹인 효소 0.4U/mL의 Elastase from porcine pancreas Type Ⅳ(E0258, Sigma)를 40㎕ 첨가하여 25℃에서 5분 동안 반응시킨 후 분광분석기 410nm에서 흡광도를 측정하였다. 엘라스타아제 저해활성은 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 아래의 수학식 4를 이용하여 계산하였다.
[수학식 4]
엘라스타아제 저해활성(%) = 100-(시료 처리군의 흡광도/시료 무처리군의 흡광도 X 100)
Elastase inhibition(%)
농도(㎍/㎖) 0 0.125 0.25 0.5 1 2 4
발효 0주
(발효전)		 0 - - 1.42 6.25 12.05 16.77
발효 1주
(1일~7일)		 0 5.13 6.33 7.25 10.41 14.55 23.48
발효 2주
(8일~14일)		 0 2.35 4.52 8.57 16.02 23.95 41.43
발효 3주
(15일~21일)		 0 - - 16.77 17.99 27.66 31.09
발효 4주
(22일~28일)		 0 - - 26.62 28.21 31.33 49.08
그 결과, 상기 표 4에서 확인할 수 있듯이, 발효 전 사워크라우트 발효물은 4% 적용 시 엘라스아타제(Elastase) 저해 활성능이 16.77%인 것으로 주름 개선 효능이 매우 낮음을 확인하였다. 반면, 사워크라우트 발효물은 4% 적용 시 발효 1주차 23.48%, 발효 2주차 41.43%, 발효 3주차 31.09%, 발효 4주차 49.08%의 엘라스아타제(Elastase) 저해 활성능을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 발효 4주차 사워크라우트 발효물이 주름 개선 효과가 가장 현저하게 증진된 것을 확인하였다.
<실시예 3> 미생물의 분리 및 동정
4주간의 발효기간 동안 1주일 간격으로 발효된 사워크라우트 발효물에서 미생물을 분리동정하고, 미생물 군집구조 확인을 위해 DNA를 채취하였다.
먼저, 1주일 간격으로 4주 동안 발효된 사워크라우트 발효물 샘플 4종을 채취하여 증류수에 10배로 희석한 후 균체가 잘 떨어지도록 5분 동안 세게 Vortexing 하였다. Vortexing한 희석액을 다시 10배씩 희석하여 도말하였다. 10-2에서 10-5까지 연속희석법(Serial dilution)으로 희석한 다음, 유산균의 배양에 사용되는 MRS 고체배지(Proteose peptone No. 3. 10g, Beef extract 10g, Yeast extract 5.0 g, Dextrose 20g, Polysorbate 80 1.0g, Ammonium citrate 2g, Sodium acetate 5.0g, Magnesium sulfate 0.1g, Manganese sulfate 0.05g, Dipotassium phosphate 2g, agar 15.0g / 1L, Difco, USA)에 각 희석배율을 100㎕씩 분주하여 화염멸균된 유리봉으로 도말한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 생성된 단일 콜로니를 새로운 MRS 고체배지에 순수 분리하여 37℃에서 48시간 배양하였다. 순수분리된 균주는 MRS 액체배지에 접종하여 같은 조건으로 배양한 다음, DNA Purification kit(Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega,USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 Template로 하여 미생물을 동정하기 위한 16s rRNA PCR을 진행하였다. Universal primer인 서열번호 1: 27F(5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3')와 서열번호 2: 1492R(5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACTT 3')을 사용하여 약 1.5kb의 염기서열을 얻었으며 ㈜마크로젠에 Sequencing 의뢰하여 염기서열 결과를 ㈜ 천랩에서 운영하는 16S rRNA Sequencing data base인 Ezbiocloud를 통하여 동정 확인하였다. 4주간의 발효기간 동안 분리 및 동정된 미생물은 모두 유산균으로 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)인 것을 확인할 수 있었다.
사워크라우트 발효물에서 분리 및 동정된 미생물은 다음 표 5와 같다.
분리원 계통학적 분류 상동성
사워크라우트 발효물 락토바실러스 쿠르바투스
(Lactobacillus curvatus)		 99.79
류코노스톡 메센테로이데스
(Leuconostoc mesenteroides subsp. Dextranicum)		 99.79
락토바실러스 사케이
(Lactobacillus sakei subsp. Sakei)		 99.16
<실시예 4> 사워크라우트 발효물에서 분리동정된 균주 3종의 생리활성 효능
실시예 3으로부터 분리된 3종의 균주인 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)의 Single colony를 각각 플라스크에 투입 후 MRS 배지에서 37℃, 48시간의 조건에서 배양하였다. 현탁 배양한 균액은 원심 분리 후 상등액을 수득하여 0.22㎛ 필터로 여과하여 균체를 제거 한 후 사용하였다.
상기 제조된 3종의 균주 배양액으로 생리활성을 확인하였다.
생리활성 실험은 세포독성 실험, 멜라닌(Melanin) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성능을 확인하였고, 실시예 2의 실험방법과 동일하게 진행하였으며, 그 결과는 아래 표 6~9와 같다.
B16-F10 멜라노마 세포: Cell viability(%)
농도(㎍/㎖) 0 0.125 0.25 0.5 1 2 4
락토바실러스
쿠르바투스		 100 100.54 101.67 101.25 101.87 98.10 98.91
류코노스톡
메센테로이데스		 100 100.73 101.21 99.32 97.98 97.40 96.35
락토바실러스
사케이		 100 100.40 100.63 100.00 99.08 97.95 98.56
RAW 264.7 세포: Cell viability(%)
농도(㎍/㎖) 0 0.125 0.25 0.5 1 2 4
락토바실러스
쿠르바투스		 100 116.26 119.77 126.77 126.54 132.36 135.88
류코노스톡
메센테로이데스		 100 111.26 114.61 119.28 119.19 121.60 110.10
락토바실러스
사케이		 100 108.43 109.45 123.37 122.32 124.35 125.80
Melanin inhibition(%)
농도(㎍/㎖) 0 0.25 0.5 1 2 4
락토바실러스
쿠르바투스		 0 3.50 5.83 7.78 23.72 40.05
류코노스톡
메센테로이데스		 0 7.39 14.39 26.05 34.60 41.21
락토바실러스
사케이		 0 4.67 6.22 15.55 21.77 34.60
Elastase inhibition(%)
농도(㎍/㎖) 0 0.5 1 2 4
락토바실러스
쿠르바투스		 100 1.39 10.96 37.29 83.86
류코노스톡
메센테로이데스		 100 -0.55 2.59 9.31 41.82
락토바실러스
사케이		 100 -2.60 8.40 42.22 85.87
그 결과, 상기 표 6~7에서 확인할 수 있듯이, 4% 이하의 농도에서도 모두 B16-F10 멜라노마 세포와 RAW 264.7 세포에서 세포 독성이 나타나지 않아 발효 후에도 화장품에 안전한 소재로 사용이 가능함을 확인하였다.
또한, 상기 표 8에서 확인할 수 있듯이, 3종의 균주 배양액을 4% 적용 시 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) 40.05%, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 41.21%, 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 34.60%의 멜라닌 억제율을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주가 미백 효과가 가장 우수한 것을 확인하였다.
또한, 상기 표 9에서 확인할 수 있듯이, 3종의 균주 배양액을 4% 적용 시 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) 83.66%, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 41.82% 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 85.87%의 엘라스아타제(Elastase) 저해 활성능을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주가 주름 개선 효과가 가장 우수한 것을 확인하였다.
결과적으로, 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) 균주가 멜라닌(Melanin) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성이 가장 우수한 것을 확인하였다.
따라서, 사워크라우트 발효물에서 분리된 균주들 중 멜라닌(Melanin) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 실험을 통해 가장 효능이 우수한 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) 균주를 선발하였다.
상기 선발된 분리 균주는 락토바실러스(Lactobacillus) 속(genus)에 속하는 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) 균주와 99.79%의 유사성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5 (Lactobacillus curvatus GFC-AM5)으로 명명하였고, 국제미생물특허 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2018년 03월 30일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM12245P를 부여받았다.
<실시예 5> DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 분석
4주간의 발효기간 동안 1주일 간격으로 발효된 사워크라우트 발효물을 채취하여 미생물의 genomic DNA를 채취하였다. 사워크라우트 발효물을 1.5ml Microcentrifuge tube에 담아 13,500rpm에 3분간 원심분리하여 균체를 모아 그 Pellet 부분을 FastDNA SPIN kit(MP Biomedical, France)를 사용하여 gDNA를 추출하였다. 4주간의 발효기간 동안 1주일 간격으로 발효된 사워크라우트 발효물의 샘플 총 4개와 분리하여 얻은 미생물 3종인 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)의 특정 부분 16s ribosomal DNA 증폭을 위해 GC clamp가 달린 서열번호 3: GC341F (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG- 3) Forward primer와 서열번호 4: 518R (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3') Reverse primer를 사용하여 16s PCR을 실시하였다. PCR 반응 조성은 3차 증류수 19㎕, Forward primer GC 341F 2㎕, Reverse primer 518R 2㎕, gDNA를 Template로 2㎕, GoTaqⓡ Colorless Master Mix(Promega, USA) 25㎕를 첨가하여 총 부피 50㎕로 진행하였다. PCR 반응 조건은 Pre-heating 98℃에서 5분, Denaturation 98℃에서 30초, Annealing 65℃에서 시작하여 1cycle 마다 0.2℃씩 온도가 내려가게 하여 30초, Extention 72℃에서 30초, 30회 반복하여 Stabilization 72℃에서 3분동안 진행하였다. 이때, PCR 기기는 C1000-Dual (Bio-Rad, USA)를 사용하였고, DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 분석 전까지 PCR products는 4℃에 보관하였다.
DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 분석은 D-code system (Bio-rad, USA)을 이용하여 진행하였고, 분석을 위해 Polyacrylamide gel을 제작하였다. 100% Denaturing solution은 20ml Formanide, 21g Urea(BIO-RAD,USA), 나머지는 증류수로 채워 50ml을 제작하였다. 60% 고농도와 40% 저농도로 농도구배된 8% Acrylamide gel(40% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1, BIO-RAD, USA)을 제작하는데, 60% 고농도 Solution의 조성은 40% Acrylamide 2.4ml, 50X TAE buffer 0.24ml, 100% Denaturing solution 7.2ml, 증류수 2.16ml이고, 40% 저농도 Solution 의 조성은 40% Acrylamide 2.4ml, 50X TAE buffer 0.24ml, 100% Denaturing solution 4.8ml, 증류수 4.56ml이다. 각 최종 부피는 12ml이며, 각 농도 Solution에 10% APS(Ammonium Persulfate) 70㎕와 TEMED(BIO-RAD,USA) 7㎕를 사용하여 Gel을 굳혔다. 약 3시간에서 4시간정도 굳힌 후 1X TAE buffer를 D-code system tank에 채우고 굳혀진 gel을 고정시킨 후 6X Loading dye와 PCR product를 혼합하여 50V, 400Am, 850분으로 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝나면 Red safe(Intron,Korea) 1L 용액에서 15분에서 30분 동안 염색한 후 ChemiDoc(BIO-RAD,USA)을 이용하여 밴드를 확인하였으며, 각 밴드를 잘라 증류수에 담아 12시간 이상 DNA extract하여 확인용 PCR의 Template로 사용하였다. 밴드의 Sequencing 확인을 위해 서열번호 5: 341F(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG- 3) Forward primer와 서열번호 6: 518R (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3') Reverse primer를 사용하여 16s PCR을 실시한 후 ㈜마크로젠에 Sequencing 의뢰하여 염기서열 결과를 ㈜ 천랩에서 운영하는 16S rRNA sequencing data base인 Ezbiocloud를 통하여 동정 확인하였다.
Sequence file name Closet relative Sequence ID Similarity (%)
1-1 Lactobacillus sakei MF429525 98
2-1 Lactobacillus curvatus MF428998.1 99
3-1 Leuconostocmesenteroides LT853608.1 99
4-1 Weissellaparamesenteroides MF429758.1 94
4-2 Lactobacillus curvatus MF428998.1 98
4-3 Uncultured Nitrosomonassp CP010523.2 87
5-1 Lactobacillus curvatus MF428998.1 97
6-1 Lactobacillus curvatus MF428998.1 98
7-1 Weissellaparamesenteroides MF429758.1 96
7-2 Lactobacillus curvatus MF428998.1 99
그 결과, 표 10 및 도 1에서 확인할 수 있듯이, DGGE에서 나타난 밴드의 염기서열 분석 미생물 동정 결과, 1주차에서 4주차 발효기간에 다양한 균주가 확인 되었다. 1, 2, 3번 Lane에 전기영동한 균주와 각각의 사워크라우트 발효물에서 나타난 밴드의 위치가 동일한 균주는 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주(기탁번호:KCCM12245P)로 나타났고 4주차에 가장 현저하게 증가되는 것을 확인하였다. 이로 인해 발효가 진행되면서 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주(기탁번호:KCCM12245P)가 사워크라우트 발효물에서 우점하고 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 1~3주차 발효를 통해 수득한 사워크라우트 발효물 대비 4주차 발효를 통해 수득한 사워크라우트 발효물의 생리활성 효능이 현저하게 높은 이유는 멜라닌(Melanin) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성이 우수한 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주(기탁번호:KCCM12245P)에 의한 것으로 확인할 수 있었다.
<제조예 1> GFC-AM5 균주 배양액을 함유하는 화장료 제조
(1) 화장수 제조
하기 표 11에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 화장수를 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 4 (GFC-AM5 균주 배양액) 3.00
히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액) 12.00
잔탄검(2% 수용액) 2.00
1,3-부틸렌글라이콜 6.00
글리세린 4.00
히알루론산나트륨(1% 수용액) 5.00
정제수 to 100
합계 100.00
(2) 로션 제조
하기 표 12에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 로션을 제조하였다.
성분 함량(중량%)
실시예 4 (GFC-AM5 균주 배양액) 3.00
아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00
수용성 콜라겐 (1% 수용액) 1.00
시트르산나트륨 0.01
시트르산 0.05
1,3-부틸렌글리콜 3.00
정제수 to 100
합계 100.0
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국미생물보존센터(KCCM) KCCM12245P 20180330
<110> GFC Life Science Co., Ltd. <120> Lactobacillus curvatus GFC-AM5, Sauerkraut Fermented Extract and The Cosmetic Composition Including The Same <130> P17190 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 27F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 1492R <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer GC341F <400> 3 cctacgggag gcagcag 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 518R <400> 4 attaccgcgg ctgctgg 17 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 341F <400> 5 cctacgggag gcagcag 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 518R <400> 6 attaccgcgg ctgctgg 17

Claims (5)

  1. 멜라닌(Melanin) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성을 갖는 사워크라우트(Sauerkraut) 발효물 유래의 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주(기탁번호:KCCM12245P).


  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 사워크라우트(Sauerkraut) 발효물은 양배추와 소금을 혼합한 다음, 10 ~ 28 ℃에서 12 ~ 36시간 동안 숙성시킨 후, 4 ~ 25 ℃에서 7 ~ 28일 동안 발효된 것을 특징으로 하는 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AM5(Lactobacillus curvatus GFC-AM5) 균주(기탁번호:KCCM12245P).
  4. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 미백 및 주름 개선용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
KR1020180062543A 2018-05-31 2018-05-31 락토바실러스 쿠르바투스 gfc-am5 균주 및 이를 포함하는 화장료 조성물 KR101906309B1 (ko)

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KR1020180062543A KR101906309B1 (ko) 2018-05-31 2018-05-31 락토바실러스 쿠르바투스 gfc-am5 균주 및 이를 포함하는 화장료 조성물

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KR102058622B1 (ko) 2019-08-27 2019-12-23 주식회사 아미코스메틱 여드름 유발 피부상재균에 대한 항균 활성을 갖는 락토바실러스 쿠르바투스

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JP2005145882A (ja) 2003-11-14 2005-06-09 Ichimaru Pharcos Co Ltd 化粧料組成物
WO2012108565A1 (ko) * 2011-02-10 2012-08-16 Joo Hyo Kyung 양배추 김치 제조 방법
KR101760766B1 (ko) * 2016-12-27 2017-07-24 강희철 신규한 락토바실러스 쿠르바투스 gfc-aj6 균주, 상기 균주를 이용한 폴리아민 함유 유산균 발효물 및 이의 제조방법
KR101801764B1 (ko) 2017-06-01 2017-11-27 한국식품연구원 양모 촉진 활성을 갖는 락토바실러스 커베투스 wikim55 및 이를 포함하는 조성물

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