KR20200129695A

KR20200129695A - 해방풍 추출물의 유산균 발효물, 그 제조방법 및 용도

Info

Publication number: KR20200129695A
Application number: KR1020190054488A
Authority: KR
Inventors: 홍선미; 김태하; 주은신; 김정아; 최성창; 박현미
Original assignee: 재단법인 환동해산업연구원
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2020-11-18
Also published as: KR102265388B1

Abstract

본 발명은 해방풍 추출물의 유산균 발효물과 그 제조방법 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명의 해방풍 추출물의 유산균 발효물은 발효 전 추출물에 비해 가바 함량이 높은 특성을 가지며, 항멜라닌 활성, 우수한 항산화 활성, 항균활성 및 생체 안전성을 가져 화장료 및 식품 조성물로서 유용하다.

Description

해방풍 추출물의 유산균 발효물, 그 제조방법 및 용도 {Fermented product of Glehnia littoralis extract, preparation method and use thereof}

본 발명은 해방풍 추출물의 유산균 발효물과 이를 포함하는 화장료 또는 식품 조성물 및 상기 발효물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해방풍의 용매 추출물을 유산균을 이용하여 발효시킨, 항멜라닌, 항산화, 가바 생산 증가, 항균 효능을 가지는 해방풍 추출물의 유산균 발효물 및 이를 유효성분으로 하는 제품에 관한 것이다.

해방풍(Glehnia littoralis)은 산형과에 속하는 여러해살이 풀로 대한민국 해안가 모래땅에 자생하며 일본, 만주, 중국 등지에 분포하는 약용식물이었지만 최근 재배기술이 개발되어 동해안의 강원도 및 경상북도에서 재배작물화 되며 산업적 활용이 증가하고 있다. 방풍(Saposhnikovia divaricate) 과 구별되는 별개의 식물로, 한의학에서는 방풍보다 사삼(잔대)과 그 약효가 비슷한 것으로 알려져 있다.

한편, 가바(r-aminobutyric acid, GABA)는 자연계에 널리 분포하는 비단백질 구성 아미노산으로서, 고등생물의 중추신경계에서 GABA는 억제성 신경전달물질로 알려져 있다. 사람에 있어서는 신경계, 혈액에 함유되어 있으나, 대부분은 뇌의 골수에 존재하여 아세틸콜린(acetylcholine)이라 불리는 신경전달 물질을 증가시키고 뇌기능을 촉진시키는 생리작용 이외 혈압강하, 이뇨, 항산화, 성장호르몬 조절에 관여하는 물질로 알려져 있다(Chang et al., 1992; Shelp et al., 1999;Park et al., 2002).

가바 함량이 많은 천연물로는 현미, 발아현미, 녹차, 뽕잎 등이 알려져 있다. 하지만 천연물 자체의 낮은 가바 함량으로는 약리작용을 발휘하기에는 한계가 있어, 가바를 고농도로 생산하기 위한 연구 개발의 필요성이 인정된다. 종래 가바 생산을 증가시키는 방법은 대부분 천연물이 가지고 있는 글루타민을 탈탄소화 반을을 통해 가바를 생산하는 것이나, 이 경우 천연물이 갖고 있는 글루타민의 양에 의해 가바 생산량이 결정되는 한계가 있다. 따라서 이러한 한계를 극복하기 위해 미생물에 의한 가바 생산 연구가 진행되었다. 가바의 산업적 생산에 관한 연구는 고농도 생산을 위한 방법이었으나 가바 효능이 극대환 된 소재 개발은 미비한 상태이다.

이러한 배경하에서 본 발명자들은 해방풍의 추출물에서 유산균을 배양하여 얻은 발효물이 가바(r-aminobutyric acid, GABA) 함량을 높이는 한편 비듬균, 여드름균, 충치균 등에 대한 항균 효과 등을 나타낼 수 있어 기능성 화장료, 염증성 질환 치료용 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 해방풍 추출물의 유산균 발효물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 해방풍의 용매 추출물을 얻는 단계, 상기 용매 추출물에 유산균을 접종하고 발효하는 단계를 포함하는, 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 항산화 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 피부 미백, 항산화, 여드름 예방, 개선 및 치료용, 충치 예방, 개선 및 치료용, 및 비듬 예방, 개선 및 치료용으로 이루어진 군에서 1종 이상의 용도를 갖는 의약, 식품 또는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 해방풍 용매 추출물의 유산균 발효물, 이의 제조방법 및 피부 미백, 항산화, 여드름 예방, 개선 및 치료용, 충치 예방, 개선 및 치료용, 및 비듬 예방, 개선 및 치료용으로 이루어진 군에서 1종 이상의 용도에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.

본 발명의 일 예는 해방풍 추출물의 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물은, 해방풍의 용매 추출물에 유산균을 접종하여 배양 또는 발효함으로써 얻어지는 것이다.

본 발명에서 해방풍 추출물의 유산균 발효물은 (i) 해방풍의 용매 추출물에 유산균을 배양하여 발효시킨 액상 발효물, (ii) 상기 해방풍 추출물의 액상 발효물을 동결건조하고 분말화한 분말 발효물, 및 (iii) 상기 액상 발효물을 여과하고 상층액을 분리한 후, 동결건조하고 분말화한 발효물의 상층액 분말 모두를 포함할 수 있으며, 상기 (i) 내지 (iii)에 포함된 유효 구성성분을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 해방풍 추출물의 유산균 발효물은, 해방풍의 용매 추출물을 얻는 단계, 상기 용매 추출물에 유산균을 접종하고 발효하는 단계를 포함하는, 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 제조하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 제조 방법은 유산균을 배양하여 발효시킨 액상 발효물을 건조하는 단계를 추가로 수행할 수 있으며, 상기 건조는 바람직하게는 동결건조일 수 있다.

본 발명이 제공하는 해방풍 추출물의 유산균 발효물은, 하기의 4가지 중 하나 이상의 특성을 가질 수 있다:

i) 해방풍 용매 추출물의 미발효물에 비해 높은 1.01배 내지 10배 높은 가바 함량,

ii) 해방풍 용매 추출물의 미발효물에 비해 높은 1.3배 내지 3배 높은 항산화 활성,

iii) 해방풍 용매 추출물의 미발효물에 비해 높은 항멜라닌 활성, 및

iv) 여드름균, 비듬균 및 충치균으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 박테리아에 대한 항균 활성.

본 발명의 일 예는 해방풍 추출물의 유산균 발효물의 제조방법에 관한 것으로서, 해방풍의 용매 추출물을 얻는 단계, 상기 용매 추출물에 유산균을 접종하고 발효하는 단계를 포함하는, 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이하, 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 제조하는 방법에 대해 상술하고자 한다.

본 발명이 제공하는 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 제조하는 방법은, 상기 유산균 발효 단계 이후 발효물을 건조, 바람직하게는 동결건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 동결건조된 발효물은 그 활성이 유지되는 범위에서 보관될 수 있으며, 필요시 적절한 용매에 혼합하여 이용될 수 있다. 상기 동결 건조 단계를 추가로 포함함으로써, 본 발명이 제공하는 해방풍 추출물의 유산균 발효물의 보존성을 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 해방풍 추출물의 유산균 발효물의 제조방법에서 상기 해방풍의 용매 추출물을 얻는 단계는 식물로부터 용매 추출물을 얻기 위한 통상의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, "해방풍"은 해방풍의 잎, 뿌리, 꽃잎, 꽃받침, 열매 및 줄기로 이루어진 군에서 선택 되는 하나 이상의 부위를 포함한다.

상기 해방풍의 용매 추출물은, 해방풍, 해방풍의 건조물 및 해방풍 또는 건조 해방풍의 분쇄물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 추출 용매로 추출하여 제조된다.

상기 용매 추출물의 제조에 사용되는 해방풍은, 해방풍을 열풍건조, 마이크로웨이브, 동결건조 등의 방법으로 건조한 후, 분쇄기로 분말화한 분말일 수 있다. 이 때 분말의 입자 크기에 제한은 없으며, 일반 분쇄기 또는 식품용 믹서기를 이용하여 제조한 분말일 수 있다. 또는, 상기 해방풍을 동결한 후, 버퍼와 함께 마쇄한 분말을 사용할 수 있다. 상기 제조한 분말을 추출물 제조에 바로 사용할 수 있으며, -20 내지 -70 ℃ 조건에서 보관하여 필요에 따라 사용할 수 있다. 또는, 상기 해방풍을 건조하지 않고 -70 ℃에서 냉동 보관한 후, 용매를 넣고 분쇄하여 이용할 수 있다.

상기 해방풍의 분말을 이용하는 경우, 용매 추출 이전에 분말과 용매를 혼합하기 위한 혼합 단계, 예를 들어, 초음파 또는 볼텍스 챔버를 사용할 수 있다. 상기 초음파를 이용한 혼합 단계는, 해방풍의 세포막 내 유효물질이 잘 용해되도록 하는 역할을 수행하며, 세포 파쇄 목적을 달성할 수 있으면서 단백질 또는 기타 물질의 변성을 일으키지 않는 범위에서 자유롭게 사용할 수 있다. 예를 들어, 750watt, 10kHz에서 10초 간격으로 5분간 조사하여 해방풍 분말과 추출 용매를 혼합할 수 있다.

상기 용매 추출방법은 통상의 추출법을 사용할 수 있으며, 추출 용매에 의한 추출, 초임계 유체 추출, 초음파 추출, 열수 추출 등의 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 열수 추출방법을 사용할 수 있다. 상기 용매추출 시간은 4 내지 6시간, 또는 5 내지 6시간일 수 있다.

상기 추출용매는 물, 주정, 탄소수 1 내지 3인(C1 내지 C3) 알코올, 해양심층수 및 염지하수로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 물 또는 에탄올(EtOH)일 수 있다. 상기 해양 심층수는 해수 표층으로부터 200m 이상의 깊이의 바닷물을 의미한다. 상기 염지하수는 미네랄을 함 유하는 물로서, 저염지하수 및 염수지하수를 모두 포함하는 것일 수 있으며, 염분의 농도가 0.3‰(permilliage) 이상의 지하수일 수 있다.

상기 용매 추출 방법으로 열수 추출방법을 이용하는 경우, 60 내지 100℃, 70 내지 90℃, 또는 80 내지 90℃, 바람직하게는 85℃의 열수에서 3 내지 10시간, 4 내지 8시간, 4 내지 6시간, 또는 5 내지 6시간 추출을 수행할 수 있다.

예를 들어, 해방풍 열수 추출물을 얻기 위해, 해방풍 분말 50 내지 100g을 물 900 내지 1L로 혼합하여 해방풍:물의 비율이 0.5:9 내지 1:9의 중량비가 되도록 첨가한 후, 750watt, 10kHz에서 10초 간격으로 5분간 초음파를 조사하여 분말과 물을 혼합하고, 혼합물을 85℃의 열수에서 4시간 내지 6시간 동안 진탕배양한 후, 배양한 추출물을 7000rpm로 10분간 원심분리하여 0.8um coring bottle-top을 사용하여 진공 여과하여 약 800 내지 900mL(80 내지 90%)의 해방풍 열수 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명의 해방풍 열수 추출물은 액상으로 이용되거나, 액상의 해방풍 열수 추출물을 동결건조 후 분말화한 분말 형태로 이용될 수 있다. 상기 분말화 한 해방풍 열수 추출물은 필요에 따라 물에 혼합하여 액상 형태로 만들어 발효물 제조 공정에 이용될 수 있다.

상기 유산균 발효에 이용되는 해방풍 용매 추출물은, 후처리 공정의 처리가 있거나 없을 수 있다. 상기 후처리 공정은 통상의 기술자가 본 발명의 목적을 달성하기 위한 범위 내에서 제한 없이 선택할 수 있으며, 예를 들어, 원심분리, 여과, 정제 및 멸균으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 공정일 수 있다. 상기 멸균은 고온고압 멸균일 수 있으며, 바람직하게는 121℃, 0.12MPa 조건에서 20분간 멸균 과정을 거치는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 해방풍 추출물의 유산균 발효물의 제조방법에서 상기 해방풍의 용매 추출물에 유산균을 접종하고 발효하는 단계를 수행한다.

상기 해방풍 추출물은 첨가물 없이 그 자체로 발효 원료로 사용될 수 있으며, 또는 발효를 위한 첨가물이 포함된 후 발효 원료로 이용될 수 있다.

상기 첨가물은 상술한 바와 같다. 본 발명에 따른 해방풍 용매 추출물의 유산균 발효물은, 해방풍 용매 추출물을 그대로 발효 원료로 사용하거나, 후처리 공정으로 처리하여 발효 원료로 사용하여 제조될 수 있다. 상기 후처리 공정은, 예를 들면, 원심분리, 여과, 정제 및 멸균으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 공정을 필요에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 상기 공정의 종류에 제한되는 것은 아니다.

상기 해방풍 추출물은 첨가물 없이 그 자체로 발효 원료로 사용될 수 있으며, 또는 발효를 위한 첨가물을 추가로 포함하여 유산균의 발효 원료로 이용될 수 있다.

상기 첨가물은, 탄소원 또는 질소원일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 탄소원은 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 덱스트로스(dextrose), 글루코스(glucose), 수크로스(sucluse), 락토스(lactose), 및 갈락토오스(galactose)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 질소원은 소고기 추출물(beef extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 및 스킴밀크(skim milk) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가물을 사용할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 발효 원료로 이용되는 해방풍 추출물은 상기 첨가물의 첨가 없이도 우수한 유산균 증식 효과를 가질 수 있다. 구체적으로, 본 발명이 제공하는 해방풍 추출물은 첨가물이 첨가되지 않은 조건에서, MRS 배지(de Man Rogasa and Sharpe)에 비해 2배 내지 300배, 2배 내지 200배, 2배 내지 150배, 2배 내지 100배, 2배 내지 50배, 2배 내지 30배, 2배 내지 20배, 2배 내지 15배, 2배 내지 10배, 4배 내지 300배, 4배 내지 200배, 4배 내지 150배, 4배 내지 100배, 4배 내지 50배, 4배 내지 30배, 4배 내지 20배, 4배 내지 15배, 또는 4배 내지 10배의 유산균 증식 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 해방풍 추출물의 유산균 발효물 제조에 사용되는 유산균은, 제한 없이 사용 가능하며, 바람직하게는 가바를 생산하는 특성을 가지는 유산균일 수 있다. 예를 들어, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 부흐네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란터룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토코쿠스 락틱스(Lactoccocus lactics), 락토바실러스 델브류키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus) 및 페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유산균일 수 있다. 바람직한 일 예는, 락토바실러스 플란터룸, 페디오코쿠스 에시디락티시, 또는 락토바실러스 플란터룸과 페디오코쿠스 에시디락티시의 조합을 이용하여 발효물을 제조한다.

상기 락토바실러스 플란터룸 균주는, 서열번호 5의 염기서열과 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 가지는 16S rRNA 유전자 염기서열을 포함하는 균주일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 16S rRNA 서열을 포함하는 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2018년 8월 10일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁된 수탁번호 KCCM12299P 균주일 수 있다.

상기 페디오코쿠스 에시디락티시 균주는, 서열번호 6의 염기서열과 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 가지는 16S rRNA 유전자 염기서열을 포함하는 균주일 수 있으며, 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 16S rRNA 서열을 포함하는 균주일 수 있으며, 바람직하게는 한국미생물보존센터(KCCM)에 2019년 3월 29일자로 기탁된 수탁번호 KCCM12472P 균주일 수 있다.

상기 락토바실러스 플란터룸 및 페디오코쿠스 에시디락티시 균주는 MRS 배지를 이용하여 30 내지 37 ℃에서 배양될 수 있다. 상기 락토바실러스 플란터룸 및 페디오코쿠스 에시디락티시 균주는 탄소원 또는 질소원이 첨가되지 않은 해방풍 추출물 또는 해방풍 열수 추출물을 배지로 이용하여 25 내지 40℃ 온도 범위에서 배양될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물의 발효물 제조에 있어서, 상기 유산균의 접종량은 1x10⁸ 내지 1x10¹⁵ cfu/ml, 1x10⁸ 내지 1x10¹² cfu/ml, 또는 1x10⁸ 내지 1x10¹⁰ cfu/ml 일 수 있다.

본 발명에 따른 해방풍 추출물의 유산균 발효물의 제조에 있어서, 발효 온도는 25 내지 40℃, 25 내지 35℃, 또는 30℃에서 수행될 수 있으며, 발효 시간은 12 내지 60시간, 18 내지 53시간 또는 24시간 내지 48시간일 수 있다. 온도와 배양 시간이 상기 범위 외일 경우, 유산균의 기능성이 유지될 수 있을 정도의 유산균의 생균수가 유지되지 않고, 사균 발생의 우려가 있다.

i) 해방풍 용매 추출물의 미발효물에 비해 1.01배 내지 10배 높은 가바 함량,

ii) 해방풍 용매 추출물의 미발효물에 비해 1.3배 내지 3배 높은 항산화 활성,

iv) 여드름균, 비듬균, 치아우식균 및 충치균으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 박테리아에 대한 항균 활성.

본 발명이 제공하는 해방풍 추출물의 유산균 발효물은, 발효 전 해방풍 추출물 또는 미발효 해방풍 추출물에 비해 높은 가바 함량을 가질 수 있다. 구체적으로, 미발효 해방풍 추출물에 비해 1.01 내지 10배. 1.01 내지 5배, 1.01 내지 4배, 1.01 내지 3.7배, 1.05 내지 10배, 1.05 내지 5배, 1.05 내지 4배, 1.05 내지 3.7배, 1.1 내지 10배, 1.1 내지 5배, 1.1 내 0.1%와 1% 농도에서 각각 0.43ng/ml 및 0.87ng/ml로 가바 함량이 증가하였다. 해방풍 뿌리 추출물의 경우, 발효 전에는 해방풍 뿌리 추출물의 0.1% 및 1% 농도에서 가바 함량이 각각 0.38ng/ml 및 0.49ng/ml이었으나, 발효 후에는 0.46ng/ml 및 1.31ng/ml로 증가하여, 해방풍 추출물에 유산균을 배양한 모든 발효물에서 가바 함량이 증가하였다.

따라서, 본 발명이 제공하는 해방풍 추출물의 유산균 발효물은 가바 함량이 높아 식품 및 화장품에 적용시 높은 기능성을 기대할 수 있으며, 특히 가바성분이 증가 된 해방풍추출발효물은 진정효과, 항스트레스 효과, 항산화, 염증완화와 예방 및 혈행 조절의 작용과 세포의 활성을 조절하여 단기간에 세포활성화에 도움을 줄 수 있다.

본 발명이 제공하는 해방풍 추출물의 유산균 발효물은, 미발효 해방풍 추출물에 비해 우수한 항산화 활성을 가질 수 있다. 본 발명에서 상기 항산화 활성은, 자유라디칼 소거능을 의미한다. 일 구현예에서, 해방풍 잎 추출물의 유산균 발효물은, 미발효물의 자유라디칼 소거능에 비해 1.3 내지 3배, 1.3 내지 2배, 또는 1.3 내지 1.5배 높은 자유라디칼 소거능을 가질 수 있다.

상기 자유라디칼 소거능은 DPPH 억제율로 표현될 수 있으며, DPPH 억제율은 하기 수학식 1의 방법으로 계산될 수 있다.

[수학식 1]

DPPH 억제율(scavenging activity, %) = (1-OD sample/OD blind) x 100

상기 수학식 1에서 OD sample은 측정 대상 샘플의 흡광도이고, OD blind는 어떤 시료도 첨가하지 않은 DPPH 용액의 흡광도이다.

본 발명이 제공하는 해방풍 추출물의 유산균 발효물의 DPPH 억제율 (%)은, 60 내지 90%, 60 내지 85%, 60 내지 80%, 70 내지 90%, 70 내지 85%, 70 내지 80%, 또는 75 내지 90%, 75 내지 85% 또는 75 내지 80%일 수 있다.

본 발명의 해방풍 추출물의 유산균 발효물은 부틸 하이드록시톨루엔(BHT)의 DPPH 억제율에 비해 1 내지 1.4배, 1 내지 1.3배, 1 내지 1.2배 또는 1 내지 1.1배의 DPPH 억제율을 가질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 해방풍 잎 열수추출물에 L. plantarum 및 P. acidilactici를 각각 배양하여 얻은 발효물과 미발효 열수추출물의 DPPH 자유라디칼 소거 활성 분석을 수행하였다. 각 추출물 또는 발효물의 DPPH 억제율은 상기 수학식 1의 방법으로 계산되었다.

분석 결과, 상기 미발효 해방풍 잎 열수추출물의 DPPH 억제율은 56.5%로 나타난 반면, L. plantarum 발효물의 DPPH 억제율은 75.6%, P. acidilactici 발효물의 DPH 억제율은 79.2%로 나타나 각 발효물에서 1.3 내지 1.5배 높은 자유라디칼 소거능을 확인하였으며, 상기 발효물 2종류 모두 대조군인 부틸 디하이드록시톨루엔(BHT)에 비해 우수한 자유라디칼 소거능을 가지는 것으로 확인되었다. 따라서 해방풍 잎 추출물의 유산균 발효물은 미발효 열수추출물에 비해 우수한 항산화 활성을 가진다.

본 발명의 일 실시예에서, 해방풍 잎 열수추출물에 L. plantarum 및 P. acidilactici를 각각 배양하여 얻은 발효물의 DPPH 억제율에 대한 EC₅₀ 값을 계산한 결과, 산화방지제로 잘 알려진 부틸 디하이드록시톨루엔(BHT)의 EC50값 0.066% 보다 낮은 0.063%로 나타나, 상기 해방풍 잎 ?x수추출물의 유산균 발효물이 항산화 물질로서 우수함을 확인하였다.

본 발명의 해방풍 추출물의 유산균 발효액은, 미발효 해방풍 추출물에 비해 우수한 항멜라닌 활성을 가져, 피부 미백 용도로 활용될 수 있다. 구체적으로, 아무 것도 처리하지 않은 쥐의 B16F10 세포 내 멜라닌 함량을 100%로 두었을 때, 본 발명의 해방풍 추출물의 유산균 발효액을 처리하였을 때의 세포 내 멜라닌 함량은 50 내지 99%, 55 내지 95%, 60 내지 90%, 또는 60 내지 85%일 수 있으며, 바람직하게는 60 내지 82%일 수 있다.

본 발명의 해방풍 추출물의 유산균 발효액은, 해방풍 추출물을 처리하였을 때,

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 유산균 발효액이 피부의 멜라닌 생성량에 미치는 영향을 분석하기 위해, 쥐의 B16F10 세포주를 이용하여 멜라닌 정량 분석을 수행하였다. 구체적으로, 상기 쥐의 B16F10 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양한 후, 해방풍 잎 열수 추출물(미발효), 해방풍 뿌리 열수 추출물(미발효), 해방풍 잎 열수 추출물의 L.plantarum 발효물, 해방풍 잎 열수추출물의 P. acidilactici 발효물, 해방풍 뿌리 열수 추출물의 L.plantarum 발효물, 및 해방풍 뿌리 열수 추출물의 P. acidilactici 발효물을 각각 0.1% 처리하여 48시간 동안 배양한 후, 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 해방풍 추출물 또는 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 처리하지 않은 무처리군 세포의 멜라닌 함량을 100%로 두었을 때, 미발효 해방풍 잎 추출물을 처리군에서의 멜라닌 함량은 90.5%, 미발효 해방풍 뿌리 추출물의 멜라닌 함량은 89.2%로 나타났으나, 미발효 해방풍 잎 추출물의 L. plantarum 발효물 및 미발효 해방풍 뿌리 추출물의 L. plantarum 발효물에서는 각각 71.3% 및 68.6%의 멜라닌 함량을 보여 미발효 추출물에 비해 약 20%p 낮은 수치를 보였으며, 구체적으로 해방풍 잎 추출물의 발효물은 미발효물에 비해 19.2%p, 해방풍 뿌리 추출물의 발효물은 미발효물에 비해 20.6%p 낮은 멜라닌 함량을 보여, 양 추출물의 발효물 모두 항멜라닌 효과가 있음을 확인하였다. 멜라닌 잎 추출물과 뿌리 추출물의 P. acidilactici 발효물은, 각각 81.5% 및 77.1%의 멜라닌 함량을 보여, 미발효물에 비해 모두 약 10%p 낮은 멜라닌 함량, 구체적으로 미발효물에 비해 각각 9%p, 12.1%p 낮은 수치로 나타났다. 따라서 본원의 해방풍 추출물의 유산균 발효물은 피부의 멜라닌 농도를 감소시키는 활성을 가져, 피부 미백 용도로 활용될 수 있어, 활용 가능성이 높다.

본 발명의 해방풍 추출물의 유산균 발효액은, 미발효 추출물에 비해 우수한 항균 활성을 가진다. 상기 항균의 대상이 되는 균은, 리스테리아 균, 포도상구균, 대장균, 바실러스균, 여드름균, 비듬균, 치아우식균 및 충치균으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

따라서, 본 발명의 해방풍 추출물의 유산균 발효액은, 여드름 예방, 개선 또는 치료용도, 비듬의 예방, 개선 또는 치료용도, 충치의 예방, 개선 또는 치료 용도로 사용될 수 있으며, 의약 조성물, 화장료 조성물, 구강 제품 또는 헤어 제품으로도 사용될 수 있다. 이에, 본 발명은 또한 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다. 상기 발효물은 발효 원액, 상기 발효 원액의 농축 발효액, 및 상기 발효 원액으로 제조된 발효 분말로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형을 포함한다.

상기 여드름균은, 예를 들어 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, ATCC 6919)일 수 있고, 상기 비듬균은 말라세지아 퍼퍼(Malassezia furfur, ATCC 14521)일 수 있으며, 상기 치아우식균 또는 충치균은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans, ATCC3065) 또는 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus, ATCC33478)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

더욱 자세하게는, 본 발명의 일 실시예에서, 해방풍 잎 열수 추출물과 해방풍 뿌리 열수 추출물에 각각 L.plantarum(KCCM12299P), P. acidilactici (KCCM12300P)을 공접종하여 각 추출물의 유산균 발효물을 제조하고, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, ATCC 6919), 말라세지아 퍼퍼(Malassezia furfur, ATCC 14521), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus, ATCC33478) 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans, ATCC3065)가 각각 도말된 평판배지의 멸균 펀치 구멍에 상기 발효물 또는 미발효 열수추출물을 주입한 후 억제환(inhibition clear zone)의 직경을 측정하여 각 균에 대한 항균성을 분석하였다. 그 결과, 해방풍 뿌리 추출물은 발효 전에는 충치균과 여드름균에서 항균 효과가 나타났으나, 해방풍 뿌리 추출물의 유산균 발효물은 3가지 균 모두에 대해 강한 항균 환이 나타나 항균력이 향상되었음이 확인되었다. 해방풍 잎 추출물의 경우, 발효 전 열수 추출물은 항균환이 전혀 생성되지 않았으나, 유산균 발효물은 여드름에서 항균환이 나타나 발효물의 항균 효과가 발효 전 추출물에 비해 향상되었음이 확인되었다.

본 발명은 또한 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 여드름, 비듬 및 충치으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물은 유효 성분인 해방풍 추출물의 유산균 발효물의 항균 활성을 저해하지 않는 한, 분산제와 담체, 및 기타의 항균제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가물을 포함하여 제조될 수 있다.

상기 분산제로서, 물, 메탄올, 에탄올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 글리세린, 케톤류, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 에테르류, 디옥산, 테트라하이드로푸란, 셀로솔브, 디에틸렌 글리콜 디메틸 에테르, 헥산, 케로센, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 나프탈렌, 메틸 나프탈렌, 클로로포름, 카본 테트라클로라이드, 디메틸 포름아디드, 메틸 아세테이트 에스테르, 에틸 아세테이트 에스테르, 부틸 아세테이트 에스테르, 지방산 글리셀니 에스테르, 아세토니트릴, 고급 알코올 설페이트 에스테르, 알킬 설폰산, 알킬 알릴 설폰산, 4급 암모늄 염, 옥시 알킬 아민, 지방산 에스테르, 폴리알킬렌 옥시드 화합물 및 안하이드로 소르비톨 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상이 포함될 수 있다.

상기 담체는, 예를 들어, 카올린, 벤토나이트, 산 점토, 활석 분말, 납석 분말, 규조토, 규산 무수물, 운모 분말, 알루미나, 황 분말, 및 활성탄으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기 기타의 항균제는, 예를 들어, 카바크롤, 티몰, 시트랄, 이소유제놀, 메틸유제놀, 조릿대 엑기스, 자영지 추출액, 미강 발효물, 이소디아졸론 화합물 및 아미노카르복시산으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항균 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 액체상, 고체상 및 기체상 중 임의의 상으로 제조될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구, 비경구 등 임의의 방식으로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 국소 투여 방식으로 투여될 수 있다. 상기 경구 투여 방식의 제형은 정제, 환제, 분제, 액제, 식품 형태 등을 들 수 있으며, 비경구 방식의 제형은 주사제, 국소 투여제(크림, 연고 등), 좌약, 살포제 등이 있다.

상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물은 본 발명 항균 조성물 내 함량이 0.001 내지 99.99 중량%, 0.1 내지 99 중량%, 또는 0.1 내지 50 중량%일 수 있으나, 상기 항균 조성물의 사용방법 및 사용 목적에 따라 적절한 함량으로 조절될 수 있다.

상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물은 생체 및/또는 인체에 대한 안전성이 우수하다. 본 발명의 일 실시예에서, 쥐의 흑색종 세포주(B16F10) 배양물에 해방풍의 잎 또는 뿌리 추출물 및 상기 추출물에 L.plantarum(KCCM12299P), 또는 P. acidilactici (KCCM12300P)를 배양하여 제작한 발효물을 1mg, 100ug, 10ug 및 1ug의 농도별로 처리하여 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 배양한 후 CCK-8을 첨가하여 반응시킨 후 흡광도(OD 540nm)를 측정하였다. 그 결과, 해방풍 추출물 또는 발효물을 전혀 처리하지 않은 미처리군에서의 세포 생존도를 100%로 하였을 때, 해방풍 잎 추출물의 발효물은 유산균 균주와 무관하게 모두 대조군에 비해 높은 세포 생존도를 나타냈으며 (도 4), 해방풍 뿌리 추출물의 발효물 또한 균주와 무관하게 모두 100% 이상의 생존도를 보였다 (도 5). 따라서, 본 발명의 해방풍 추출물의 유산균 발효물은 세포에 대한 독성이 없어 생체 또는 인체에 복용 또는 적용되는 경우 안전성이 우수하다.

본 발명은 또한 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 여드름, 비듬 및 충치으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물에 포함되는 해방풍 추출물의 유산균 발효물의 제형은, 원칙적으로 식품 조성물에 사용될 수 있는 제형이면 제한되지 않으며, 액체 또는 고체이거나, 여과액, 추출액, 현탁액, 농축액, 건조분말, 동결건조분말, 분무건조분말 등의 제형으로 포함될 수 있다.

상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물은 여드름균, 비듬균 및 충치에 대한 항균 활성을 가짐으로써 상기 여드름, 비듬 또는 충치 질환을 예방 또는 개선할 수 있다. 본 발명의 해방풍 추출물의 유산균 발효물에 있어서, 상기 항균 활성은 상술한 바와 같다.

상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물은 세포 독성이 없어 안전성이 우수하므로, 식품에 적용될 수 있다. 또한 상기 유산균 발효물의 원료가 되는 해방풍 및 유산균 모두 오랜 기간 식용되어 온 식재료로서, 식품으로 활용 가능하다.

상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물은, 식품 조성물 전체 중량 대비 0.001 내지 99 중량% 또는 0.01 내지 50 중량%로 포함될 수 있다. 상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 본 발명이 목적하는 여드름, 비듬 및/또는 충치의 예방 또는 개선 활성을 나타낼 수 있도록 포함된다.

본 발명의 식품 조성물의 제형은 통상의 기술자에게 알려져 있는 다양한 제형이 적용될 수 있으며, 예를 들어, 상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 포함하여 음료나 환, 분말 등과 같은 통상의 건강기능식품 제형, 또는 액체, 환제, 현탁액 등과 같은 조성물 제형이 될 수 있다.

본 발명이 제공하는 식품 조성물은 식품 분야에서 관용적으로 사용되는 부형제나 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물의 제제는 정제, 캡슐, 과립, 분말, 추출액, 용액, 시럽, 현탁액, 또는 유탁액의 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 여드름, 비듬 및 충치로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물의 여드름균, 비듬균 및 충치균에 대한 항균 활성은 상술한 바와 같다.

본 발명은 또한 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 해방풍 추출물은 피부세포 내 멜라닌 함량을 낮추는 활성을 가지므로, 화장료 조성물에 포함되어 피부의 미백 용도로 이용될 수 있다. 상기 해방풍 추출물의 피부세포 내 멜라닌 함량 감소 효과는 상술한 바와 같다.

상기 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물 또는 피부 미백용 화장료 조성물은 모발, 두피, 피부, 구강, 치아 및 치주로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 부위에 적용하는 것일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 두피 또는 모발에 적용되는 경우, 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 바람직하게는 다양한 헤어제품으로서 유액, 크림, 페이스트, 겔, 화장수, 팩, 로션, 파우더, 스프레이, 비누 등의 모발 처리용 화장품으로 제형화될 수 있다. 헤어 제품의 예로는 헤어토너, 헤어로션, 헤어크림, 헤어스프레이, 헤어무스, 헤어젤, 헤어비누, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어팩 및 헤어트리트먼트 등의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 에센스, 영양 오일, 보습 오일, 영양크림, 파우더, 팩, 파운데이션, 메이크업 베이스, 클렌징, 샴푸, 로션 및 연고로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.

상기 파우더 형태의 조성물은, 이를 화장품, 구강 제품 또는 헤어 제품에 적용할 경우 이를 그대로 사용할 수 있고, 용매에 녹여 사용될 수 있으며, 상기 용매는 예를 들어 물 또는 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 해방풍 추출물의 유산균 발효물은 화장료 조성물 전체 중량 중 0.001 내지 30 중량% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 구강 조성물을 제공한다. 상기 구강용 조성물은 구강 질환, 예를 들면 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 의한 치주질환 또는 충치를 예방, 개선, 또는 치료할 수 있는 구강용 조성물이며, 약학 조성물 또는 구강 청결용 조성물일 수 있다.

본 발명의 구강 조성물은 통상적인 치약 조성물, 가글 조성물 또는 구취 억제 및 충치 예방 조성물에 사용되는 물질을 더욱 포함할 수 있으며, 상기 구강 청결용 조성물을 첨가제로 사용하여 치약, 가글 또는 구취억제 및 충치예방제에 포함시킬 수 있다.

본 발명의 구강 청결용 조성물의 제형으로는 경고제, 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 에어로졸제, 스프레이제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 정제, 캅셀제, 크림제, 또는 환제일 수 있다.

본 발명이 제공하는 해방풍 추출물의 발효물은, 가바 함량이 발효 전보다 증가하고, 생체에 대한 안전성이 높으며, 항균, 항산화, 항멜라닌과 같은 미용 및 약리 효과가 뛰어나다.

도 1은 해방풍 추출물의 발효에 사용된 페디오코쿠스 에시디락티시의 SNP 위치를 나타낸 그림이다.
도 2는 실시예 4에 따른 각 추출물 또는 추출물의 발효물의 항산화 활성 분석 결과 DDPH 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 4에 따른 각 추출물 또는 추출물의 발효물의 항산화 활성 분석 결과의 IC₅₀ 값을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 5에 따라, 마우스 B16F10 세포를 대상으로 해방풍 잎의 추출물 또는 발효물의 농도에 따른 독성 실험을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 5에 따라, 마우스 B16F10 세포를 대상으로 해방풍 뿌리의 추출물 또는 발효물의 농도에 따른 독성 실험을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 6에 따라 각 해방풍 추출물 또는 발효물의 마우스 B16F10 세포에서의 멜라닌 색소 감소 효능을 평가한 실험 결과 그래프이다.
도 7은 실시예 7에 따라 해방풍 잎과 뿌리의 열수 추출물에서 L. plantarum과 P.acidilactici 유산균의 가바 생산 TLC 시험결과 사진이다.
도 8은 실시예 8에 따라 각 추출물 또는 발효물 시료의 가바 생산 정량 분석 ELISA 시험결과 그래프이다.
도 9는 실시예 9에 따라 각 추출물 또는 발효물의 비듬균, 여드름균 및 충치균에 대한 항균성 분석 결과를 나타낸 그림이다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 제한하지 아니한다.

실시예 1. 해방풍 추출물의 제조

해방풍의 잎과 뿌리를 각각 분리하고 동결건조로 분말화하여 제조된 해방풍 잎 분말과 해방풍 뿌리 분말을 이용하여 열수 추출물을 제조하였다.

상기 준비한 해방풍 잎 분말 또는 해방풍 뿌리 분말을 각각 50g과 증류수 1000mL를 혼합한 후 세포막 내 유효물질이 잘 용해되도록 초음파를 750 watt, 10kHz에서 10초간격으로 5분간 조사하여 세포 파쇄 및 혼합하였다(Sonics Vibra-Cell, USA). 초음파 파쇄는 단백질 또는 기타물질의 변성을 막기 위해 얼음 내에서 진행하였다. 다음으로 혼합물을 85 ℃의 열수에서 4시간 동안 진탕한 후, 상기 추출물을 원심분리 (7,000 rpm, 10분) 하고 0.8 um corning bottle-top (Sigma, USA)를 사용하여 진공 여과(vacuum filter)하여 약 800~ 900ml(80~90%)의 해방풍잎(Hotwater Extract of Glehnia leaf, GLE)과 해방풍 뿌리 (Hotwater Extract of Glehnia root, GRE)의 액상 열수 추출물을 제조하였다.

상기 액상 열수 추출물은 -70℃에서 얼린 후 3일 동안 동결건조하여 분말화 후 이후 실험에 이용되었다.

실시예 2. 해방풍 추출물의 발효물 제조

2-1. 유산균의 분리

실시예 1에서 제조한 해방풍 잎 또는 뿌리 추출물을 발효하기 위한 유산균을 각각 흰점박이꽃무지의 먹이용 발효 톱밥 또는 해양심층수로부터 분리하였다.

먼저 페디오코쿠스 에시디락티시(P. acidilactici)는 식용 곤충의 먹이인 발효 톱밥에서 분리 및 동정되었다. 상기 식용 곤충의 먹이용 발효 톱밥은 영천곤충산업(대한민국)으로부터 구입하였다. 25℃에서 저장된 발효 톱밥을 PBS에 1%(w/v) 농도로 첨가 후 볼텍스하여 혼합하였다. 상기 발효톱밥 혼합액을 0.1%(v/v) BCP(Bromocresol purple, Sigma, USA)가 첨가된 MRS (Difco, USA) agar 배지에 도말 후 37℃에서 1일간 배양되었다. 상기 BCP는 유산균의 젖산에 의해 산성화되어 노란색 콜로니가 형성되도록 하는 기능을 수행한다.

BCP와의 반응에 의해 형성된 노란색 콜로니만을 선별하여 MRS agar 배지에 도말하여 재선별하는 과정을 반복하여 단일 종을 분리하였다.

락토바실러스 플란터룸(L. plantarum)은 해양심층수로부터 분리되었다. 상기 해양심층수는 2015년 11월부터 12월까지 울릉도 태하, 저동 및 현포에서 표층으로부터 수심 200m의 바닷물을 취수하여 냉장 상태로 운반하였다. 상기 해양심층수를 0.1%(v/v) BCP가 첨가된 MRS agar 배지에 도말하여 37℃에서 1일간 배양하였다. 이후 BCP와의 반응에 의해 형성된 노란색 콜로니의 선별을 반복하여 단일 종을 분리하였다.

상기 분리된 2종의 균주는 MRS 액체 배지에서 배양하여 50%(v/v) 글리세롤을 혼합하여 최종 글리세롤 농도가 25%가 되도록 한 후, -70℃에서 보관하였다.

2-2. 유산균의 동정

상기 실시예 2-1에서 분리된 2종의 유산균은 16S rRNA의 염기 서열 분석을 이용하여 동정되었다. 2종의 유산균을 동정하기 위해 우선 mini genomic DNA extraction kit(Promega)를 이용하여 각 균주의 유전체 DNA(genomic DNA)를 분리하였다.

상기 분리된 유전체 DNA를 주형으로, 하기의 27F 및 1492R 프라이머 세트 및 AccPower PCR premix kit(Bioneer, Korea)를 이용하여 TaKaRa PCR Thermal Cycler(Japan)으로 상기 균주 2종의 16S rRNA 유전자 부위를 증폭하였다.

- 27F 프라이머 (서열번호 1): 5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3'

- 1492R 프라이머 (서열번호 2): 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

상기 PCR 산물은 PCR clean-up Gel extraction(Macherey Nagel, USA)로 정제하여 ABI3730 DNA analyzer(Applied Bioxyxtems, USA)로 유전자 서열을 분석하였다. 본 발명에서 분리된 락토바실러스 플란터룸 균주의 16S rRNA 서열은 서열번호 3에, 페디오코쿠스 에시디락티시 균주의 16S rRNA 서열은 서열번호 4에 나타내었다.

상기 분리된 락토바실러스 플란터룸 균주와 페디오코쿠스 에시디락티시 균주의 16s rRNA 서열정보를 이용하여 16S rRNA 서열 유사도 분석을 수행하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같다. 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 해양심층수로부터 분리된 유산균은 16S rRNA 분석 결과 락토바실러스 플란터룸과 99%의 서열 유사도를 나타내었고, 발효톱밥으로부터 분리된 유산균은 페디오코쿠스 에시디락티시와 99%의 서열 유사도를 보여, 각각 락토바실러스 플란터룸 및 페디오코쿠스 에시디락티시로 명명하였다.

유산균 유래	16S rRNA근접종	근접종 16S rRNA 서열	서열 유사도
해양심층수	Lactobacillus plantarum	MK311261.1 (서열번호 5)	99%
발효톱밥	Pediococcus acidilactici	LC311071.1 (서열번호 6)	99%

상기 분리된 락토바실러스 플란터룸 균주는 한국미생물보존센터(KCCM)에 2018년 8월 10일자로 기탁되었으며, 수탁번호는 KCCM12299P이다. 상기 페디오코쿠스 에시디락티시 균주는 2019년 3월 29일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁되었으며, 수탁 번호는 KCCM12472P이다.

2-3. 해방풍 추출물의 발효물 제조

실시예 1에서 제조한 해방풍 잎추출물 또는 해방풍 뿌리 추출물을 이용하여 유산균 배양 배지를 제조한 후, 121℃, 0.12MPa에서 20분 고온고압 살균하여 멸균 후, 실온에서 식혀 유산균을 접종하고 배양하여 해방풍 용매 추출물의 발효물을 제조하였다.

구체적으로, 실시예 1에서 제조한 해방풍의 액상 열수추출물 1L (pH 6.5~7.5)에, 질소원, 탄소원 및 무기염류의 첨가 없이 배지를 제조하여 사용하였다. 상기 해방풍 용매 추출물로는 해방풍 잎(GLE) 액상 추출물과, 해방풍 뿌리 (GRE)의 액상 열수 추출물을 각각 이용하여 2가지의 배지를 제조하였다.

상기 제조된 배지에 각각 1x10⁸ cfu/ml 유산균 1mL 를 접종하고 30 ℃에서 24시간 동안 배양하여 해방풍 추출물의 발효물을 제조하였다. 상기 유산균은 실시예 2-1에서 분리된 락토바실러스 플란터룸(Lactobacillus plantarum, KCCM12299P), 페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici, KCCM12472P) 또는 상기 두 가지 균주를 최종 농도 1x10⁸ cfu/ml가 되도록 1:1로 혼합한 유산균 배합물을 각각 접종하였다.

각 유산균 접종 후, 30℃에서 24시간 배양하여 각 해방풍 추출물의 발효물을 제조하였다. 상기 유산균 발효액은 동결 건조 후 분쇄하여 분말 형태로 제조되어 이후 실험에 이용되었다.

본 실시예는 해방풍 추출물 종류 및 유산균 종류을 달리하며 유산균 발효물시료 1 내지 6을 각각 제작하였으며, 구체적인 접종 유산균의 종류, 및 유산균을 접종하여 제조한 해방풍 추출물의 발효물을 하기 표 2에 나타냈다.

구체적으로, 비교시료 1은 유산균 접종 및 배양이 없는 해방풍잎 열수추출물(GLE), 비교시료 2는 유산균 접종 및 배양이 없는 해방풍뿌리 열수추출물(GRE)이고, 시료 1은 L. plantarum을 접종한 해방풍잎 추출물의 발효물 분말(GLELp), 시료 2는 L. plantarum 을 접종한 해방풍뿌리 추출물의 발효물 분말(GRELp), 시료 3은 P. acidilactici을 접종한 해방풍잎 열수추출물의 발효물 분말(GLEPa), 시료 4는 P. acidilactici을 접종한 해방풍뿌리 열수추출물의 발효물 분말(GREPa), 시료 5와 6은 L. plantarum 및 P. acidilactici 혼합 균주를 접종한 해방풍잎과 뿌리 추출물의 발효물 분말(GLELpPa, GRELpPa)을 나타냈다.

구분	명명	유산균 종류
비교시료1	GLE	비발효
비교시료2	GRE	비발효
시료1	GLELp	락토바실러스 플란터룸(Lactobacillus plantarum)
시료2	GRELp	락토바실러스 플란터룸(Lactobacillus plantarum)
시료3	GLEPa	페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)
시료4	GREPa	페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)
시료5	GLELpPa	락토바실러스 플란터룸(Lactobacillus plantarum)
시료5	GLELpPa	페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)
시료6	GRELpPa	락토바실러스 플란터룸(Lactobacillus plantarum)
시료6	GRELpPa	페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)

실시예 3. 탄소원 및 질소원 첨가 필요 여부의 확인

실시예 2의 해방풍 추출물의 발효물의 제조에 있어, 유산균 발효를 효과적으로 수행할 수 있는 탄소원 또는 질소원의 첨가 필요여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

실시예 1에서 제조한 해방풍 잎 열수 추출물 또는 해방풍 뿌리 열수추출물(GLE, GRE) 1L를 각각 포함하는 배지, 구체적으로, 실시예 1에서 제조한 액상 추출물의 해방풍 열수추출물 1L (pH 6.5~7.5)에 질소원, 탄소원, 무기염류의 첨가없이 배지를 제조하여 사용하였다. 대조군으로서 일반적으로 사용되는 유산균배지인 MRS 배지를 준비하였다.

상기 준비된 3가지 종류의 배지에 1x10⁸ cfu/ml 농도의 유산균 L.plantarum(KCCM12299P), P. acidilactici (KCCM12300P) 또는 상기 두 가지 균주를 최종 농도 1x10⁸ cfu/ml가 되도록 1:1로 혼합한 혼합 균주를 각각 접종하고 30 ℃에서 24시간 배양한 후에 LAB Counts(log cfu/ml)를 측정하였다. 상기 LAB Counts 측정결과를 하기 표 3에 나타냈다. 하기 표에서 Lp는 L.plantarum을, Pa는 P.acidilactici를, LaPa는 상기 양 균주를 혼합하여 접종한 샘플을 의미한다.

LAB Counts는 각 액체 배지에 아가로스 (BD Difco, USA)를 첨가하여 제작한 고체 배지에 배양물을 1%(v/v)로 희석하여 1 ml을 LAB 플레이트에 도말 후 30℃에서 24시간 배양하여 형성된 콜로니의 수를 측정하여 수행하였다.

배지	Lp(cfu/ml)	Pa(cfu/ml)	LpPa(cfu/ml)
MRS	1.00 X 10⁹	1.00 X 10⁸	1.00 X 10¹⁰
해방풍잎추출물(GLE)	4.00 X 10⁹	6.00 X 10⁹	1.50 X 10¹²
해방풍뿌리추출물(GRE)	4.00 X 10¹⁰	5.00 X 10⁸	1.00 X 10¹¹

표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, MRS 배지에 L.plantarum 을 접종한 경우, 24시간 동안 배양한 후 LAB Counts가 1.00x10⁹ cfu/ml로 측정되었으나, P. acidilactici 의 경우 1.00x10⁸ cfu/ml 로 측정되었다. 해방풍 잎 추출물(GLE) 배지에 L. plantarum 과 P. acidilactici을 접종하고 24시간 동안 배양한 배양물의 유산균 수는 각각 4.00x10⁹ cfu/ml, 6.00x10⁹ cfu/ml 이며, L. plantarum 과 P. acidilactici을 공접종한 경우에도 유산균 수가 1.50x10¹² cfu/ml 정도로 증식하였다. 해방풍 뿌리 추출물(GRE) 배지에 L. plantarum 과 P. acidilactici을 접종하고 24시간동안 배양한 배양물의 유산균 수는 4.00x10¹⁰ cfu/ml, 5.00x10⁸ cfu/ml 이며, L. plantarum 과 P. acidilactici을 공접종한 경우에도 유산균 수가 1.00x10¹¹ cfu/ml 정도로 증식하였다.

상기 실험 결과로 확인 가능한 바와 같이, 해방풍 잎 또는 뿌리 추출물에 질소원, 탄소원 첨가없이 수행한 유산균 배양은 일반 유산균 MRS 배지와 비교하여 더 잘 증식하였다. 구체적으로, MRS 배지에 비해 해방풍 잎 추출물(GLE)에서 L. plantarum은 4배, P. acidilactici는 60배의 증식을 보였으며, 상기 두 균주를 함께 접종한 경우 150배의 증식을 보여 매우 우수한 증식 효과를 보였다. 해방풍 뿌리 추출물(GRE)의 경우, MRS 배지에 비해 L. plantarum은 40배, P. acidilactici는 5배의 증식을 보였으며, 상기 양 균주가 공접종된 경우 10배의 증식을 보였다.

해방풍 잎 추출물 또는 해방풍 뿌리 추출물 모두에서 탄소원 또는 질소원의 첨가 없이도 상용 배지에 비해 우수한 유산균 증식 효과가 확인되었으므로, 이후 실험에서 해방풍 잎 추출물 또는 뿌리 추출물에 별도의 질소원 또는 탄소원의 첨가 없이 발효물을 제조하였다.

실시예 4. 해방풍 추출 발효물의 항산화 기능성 확인

실시예 2의 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 해방풍 잎추출물(비교1), 해방풍 잎추출물의 L. plantarum 발효물(시료1), 해방풍 잎추출물의 P. acidilactici 발효물(시료3)의 항산화 효과를 확인하기 위해 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 이용하여 자유라디칼 소거 활성 분석을 수행하였다.

실시예 2의 방법으로 제조된 발효물을 10mg/ml씩 채취하여 멸균수 1mL에 첨가하여 희석하여 0.1%(w/v)시료용액을 조제하였다. 저장(Stock) 용액(100mM Tri-HCl, pH 7.4)은 메탄올 1mM에 DPPH를 용해하여 제조하였으며, 분석 실험에서는 100 μM 농도로 희석해 사용하였다.

이어서, 96 웰 플레이트에 앞서 제조한 0.1%(w/v) 농도의 각각의 시료용액을 10μL씩 분주하고, 시간경과에 따른 항산화 효과의 변화를 DPPH 억제율(%)로 측정하였다. 대조군으로 BHT(butyl hidroxytoluene)를 사용하였다.

항산화 효과는 상기 웰 플레이트에 100 μM DPPH를 100 μL씩 첨가하고 차광한 후에 실온에서 10-30 분간 방치한 다음에, 517 nm 파장의 빛을 조사해 흡광도를 측정하여 확인하였다. 음성 대조군으로 메탄올 또는 물에 100 uL DPPH를 처리하여 흡광도를 측정하여 영점 처리를 수행하였다. 상기 흡광도를 측정한 후 수학식 1으로 DPPH 억제율을 계산하였으며, 실험결과를 도 2 및 하기 표 4에 나타냈다. 도 2는 측정된 DPPH 억제율(%) 그래프이다.

[수학식 1]

DPPH 억제율(scavenging activity, %) = (1-OD sample/OD blind) x 100

구분	배지 성분	DPPH 억제율 (%)
비교시료1	해방풍 잎추출물	56.5
시료1	해방풍 잎추출물 + L. plantarum 발효	75.6
시료3	해방풍 잎추출물 + P. acidilactici 발효	79.2
대조시료	부틸 하이드록시톨루엔 (BHT)	73.5

도 2에 나타낸 바와 같이, 미발효 해방풍잎 추출물의 DPPH 억제율은 56.5% 였고, 해방풍 잎추출물을 발효한 L. plantarum 발효물 (시료1), P. acidilactici 발효물 (시료3)의 경우 각각 75.6과 79.2%로 상당히 높은 DPPH 억제율을 나타내었다. 상기 각 발효물은 미발효 추출물에 비해 20%p 높은 DPPH 억제율을 나타내었다. 상기 발효물의 DPPH 억제율은 대조군인 BHT의 항산화 수치보다도 높았다. 따라서 해방풍 잎 추출물의 유산균 배양물의 경우, 미발효 추출물과 비교해 항산화 효과가 현저히 상승됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 해방풍잎 추출물의 발효물은, 유산균 배양에 따라 항산화 효과가 증가됨을 확인하였다.

또한, 상기 분석 결과에 기초하여 EC₅₀(half maximal effective concentration) 값을 얻어 도 3에 나타냈다. 도 3은 도 2에 나타낸 항산화 효과의 EC₅₀을 나타낸 것이다.

도 3의 EC₅₀ 값에 나타낸 바와 같이, 미발효 해방풍잎 추출물(비교시료1), 시료 1과 3의 해방풍잎 추출물 발효물의 EC₅₀ 값이 각각 0.088, 0.063 및 0.063 % 로서, 일반적으로 알려진 산화방지제인 BHT(대조시료)보다 더 적은 양으로 높은 항산화 효과를 기대할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: 세포주 독성 확인

해방풍 추출물 또는 발효물의 세포주 독성 실험은 Cell counting kit-8(CCK-8, Dojindo)을 이용하여 측정하였다. 실험에 이용한 세포주는 쥐의 흑색종(melanoma) 세포주인 B16F10(ATCC CRL-6475)를 사용하였다. 세포는 Dulbecco’s modified Eagle’s Medium(DMEM) 배지에 10 %(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1%(w/v) 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-streptomycin)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양 하여 실험에 사용하였다.

미발효 해방풍잎 추출물 및 뿌리 추출물 (비교시료1 및 2)과 실시예 2의 방법으로 제조된 유산균을 이용한 해방풍잎과 뿌리 추출물의 발효물(시료 1 내지 4)을 각각 1mg, 100ug, 10ug, 1ug/ml 농도로 시료 용액을 제조하였다.

상기 흑색종 세포주를 24 well plate에 well 당 5 x 10³개의 세포를 분주한 다음 24 시간 배양하고, 각 추출 시료를 농도 별로 분주하여 24, 48 또는 72 시간 동안 배양하였다. 상기 배양물에 CCK-8을 첨가하고 2-4 시간 반응 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 해방풍 무처리군을 대조군(Cont, 100%)으로 하여 세포 생존도(cell viability)를 측정하였으며, 상기 세포주 독성 실험결과를 도 4 및 도 5에 나타냈다.

도 4는 마우스 피부세포 B16F10를 대상으로 미발효 해방풍잎추출물(비교 1)과 잎추출물 발효물인 L. plantarum 발효물(시료 1), P. acidilactici 발효물(시료 3) 독성 실험을 한 결과 그래프이며, 도 5는 마우스 피부세포 B16F10를 대상으로 미발효 해방풍뿌리 추출물(비교 2)과 뿌리추출물 발효물인 L. plantarum 발효물(시료 2), P. acidilactici 발효물(시료 4) 독성 실험을 한 결과이다.

도 4 및 5에 나타낸 마우스 피부세포인 B16F10세포의 독성 실험에서, 1mg/ml 농도의 시료 용액에서 72시간 까지 모두 독성이 없는 것으로 확인되었다.

상기 결과를 통해 본 발명이 제공하는 해방풍 추출물 및 그 발효물의 안전성을 확인할 수 있으며, 상기 추출물 또는 발효물을 피부 세포에 대한 독성이 확인되지 않아 화장료, 생활용품, 식품 등에 활용 가능하다.

실시예 6: 세포주 내에서의 멜라닌 정량 분석

본 발명의 조성물이 피부 세포의 멜라닌 생성량에 미치는 영향을 분석하기 위해 멜라닌 정량 분석을 실시하였다. 멜라닌 정량 분석을 위해, 실시예 5에서 사용한 쥐의 B16F10세포를 10% FBS가 포함 된 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 조건은 실시예 5와 같다.

B16F10 세포는 쥐(murine)의 멜라닌을 생산하는 상피에서 유래 한 세포로 세포가 성장함에 따라 멜라닌이 생성되어 브라운화 되는 특성이 있다. 따라서 상기 세포에 미백기능 성분을 처리하였을 때, 비처리 군에 비해 흡광도(OD 값)를 통해 측정한 멜라닌 함량이 변화를 통해 미백효과의 유무 또는 미백 효과 정도의 고저를 판단할 수 있다.

6 well plate에 상기 B16F10 세포를 각각 3 x 10⁵개 분주하고 24 시간 37℃, CO₂ 5% 상태로 배양 후, 미발효 해방풍잎 또는 뿌리추출물(비교시료 1 및 2), L. plantarum 을 이용한 해방풍 잎 추출물의 발효물 및 뿌리 추출물의 발효물(시료 1 및 2), P. acidilactici를 이용한 해방풍 잎 추출물의 발효물 및 뿌리 추출물의 발효물(시료 3 및 4) 각 0.1%(v/v) 처리한 실험군 및 음성 대조군으로서 Arbutin 1%(w/v) 용액을 처리하고 48 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집하여 10 %(v/v) DMSO 가 첨가 된 1 N NaOH 에서 용해한 후 80℃에서 1시간 동안 배양하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 도 6에 흡광도 측정 결과로부터 계산된 멜라닌 함량 그래프를 나타냈다.

쥐의 B16F10세포의 미백효과 분석은 0.1% L. plantarum 의 잎 또는 뿌리 추출배양물인 발효물(시료1, 2)에서 항멜라닌 효과가 있음이 확인되었다(도 6). 구체적으로, 해방풍 추출물 또는 해방풍 추출물의 유산균 발효물을 처리하지 않은 무처리군의 B16F10 세포의 멜라닌 함량을 100%로 두었을 때, 미발효 해방풍 잎 추출물을 처리군에서의 멜라닌 함량은 90.5%, 미발효 해방풍 뿌리 추출물의 멜라닌 함량은 89.2%로 나타났으나, 미발효 해방풍 잎 추출물의 L. plantarum 발효물 및 미발효 해방풍 뿌리 추출물의 L. plantarum 발효물에서는 각각 71.3% 및 68.6%의 멜라닌 함량을 보여 미발효 추출물에 비해 약 20%p 낮은 수치를 보였으며, 구체적으로 해방풍 잎 추출물의 발효물은 미발효물에 비해 19.2%p, 해방풍 뿌리 추출물의 발효물은 미발효물에 비해 20.6%p 낮은 멜라닌 함량을 보여, 양 추출물의 발효물 모두 항멜라닌 효과가 있음을 확인하였다. 멜라닌 잎 추출물과 뿌리 추출물의 P. acidilactici 발효물은, 각각 81.5% 및 77.1%의 멜라닌 함량을 보여, 미발효물에 비해 모두 약 10%p 낮은 멜라닌 함량, 구체적으로 미발효물에 비해 각각 9%p, 12.1%p 낮은 수치로 나타나 항멜라닌 활성을 확인하였다.

따라서 본원의 해방풍 추출물의 유산균 발효물은 피부의 멜라닌 농도를 감소시킴으로써 피부 미백 용도로 활용될 수 있어, 활용 가능성이 높다.

실시예 7. 해방풍 추출물의 발효물 내 가바 TLC 분석

본 발명이 제공하는 해방풍 추출물 및 그 발효물 내 가바 존부를 확인하였다.

실시예 2의 표 1에 나타낸 바와 같이, 해방풍 잎 또는 뿌리 열수추출물(GLE, GRE; 실시예 2의 비교시료 1 및 비교시료 2), 유산균 L.plantarum(KCCM12299P) 및 P. acidilactici (KCCM12300P)를 공접종한 시료 5와 시료 6를 준비하였다.

추가로 상기 비교시료 1 및 비교시료 2를 각각 121℃에서 20분간 처리하여 멸균하여 비교시료 3 및 4를 각각 준비하였으며, 시료 5 및 시료 6에서 유산균 배양 시간을 48시간으로 하여 시료 7 및 8의 각각 두 종류의 시료를 준비하였다. 표 5에 가바 함량을 비교한 시료의 정보를 나타내었다.

구분	내용
비교시료1	해방풍 잎 추출물
비교시료2	해방풍 뿌리 추출물
비교시료3	해방풍 잎 추출물 + 멸균
비교시료4	해방풍 뿌리 추출물 + 멸균
시료5	해방풍 잎 추출물 24h 발효물
시료6	해방풍 뿌리 추출물 24h 발효물
시료7	해방풍 잎 추출물 48h 발효물
시료8	해방풍 뿌리 추출물 48h 발효물

각 시료와 GABA 1 %(w/v) 및 MSG 0.2%(w/v) 표준용액을 Merck TLC silica GEL에 3 ul씩 점적한 후 용매로 분리하여 각 시료 내 GABA의 함량을 확인하였다. 상기 분리에 사용된 용매의 조성은 n-부탄올:아세트산:물(n-butanol:acetic acid: water)을 5:2:2의 부피비로 혼합하여 사용하였다. 각 시료의 용매 분리 후 1%(v/v) 닌히드린(ninhydrin)을 스프레이 한 후 열을 가하여 발색하였다.

도 7에 TLC 결과를 나타내었다. 도 7의 왼쪽부터 0.2 % MSG, 1% GABA, 비교시료 1의 미발효 해방풍 잎 추출액과 미발효 해방풍 잎추출액을 121 ℃에서 20분간 멸균한 비교시료 3, 해방풍 잎추출액에서 L.plantarum (KCCM12299P), P. acidilactici (KCCM12300P)을 각각 공접종하여 24시간(시료5) 또는 48시간(시료7) 배양 후 가바 농도를 측정한 결과이고, 이어서 0.2 % MSG, 1% GABA, 비교시료 2의 미발효 해방풍 뿌리 추출액과 해방풍 뿌리 추출액을 121 ℃에서 20분간 멸균한 비교시료 4, 해방풍 뿌리 추출액에서 L.plantarum(KCCM12299P), P. acidilactici (KCCM12300P)을 각각 공접종하여 24시간(시료6) 및 48시간(시료8) 배양 후에 가바를 측정한 결과를 나타낸다. 도 7에서 확인 가능한 바와 같이, 해방풍 잎과 뿌리의 추출액 비교시료 1과 2에서 가바의 존재가 확인되었고 멸균 후에도 잎과 뿌리 추출물의 멸균물 모두에서 가바가 확인되어 해방풍 잎 또는 뿌리 추출물 내의 가바가 열에 안정함을 확인하였다. 또한 해방풍 잎과 뿌리의 추출물에서 L.plantarum(KCCM12299P), P. acidilactici (KCCM12300P) 공배양한 시료 5와 시료 6에서 유산균의 배양 전보다 더 많은 가바가 생성되었음을 정성적으로 확인하였다(도 7).

실시예 8. 해방풍 추출물과 그 발효물 내 가바 정량 분석

해방풍추출물과 그 발효물에 있는 가바의 양을 측정하기 위해 GABA ELISA kit(AVIVA Systems biology, USA)를 사용하였다. 먼저, 가바 검량선을 얻기 위해 Lyophilized GABA (AVIVA) 100 ng/ml의 가바 표준물질을 이용하여 가바 표준용액 50, 25, 12.5 6.25, 3.13, 1.56, 및 0 ng/ml을 준비했다. 또한 실험군으로 실시예 2의 방법으로 얻은 해방풍잎추출물(비교시료 1)과 해방풍뿌리추출물(비교시료 2), 해방풍잎 및 뿌리 추출물 각각에 L. plantarum과 P. acidilactici가 공배양 된 시료 5및 6(표 2)를 각 1%(v/v)와 0.1%(v/v)의 농도로 준비하였다. 상기 용액 각 50 ul를 96 웰 프레이트에 분주하였다. 바이오틴(Biotin)이 결합된 1xGABA complex 50 ul를 각 웰(well)에 더해 실링하고, 37℃에서 60분간 방치하여 각 샘플 내의 가바와 바이오틴의 결합 반응 후, 반응을 마친 용액은 제거하였다. 1 x wash 버퍼 300 ul를 2분간 처리하고 버리는 과정을 3번 반복하였다. 96 웰 플레이트에 1x avidin-HRP 용액을 100 ul 처리하고 실링하여 37℃에서 45분간 방치 후 버퍼를 제거하고 다시 1 x wash 버퍼 300 ul를 2분간 처리하고 버리는 과정을 2 -3번 반복하였다. 발색과정을 위해 TMB 용액을 90 ul 처리하고 37℃에서 15-30분간 암실에 두고 50 ul stop 용액으로 반응을 정지하고 450 nm 파장의 빛을 조사해 흡광도를 측정하고 검량선을 작성하여 ng/ml로 나타내었다. 도 8에 상기 실험의 결과 그래프를, 하기 표 6에 각 조건별 가바 함량을 나타내었다.

구분	명명	배지성분 및 함량	가바 농도 (ng/ml)
비교시료5	GLE 0.1%	해방풍 잎 추출물 (0.1% 함량)-비발효물	0.37
비교시료6	GLE 1%	해방풍 잎 추출물 (1.0% 함량)-비발효물	0.75
비교시료7	GRE 0.1%	해방풍 뿌리 추출물(0.1% 함량)-비발효물	0.38
비교시료8	GRE 1%	해방풍 뿌리 추출물(1.0% 함량)-비발효물	0.49
시료9	GLELpPa 0.1%	해방풍 잎 추출물 발효물(0.1% 함량)	0.43
시료10	GLELpPa 1%	해방풍 잎 추출물 발효물(1.0% 함량)	0.87
시료11	GRELpPa 0.1%	해방풍 뿌리 추출물 발효물(0.1% 함량)	0.46
시료12	GRELpPa 1%	해방풍 뿌리 추출물 발효물 (1.0% 함량)	1.31

해방풍잎 추출물(비교시료 5, 6)은 0.1 및 1 %에서 가바 함량이 각각 0.37 및 0.75 ng/ml로 해방풍뿌리 추출물 0.1 및 1% 내 가바 함량 0.38 및 0.49 ng/ml보다 높았다. 그러나 해방풍잎 추출물 발효물 및 해방풍뿌리 추출물 발효물에서는 1%에서 비교할 경우 뿌리 추출물 발효물의 경우가 1.32 ng/ml으로 높았다. 단순 추출의 경우보다 유산균을 이용한 추출물 배양물의 경우에 가바 함량이 높으며 특히 뿌리추출물 발효물의 경우, 가장 높은 가바 함량을 보여, 가바 생산에 있어서는 해방풍의 뿌리 추출물의 발효물이 유효함을 확인하였다(도 8).

실시예 9. 해방풍 추출 발효물의 항균효과

본 발명의 해방풍잎 및 뿌리 각 열수추출물 및 해방풍잎 및 뿌리 추출물의 각 발효물의 항균활성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

9-1: 여드름균에 대한 항균활성

여드름균 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, ATCC 6919) 를 준비하였다. 상기 여드름균은 RCM 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 전배양(pre-culture)하였다. 이어서, 페트리디쉬에 1%(w/v)의 LB agar를 20mL씩 분주하고 응고하여 평판배지를 제조한 후, 앞서 전배양한 시험균주를 200 μL씩 첨가하고 멸균된 유리봉으로 배지 위에 고르게 도포한 후, 30분 동안 건조시켰다. 이후 고온고압 멸균 이후 알코올램프 멸균을 병행하여 준비된 1ml 블루팁을 이용하여 펀칭해 시료 주입을 위한 공동을 제작하였다.

실시예 2의 방법으로 제조한 해방풍 잎 또는 뿌리 열수추출물(GLE, GRE)인 비교 1과 비교 2, L.plantarum(KCCM12299P), P. acidilactici (KCCM12300P)을 각각 1 mL씩 공접종 한 시료 5와 시료 6의 동결건조 분말을 각각 0.01g/ml씩 물에 희석하여 1%(w/v)의 균질용액 시료를 제조한 후, 각각의 1%(w/v) 균질용액 시료 30 μL씩을 상기 멸균펀치 한 구멍에 주입하였다.

시료의 주입 후 37℃에서 24-72시간 동안 배양하고 펀치 내 주변의 억제환(inhibition clear zone)의 직경을 측정하여 항균성을 분석하였다. 도 9에 항균성 분석 결과를 나타내었다.

9-2: 비듬균에 대한 항균활성

비듬균에 대한 항균효과를 확인하기 위해, 비듬균 말라세지아 퍼퍼(Malassezia furfur, ATCC 14521)를 준비하였다. 상기 비듬균을 LNA배지(올리브 기름 1%(v/v) 첨가)에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 전배양(pre-culture)하였다. 이어서, 페트리디쉬에 1%(w/v)의 LB agar를 20mL씩 분주하고 응고하여 평판배지를 제조한 후, 앞서 전배양한 비듬균을 200 μL 첨가하고 멸균된 유리봉으로 배지 위에 고르게 도포한 후, 30분 동안 건조시켰다.

상기 실시예 9-1와 실질적으로 동일한 방법으로 억제환의 직경을 측정하여 항균성 분석을 수행하였다. 상기 항균활성에 대한 실험결과는 도 9에 나타냈다.

9-3: 충치균에 대한 항균활성

충치균에 대한 항균효과를 확인하기 위해 충치균 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans, ATCC3065) 를 준비하였다. 상기 충치균은 BHI 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 전배양(pre-culture)하였다. 이어서, 페트리디쉬에 1%(w/v)의 LB agar를 20mL 분주하고 응고하여 평판배지를 제조한 후, 앞서 전배양한 충치균을 200 μL씩 첨가하고 멸균된 유리봉으로 배지 위에 고르게 도포한 후, 30분 동안 건조시켰다.

9-4: 치아우식균에 대한 항균활성

치아우식균에 대한 항균효과를 확인하기 위해 치아우식균 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus, ATCC33478) 를 준비하였다. 상기 치아우식균은 BHI 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 전배양(pre-culture)하였다. 이어서, 페트리디쉬에 1%(w/v)의 LB agar를 20mL 분주하고 응고하여 평판배지를 제조한 후, 앞서 전배양한 치아우식균을 200 μL씩 첨가하고 멸균된 유리봉으로 배지 위에 고르게 도포한 후, 30분 동안 건조시켰다.

상기 실시예 9-1와 실질적으로 동일한 방법으로 억제환의 직경을 측정하여 항균성 분석을 수행하였다. 상기 항균활성에 대한 실험결과는 도 9 및 하기 표 7에 나타냈다.

	각 시료별 억제환 직경
	해방풍 잎 추출물(GLE)		해방풍 뿌리 추출물(GRE)
	미발효 (비교시료 1)	발효 (시료 5)	미발효 (비교시료 2)	발효 (시료 6)
치아우식균 (S.sobrinus)	-	-	0.4mm	0.9mm
충치균 (S. mutans)	-	-	0.2mm	0.5mm
여드름균 (P.acne)	-	0.4mm	0.4mm	0.5mm
비듬균 (M. furfur)	-	-	0.1mm	1.2mm

도 9에 나타낸 바와 같이, 해방풍잎 추출물(비교시료 1) 또는 해방풍 뿌리 추출물(비교시료 2)을 접종한 경우, 해방풍 뿌리 추출물이 충치균과 여드름균에서 항균효과를 보여 시험균주가 자라지 못해 원형의 환이 생성되었으나, 해방풍잎 추출물의 경우, 항균 효과를 의미하는 환이 생성되지 않았다. 그러나, L.plantarum(KCCM12299P), P. acidilactici (KCCM12300P)을 공접종한 시료 5와 시료 6에서는 잎추출물의 발효물(시료 5)의 경우 여드름균에서 항균 환이 보였고 뿌리 추출물의 발효물의 경우 충치균, 여드름균 및 비듬균에서 강한 항균 환이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 발효물의 항균 효과가 미발효 추출물에 비해 우수함을 확인할 수 있었다. 특히 해방풍의 뿌리 추출물은 세가지 균주 모두에 대해 우수한 항균 활성을 나타내었다.

따라서, 해방풍추출물은 항균활성이 적으나, 본 발명의 해방풍의 추출물의 발효물의 경우, 유산균 접종 후 발효단계를 거침으로써, 여드름균, 비듬균, 및 충치균에 대한 항균 활성이 우수함을 확인할 수 있었다. 이에, 본 발명의 해방풍의 추출 발효물은 여드름, 비듬 및 치주 개선 또는 치료용 물질로 사용할 수 있음을 확인하였다.

한국미생물보존센터

KCCM12299P

20180810

한국미생물보존센터

KCCM12472P

20190329

<110> Gyeongbuk Institute for Marine Bioindustry <120> Fermented product of Glehnia littoralis extract, preparation method and use thereof <130> DPP20184164KR <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cmtggctca 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1472 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus plantarum KCCM12299P 16SrRNA <400> 3 gaagcagtgg cgggtgctat acatgcagtc gaacgaactc tggtattgat tggtgcttgc 60 atcatgattt acatttgagt gagtggcgaa ctggtgagta acacgtggga aacctgccca 120 gaagcggggg ataacacctg gaaacagatg ctaataccgc ataacaactt ggaccgcatg 180 gtccgagctt gaaagatggc ttcggctatc acttttggat ggtcccgcgg cgtattagct 240 agatggtggg gtaacggctc accatggcaa tgatacgtag ccgacctgag agggtaatcg 300 gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360 cacaatggac gaaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaaaggt ttcggctcgt 420 aaaactctgt tgttaaagaa gaacatatct gagagtaact gttcaggtat tgacggtatt 480 taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta cgtggcaagc 540 gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc tgatgtgaaa 600 gccttcggct caaccgaaga agtgcatcgg aaactgggaa acttgagtgc agaagaggac 660 agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720 ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag tatgggtagc aaacaggatt 780 agataccctg gtagtccata ccgtaaacga tgaatgctaa gtgttggagg gtttccgccc 840 ttcagtgctg cagctaacgc attaagcatt ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa 900 actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagct 960 acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacata ctatgcaaat ctaagagatt agacgttccc 1020 ttcggggaca tggatacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080 gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tatcagttgc cagcattaag ttgggcactc 1140 tggtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc 1200 cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac aacgagttgc gaactcgcga 1260 gagtaagcta atctcttaaa gccattctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca 1320 tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380 ttgtacacac cgcccgtcac accatgagag tttgtaacac ccaaagtcgg tggggtaacc 1440 ttttaggaac cagccgctaa gtgacagaat gg 1472 <210> 4 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pediococcus acidilactici KCCM12472P 16SrRNA <400> 4 cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gaacgaactt ccgttaattg attatgacgt 60 gcttgcactg aatgagattt taacacgaag tgagtggcgg acgggtgagt aacacgtggg 120 taacctgccc agaagcaggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg tataacagag 180 aaaaccgcct ggttttcttt taaaagatgg ctctgctatc acttctggat ggacccgcgg 240 cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga tgatgcgtag ccgacctgag 300 agggtaatcg gccacattgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta 360 gggaatcttc cacaatggac gcaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaagggt 420 ttcggctcgt aaagctctgt tgttaaagaa gaacgtgggt gagagtaact gttcacccag 480 tgacggtatt taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540 ggtggcaagc gttatccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt cttttaagtc 600 taatgtgaaa gccttcggct caaccgaaga agtgcattgg aaactgggag acttgagtgc 660 agaagaggac agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac 720 cagtggcgaa ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc 780 gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgattactaa gtgttggagg 840 gtttccgccc ttcagtgctg cagctaacgc attaagtaat ccgcctgggg agtacgaccg 900 caaggttgaa actcaaaaga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 960 attcgaagct acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ttctgccaac ctaagagatt 1020 aggcgttccc ttcggggaca gaatgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080 gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tactagttgc cagcattcag 1140 ttgggcactc tagtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggga cgacgtcaaa 1200 tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca aatggatggt acaacgagtc 1260 gcgaaaccgc gaggtttagc taatctctta aaaccattct cagttcggga ctgtaggctg 1320 caactcgcct acacgaaagt cggaatcgct 1350 <210> 5 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus plantarum reference 16SrRNA <400> 5 cgcagggcgg gtgctataca tgcagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc 60 atgatttaca tttgagtgag tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa 120 gcgggggata acacctggaa acagatgcta ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc 180 cgagtttgaa agatggcttc ggctatcact tttggatggt cccgcggcgt attagctaga 240 tggtggggta acggctcacc atggcaatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc 300 acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac 360 aatggacgaa agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa 420 actctgttgt taaagaagaa catatctgag agtaactgtt caggtattga cggtatttaa 480 ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540 gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc 600 ttcggctcaa ccgaagaagt gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt 660 ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc 720 ggctgtctgg tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagtat gggtagcaaa caggattaga 780 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60 tgattatgac gtgcttgcac tgaatgagat tttaacacga agtgagtggc ggacgggtga 120 gtaacacgtg ggtaacctgc ccagaagcag gggataacac ctggaaacag atgctaatac 180 cgtataacag agaaaaccgc ctggttttct tttaaaagat ggctctgcta tcacttctgg 240 atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gatgatgcgt 300 agccgacctg agagggtaat cggccacatt gggactgaga cacggcccag actcctacgg 360 gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgcaagtct gatggagcaa cgccgcgtga 420 gtgaagaagg gtttcggctc gtaaagctct gttgttaaag aagaacgtgg gtgagagtaa 480 ctgttcaccc agtgacggta tttaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 540 cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg 600 gtcttttaag tctaatgtga aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatt ggaaactggg 660 agacttgagt gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat 720 atggaagaac accagtggcg aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa 780 agcatgggta gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gatgattact 840 aagtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc tgcagctaac gcattaagta atccgcctgg 900 ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaaa gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 960 gcatgtggtt taattcgaag ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcttctgcca 1020 acctaagaga ttaggcgttc ccttcgggga cagaatgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1080 agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt attactagtt 1140 gccagcattc agttgggcac tctagtgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1200 acgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt 1260 acaacgagtc gcgaaaccgc gaggtttagc taatctctta aaaccattct cagttcggac 1320 tgtaggctgc aactcgccta cacgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1380 gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac 1440 acccaaagcc ggtggggtaa ccttttagga gctagccgtc taaggtggga cagatgatta 1500 gggtgaagtc gtaaca 1516

Claims

해방풍(Glehnia littoralis) 용매 추출물의 유산균 발효물.
제1항에 있어서, 상기 해방풍 추출물은 해방풍의 잎, 뿌리, 꽃잎, 꽃받침, 열매 및 줄기로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 추출물인, 발효물.
제1항에 있어서, 해방풍 추출물은 해방풍의 용매 추출물로서, 상기 용매는 물, 주정, 탄소수 1 내지 3의 알코올, 해양심층수 및 염지하수로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것인, 발효물.
제1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 부흐네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란터룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토코쿠스 락틱스(Lactoccocus lactics), 락토바실러스 델브류키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus) 및 페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유산균인, 발효물.
제1항에 있어서, 상기 발효물은 발효 전 추출물에 비해 가바 함량이 1.01 내지 10배 증가한 것인, 발효물.
제1항에 있어서, 상기 발효물은 여드름균, 비듬균, 치아우식균 및 충치균에 대한 항균 활성을 가지는 것인, 발효물.
제1항에 있어서, 상기 발효물은 피부의 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 것인, 발효물.
해방풍의 용매 추출물을 얻는 단계;
상기 해방풍의 용매 추출물에 유산균을 접종하고 발효하는 단계;를 포함하는
해방풍 용매 추출물의 유산균 발효물의 제조 방법.
제8항에 있어서, 상기 해방풍의 용매 추출물을 얻는 단계 이후 상기 용매 추출물을 원심분리, 여과, 정제 및 멸균으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 후처리 공정을 수행하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 용매 추출물을 얻는 단계의 용매는 물, 주정, 탄소수 1 내지 3의 알코올, 해양심층수 및 염지하수로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 용매 추출물을 얻는 단계는 60 내지 100°C 의 물을 이용하여 수행되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 해방풍 추출물은 해방풍의 잎, 뿌리, 꽃잎, 꽃받침 및 줄기로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 추출물인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 부흐네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란터룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토코쿠스 락틱스(Lactoccocus lactics), 락토바실러스 델브류키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus) 및 페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유산균인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 유상균을 접종하고 발효하는 단계는, 유산균 1x10⁸ 내지 1x10¹⁵ cfu/ml를 접종하여, 25 내지 40℃ 온도에서 발효를 수행하는 것인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 유산균을 접종하고 발효하는 단계 이후 발효물을 건조하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 해방풍의 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 항균 조성물.
1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 해방풍의 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 여드름, 비듬, 식중독, 및 충치로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 해방풍의 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 여드름, 비듬, 식중독 및 충치로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 해방풍의 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 구강청결용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 해방풍의 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 비듬 방지용 화장료 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 해방풍의 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물.