KR102260782B1 - 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

흰점박이꽃무지 추출물의 발효물, 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물은 항균성을 가져 천연방부제로 사용할 수 있으며, 항산화 조성물, 지질산화 억제용 조성물, 미백용 화장료 조성물, 여드름 예방 및 치료용, 비듬 예방 및 치료용 화장료 조성물 등으로 사용될 수 있으며, 다양한 식품, 약학적 조성물 등에도 활용될 수 있다.

Description

흰점박이꽃무지 추출물의 발효물, 이의 제조방법 및 용도 {Fermented product of Protaetia brevitarsis extract, its preparation method and use}
본 발명은 흰점박이꽃무지의 용매 추출물의 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 흰점박이꽃무지의 용매 추출물의 발효물은 항균성, 항산화 효능, 지질산화 억제, 미백, 여드름균, 비듬균 억제 등의 다양한 기능성을 가짐으로써, 식품, 식품 첨가물, 화장료 조성물, 약학 조성물 등의 다양한 분야에 활용될 수 있다.
식용곤충은 오래 전부터 유럽, 미주, 한국, 중국, 일본과 동남아시아 등 세계 여러 나라에서 섭취되어 왔다. 식용곤충은 이제까지 알려진 종류만으로 1,900종 이상이 있으며, 주로 채집한 형태로 바로 먹거나 건조, 볶음, 튀김과 같은 간단한 조리과정만을 거쳐 섭취된다.
2008년 국제연합식량농업기구(United Nations Food and Agriculture Organization, FAO)는 곤충사육과 섭취에 대한 다각적인 연구를 시작하였다. 2012년 식용곤충산업 관련 자료를 발간과 더불어 2013년 이후로 미래의 기아퇴치, 영양보충 및 단백질공급, 환경오염의 저감 등을 위한 대비로 전 세계가 식용곤충을 주목하게 되었다. 우리나라는 2010년 농림축산식품부에서 곤충의 이용과 활용에 다각적인 관심과 산업성장의 필요성을 인식하여 곤충산업 육성 및 지원에 관한 법률을 제정한 이후로 곤충산업이 빠르게 성장하고 있다. 현재 식품의약품안전처의 신소재식품의 인증 절차를 통하여 벼메뚜기, 누에번데기, 백강잠, 갈색거저리 유충, 흰점박이꽃무지 유충, 쌍별귀뚜라미, 장수풍뎅이 유충 7종의 곤충이 식품으로서 이용 가능하게 되었으며, 풀무치, 아메리카왕거저리, 수벌번데기의 식품등록이 진행 중이다.
식용곤충은 가축과 비교해 사육이 용이하며, 사육환경이 친환경적이고, 지속 가능한 산업 특성을 가지고 있다. 또한 단백질, 불포화지방산, 식이성섬유, 칼슘, 철과 같은 무기질, 및 비타민을 풍부히 포함하며 높은 영양가치를 가지므로 육류를 대체하기 충분한 바, 고단백, 고영양, 고기능성의 식품소재로 주목 받고 있다.
우리나라에서는 근 5~6년 동안 식용곤충을 이용한 식품연구가 집중적으로 수행되었으며, 다각적으로 식용곤충 시장이 형성되고 있다. 이더블카페에서는 식용곤충 제과, 음료, 디저트류를 개발해 판매하고 있으며, 빠삐용의 키친은 식용곤충 파스타, 샐러드 등, ㈜CJ, ㈜농심의 대기업도 제품개발 연구를 추진하는 중이다. ㈜한미양행에서는 탈지 후 분말을 제품화 했으며, ㈜인섹트비전은 고소애국수, 고소애 조미료, 고소애 누룽지, 반려견 사료 등의 식용곤충을 원료로 사용한 다양한 제품들이 출시되고 있다.
그러나 아직까지 소비자들에게는 식용곤충에 대한 거부감이 있으며, 식용곤충의 이취, 고미, 미생물 오염 위험, 중금속 등에 의한 화학적 오염, 알레르기 증상과 같은 잠재적 위험요소가 존재한다. 이에, 식용곤충을 활용하기 위한 선결 과제로서 소비자의 혐오감과 선입견을 낮추고 친숙한 식품으로 소비자에게 다가갈 필요가 있다. 이와 함께, 미생물에 의한 변질로부터 안정성을 확보하고, 중금속 제거, 이취, 고미 제거 등의 문제 해결책이 필요한 실정이다.
이와 함께, 식용곤충을 일반식품 등에 활용하기 위해서는 식용곤충의 독성 평가를 통한 안전성 확보, 세균, 바이러스 등의 미생물에 의한 오염 및 부패를 대비하고 안전하게 장기간 저장 유통, 보관 방법에 대한 연구가 필요하다.
장기간 저장 유통방법과 관련해, 기존 식품에서는 가열(heating), 초고압(very high pressure), 방사선(radioactive rays), PEF(Pulsed Electric Field, 비가열살균법), 광펄스(optical pulse) 등의 물리적 방법과 알코올, 염소(chlorine), 과산화수소(hydrogen peroxide), 등의 화학적 방법이 사용되고 있으며, 일부는 편의성과 비용 때문에 아질산염(nitrite), 소르브산(sorbic acid), 메타중아황산나트륨(sodium metabisulfite), 염소제(organochlorine agent) 등 다양한 합성 보존료가 사용되고 있다. 그러나, 물리적 방법은 식용곤충 자체의 물성을 약화시킬 수 있으며, 합성 보존료는 체내 축적성 등 안전성에 관한 문제가 지속적으로 대두되고 있고 물질의 종류, 사용량 등에 따라 인체에 부정적 영향을 미친다.
이러한 이유로 식용곤충을 장기간 보전하기 위해서는 인공 합성 보존제보다 안전성이 확보되고, 저장성이 향상된 천연 항균성 물질을 보존제로 사용하거나, 식용곤충 식품 자체에 이러한 항균성을 갖도록 제조하는 방법에 관한 연구가 필요하다.
전통적인 천연 항균물질 중 하나로, 미생물에서 유래된 니신(nisin), 폴리리신(e-polylysine), 나타마이신(natamycin) 등이 있으며, 유산균이 생성하는 항균성 펩타이드(peptide), 또는 박테리오신(bacteriocin)이 있다. 이러한 항균물질들은 생체 내에 안전하며, 상기 항균물질들이 인체에 섭취되면 소화기관 내에 존재하는 단백질 가수분해 효소에 의해 분해되므로 장내 유익균에 영향을 주지 않고, 잔류성이 없어 식품 등의 천연 보존제로 사용하기 적절하다.
기존 소재를 미생물을 이용해 발효시킬 경우, 기존의 효능과는 다른 새로운 효능이 부여될 수 있으며, 다수의 유해한 성분들이 안전한 성분으로 변화될 수 있다. 천연물을 발효시킴으로써 천연물 자체에 포함된 성분, 전환효소에 의한 천연물 성분의 활성화, 발효 균주에 의한 새로운 성분들의 생성되어 천연물의 기능을 상승시킬 수 있다. 또한, 분해효소의 작용에 의해 영양성분들을 저분자화 시킴으로써, 흡수성을 증가시키거나, 자극성을 낮추고 알러지 성분을 감소 시킬 수 있다.
최근 천연 소재로부터 항균활성을 가진 물질을 탐색하여, 식품에 적용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있으나, 아직까지 GRAS(Generally recognized as safe)로 분리된 유산균(Lactic acid bacteria, LAB)을 식용곤충에 적용해 발효한 예는 없다. 유산균을 이용한 바이오컨버젼(bioconversion)기술로 천연 항균물질을 생산하고 이를 식용곤충에 응용하여 항균제, 항산화기능 향상, 보관, 저장, 유통에 있어 방부제 기능이 향상된 식용곤충 추출물의 발효물을 제조하고, 유산균 자체의 분해효소로 아미노산, 펩타이드화, 지방, 탄수화물 등을 분해하여 체내 흡수율과 기능성을 높인 식용곤충 추출물의 발효물에 관해서는 아직까지 알려진 바가 없다.
한국등록특허 제10-2018-0019838호(2018년 02월 27일) 한국공개특허 제10-2003-0001659호(2003년 01월 08일)
본 발명은 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물에 관한 것이다.
본 발명은 흰점박이꽃무지의 용매 추출물을 제조하는 단계, 상기 용매 추출물에 유산균을 접종하고 발효하는 단계를 포함하는, 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물의 제조방법 및 이로부터 제조되는 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 항균제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 단백질, 지방, 탄수화물, 및 셀룰로스 중 선택된 어느 하나의 영양소 분해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 중금속 해독제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 미백, 항산화, 여드름 예방 및 치료용, 및 비듬 예방 및 치료용으로 이루어진 군에서 1종 이상의 용도를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물, 이의 제조방법 및 상기 유산균 발효물의 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 흰점박이꽃무지의 용매 추출물을 제조하는 단계, 및 상기 용매 추출물을 포함하는 발효 원료에 유산균을 접종하고 발효하는 단계를 포함하는, 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 흰점박이꽃무지의 용매 추출물을 유산균으로 이용하여 발효한 유산균 발효물 및 상기 발효물의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 흰점박이꽃무지의 용매 추출물의 유산균 발효물은, 흰점박이꽃무지의 용매 추출물에 유산균을 접종하여 배양 또는 발효배양하여 얻어진 것이다.
본 발명의 흰점박이꽃무지의 추출물 또는 상기 추출물의 유산균 발효물을 얻기 위한 흰점박이꽃무지는 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)의 유충을 의미하며, 바람직하게는 번데기를 형성하기 전의 3령 유충을 의미하는 것일 수 있다.
상기 흰점박이꽃무지 유충은 분말화 이전에 1일 내지 5일간 또는 3일 내지 5일간 절식을 수행할 수 있다. 상기 절식 단계를 거침으로써 흰점박이꽃무지 유충의 장내 이물질을 제거할 수 있다. 절식 기간이 1일 미만인 경우 장내 잔여 이물질이 충분히 제거되지 않을 수 있으며, 5일 이상 절식이 수행되는 경우 유충이 사망 또는 영양상태가 불량하게 될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 흰점박이꽃무지 3령 유충을 35일간 사육 후 3일의 절식 후 흐르는 물에 세척한 이후 55 내지 65℃, 예를 들면 60℃의 온도에서 12 시간 내지 60시간, 예를 들면 48시간 동안 열풍건조하여 살충처리하여 추출 원료로 이용한다.
상기 추출 원료로 준비된 흰점박이꽃무지 유충은 유충 내에 존재하는 미생물 제거를 위해 별도의 멸균 처리 과정을 추가로 거칠 수 있다. 상기 멸균 처리 과정을 거침으로써 유충 내 유해 세균을 제거하여 식품 또는 의약품으로서의 안전성을 확보할 수 있으며, 상기 목적을 달성하기 위한 범위 내에서 멸균 방법을 자유롭게 선택하여 사용할 수 있다.
상기 유산균 발효물 제조를 위한, 흰점박이꽃무지의 용매 추출물은, 흰점박이꽃무지 유충, 이의 건조물 또는 분쇄물을 추출 용매로 추출하여 제조된 것이다. 상기 용매 추출물의 제조에 사용되는 흰점박이꽃무지는, 흰점박이꽃무지 유충을 열풍건조, 마이크로웨이브, 동결건조 등의 방법으로 건조한 후, 분쇄기로 분말화한 분말일 수 있다. 이때 분말의 입자 크기에 대한 제한은 없으며, 일반 분쇄기 또는 식품용 믹서기로 1분간 강한 열이 발생하지 않도록 처리하여 제조한 분말일 수 있다. 또는 상기 흰점박이꽃무지 유충을 동결한 후, 버퍼와 함께 마쇄한 분말을 사용할 수 있다. 상기 제조한 분말을 추출물 제조에 바로 사용할 수도 있고, -20℃ 내지 -70℃ 조건에서 6개월 내지 1년간 보관한 흰점박이꽃무지 분말을 사용할 수 있다. 또는, 흰점박이꽃무지 유충을 건조하지 않고 -70℃ 에서 냉동보관한 후, 물을 넣고 분쇄한 생체를 사용할 수도 있다.
상기 추출용매는 물, 탄소수 1(C1) 내지 3(C3)의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 물, 에탄올(EtOH) 또는 에탄올 수용액일 수 있다. 상기 용매 추출방법은 통상의 추출법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 추출 용매에 의한 추출, 초임계 유체 추출, 초음파 추출, 열수 추출 등의 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 열수 추출방법을 사용할 수 있다. 상기 용매추출 시간은 4 내지 6시간, 또는 5 내지 6시간일 수 있다.
상기 용매 추출시의 추출온도는 10℃ 내지 90℃, 20℃? 내지 80℃, 30℃? 내지 70℃, 또는 30℃ 내지 60℃ 일 수 있다. 예컨대 상기 용매가 물인 경우, 추출온도는 40 내지 80℃, 50 내지 70℃, 55 내지 65℃, 예를 들어 60℃ 일 수 있으며, 상기 용매가 주정(EtOH)인 경우, 추출온도가 10℃ 내지 50℃, 20℃? 내지 40℃, 25℃? 내지 35℃, 예를 들어 30℃ 일 수 있다.
구체적인 일 예로서, 상기 추출용매는 물을 이용하여 추출온도 30℃ 내지 80℃ 에서 수행하거나, 알코올 수용액을 이용하여 추출온도 9℃ 내지 50℃에서 수행할 수 있다. 상기 알코올 수용액은 알코올 함량 70 내지 100%을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물은 흰점박이꽃무지 열수 추출물(Hotwater Extract of Protaetia brevitarsis, HePb), 또는 흰점박이꽃무지 주정 추출물(Ethanol Extract of Protaetia brevitarsis, EePb)일 수 있다.
상기 흰점박이꽃무지 열수 추출물은 흰점박이꽃무지 유충 분말 (Protaetia brevitarsis Powder, Pb) 100 g에 물 900 mL (w/v) 을 1 : 9의 비율로 혼합한 후, 초음파 및/또는 볼텍스 챔버 등을 이용해 혼합하고, 60℃ 온도로 4 내지 6 시간 진탕 배양하여 추출물을 얻고 원심분리한 후 진공 여과(vaccum filter)하여 얻은 약 700 ~ 800 ml(70 ~ 80 %) 의 흰점박이꽃무지 열수추출물(Hotwater Extract of Protaetia brevitarsis, HePb)일 수 있다. 본 발명의 상기 제조방법으로 제조된 흰점박이꽃무지 열수 추출물은 액상 상태 그대로를 사용할 수도 있으며, 이를 동결건조하고 분말화한 흰점박이꽃무지 추출물의 분말을 사용할 수도 있다.
상기 흰점박이꽃무지 주정 추출물은 주정(70~100 % EtOH)을 사용하여 추출한 것일 수 있다. 흰점박이꽃무지 유충 분말(Pb) 100 g에 에탄올 900 mL (w/v) 1:9의 비율로 혼합 후 초음파 또는 볼텍스 챔버 등을 이용해 혼합하고, 30 ℃ 온도로 4 ~ 6 시간 진탕 배양하여 추출물을 얻고 원심분리한 후 진공 여과(vaccum filter)하여 얻은 약 700 ~ 800 ml(70 ~ 80 %) 흰점박이꽃무지 주정추출액(Ethanol Extract of Protaetia brevitarsis, EePb)일 수 있다. 그리고 이 흰점박이꽃무지 주정추출액(EePb)의 알코올을 휘발시킨 후, 물로 세정하고 얻은 농축물에 800 mL 물을 넣어 최종 적인 흰점박이꽃무지 주정 추출물의 농축물을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 흰점박이꽃무지의 용매 추출물의 유산균 발효물은, 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 그대로 발효를 위한 원료로 사용하거나, 원심 분리 또는 여과 등 후처리 공정을 처리하여 발효 원료로 사용될 수 있다. 흰점박이꽃무지의 유효물질을 활용하기 위해 양적인 손실을 줄이기 위한 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물 전체를 사용할 수도 있고, 흰점박이꽃무지 열수추출물의 상청액만을 사용할 수도 있다.
상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 제조함으로써, 기존의 흰점박이꽃무지 분말에서는 얻을 수 없었던, 추출물만의 생리활성과 물성을 확보할 수 있을 뿐만 아니라, 식용곤충 분말에 포함되어 있던, 미생물 제거하여 차후 식품 또는 화장료 조성물 등에 활용할 시 물성에 영향을 주지 않도록 하는 장점이 있다.
구체적으로, 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물은 (ⅰ) 원심분리와 여과에 의해 흰점박이꽃무지 분말을 일부 제거한 열수 또는 주정 추출물을 사용할 수 있으며, 또는 (ⅱ) 흰점박이꽃무지 분말을 제거하지 않은 추출침전물일 수 있다.
본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물은, 흰점박이꽃무지 용매 추출물 그 자체 또는 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 조성물을 발효 원료로 하여 제조되는 것일 수 있다.
상기 첨가물은 탄소원 및 질소원으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 첨가물일 수 있으며, 바람직하게는 탄소원을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 덱스트로스(dextrose), 글루코스(glucose), 수크로스(sucluse), 락토스(lactose), 및 갈락토오스(galactose)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 덱스트로스일 수 있다. 상기 탄소원 첨가량은 흰점박이꽃무지 용매 추출물 질량의 3 내지 20 질량%, 5 내지 20 질량%, 7 내지 20 질량%, 3 내지 15 질량%, 5 내지 15질량%, 7 내지 15 질량%, 또는 7 내지 10% 질량%일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 흰점박이꽃무지 용매 추출물에 덱스트로스를 8 질량%를 첨가하여 발효 원료로 이용한 결과, 덱스트로스가 첨가되지 않은 발효 원료를 이용한 경우에 비해 유산균의 생장이 현저히 증가하였다.
구체적으로, 락토바실러스 플란타럼의 경우, 흰점박이꽃무지 용매 추출액 단독으로 탄소원 첨가없이 배양한 경우, 24시간 배양 후에도 7.0x103 log cfu/ml의 LAB Count를 보여 저조한 생장을 보였으나, 덱스트로스 8 질량%가 첨가된 흰점박이꽃무지 열수추출물에서 24시간 배양한 경우, 2.7x1011 log cfu/ml의 LAB Count를 보여, 일반적인 유산균 배양 배지인 MRS 배지에서 24시간 배양한 경우의 6.26x109 log cfu/ml에 비해 약 40배, 덱스트로스를 함유하지 않은 흰점박이꽃무지 용매 추출물에 비해 약 3x107배 우수한 유산균의 증식을 보였다.
웨이셀라 파라메센테로이드 KCCM12300P의 경우에도, 덱스트로스가 첨가되지 않은 흰점박이꽃무지 열수추출물에서는 24시간 배양에 불구하고 3.21x102 log cfu/ml 수준의 증식을 보였으나, 덱스트로스 첨가 흰점박이꽃무지 열수추출물에서는 5.7x109 log cfu/ml 수준으로 유산균 증식 활성이 현저히 증가하였으며, 이러한 수치는 MRS 배지의 3.0x108 log clu/ml보다 우수한 증식 활성이다.
웨이셀라 파라메센테로이드 KCCM12301P 균주의 경우, 덱스트로스 미포함 흰점박이꽃무지 열수추출물, 덱스트로스 8중량% 포함 흰점박이꽃무지 열수추출물에서 24시간 유산균 배양을 수행한 결과 LAB Count가 각각 3.21x102 log cfu/ml 및 3.17x108 log cfu/ml이었다.
상기 질소원은 소고기 추출물(beef extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 스킴밀크(skim milk) 등을 사용할 수 있다. 흰점박이꽃무지의 용매 추출물의 경우 질소원 첨가 없이도 유산균을 배양할 수 있다. 또한 무기염류로 초산나트륨(sodium acetate), 황산이칼륨(dipotassium sulfate), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 시트르산암모늄(ammonium citrate) 등이 첨가 될 수 있으나 없이도 유산균을 배양할 수 있다.
유산균 배양배지는 업계에 공지된 통상의 배지로 MRS(de Man Rogasa and Sharpe) 배지, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Mediu), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 흰점박이꽃무지가 가진 질소원, 탄소원, 및 미량원소로 유산균을 배양하였다. 이때 배양을 돕기 위해 탄소원으로 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로오즈와 같은 탄수화물을 사용할 경우, 유산균의 배양을 원활히 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 흰점박이꽃무지 추출물의 유산균 발효물은, 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물에 유산균을 접종하고 발효하여 제조할 수 있다. 상기 유산균을 접종하고 발효하는 과정에서, 지방산 폴리글리콜 에스테르 등의 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 호기상태를 유지하기 위해 산소 또는 산호-함유 기체(공기)를 주입할 수 있다.
본 발명에서 유산균 발효는 원재료를 물리적, 화학적인 방법으로 변형 또는 변형시키는 것을 의미하며, 자연상태에서 수년간 소요 될 수 있는 것을 수 시간 또는 수 개월 만에 원하는 결과물을 얻을 수 있는 분해 과정을 의미한다. 특히 본 발명에서 유산균 이용 발효는 원재료의 성분 또는 약성을 선택적으로 분해, 절단하는 것과 더불어 원재료의 성분을 이용하여 유산균의 기능성, 유효 물질을 생산하는 것을 의미한다. 이러한 과정을 통해 유산균이 흰점박이꽃무지에 함유되어 있는 단백질, 탄수화물, 지방 및 무기질에서 유효성분을 작은 분자로 분해, 절단하여 대사물질을 만들어 내며, 이것을 '흰점박이꽃무지 추출물의 발효물'이라고 칭한다.
구체적으로, 본 발명에서 '흰점박이꽃무지 추출물의 발효물'이란 (ⅰ)흰점박이꽃무지 용매 추출물을 유산균을 발효시킨 '발효액'(발효된 유산균 상청액) 또는 (ⅱ)유산균 발효 후 균체를 제거한 '여액'(상청액만 포함 일부 유산균 존재), 또는 (ⅲ)배양 추출 후 남은 식용곤충 분말을 포함한 상태의'추출침전 발효물'(흰점박이꽃무지 분말, 유산균, 상청액)을 모두 포함하며, 그에 포함된 유효 구성성분을 포함한다. 이들을 통칭해서 흰점박이꽃무지 용매추출물의 발효물이라 한다.
본 발명이 제공하는 흰점박이꽃무지의 유산균 발효물은 하기 기재 사항중 하나 이상의 특성을 가질 수 있다:
i) 흰점박이꽃무지 추출물의 미발효물에 비해 우수한 보관 안정성
ii) 리스테리아, 황색포도상구균, 대장균, 바실러스, 비브리오, 형광균, 여드름균 및 비듬균으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세균에 대한 항균 활성
iii) 탄수화물, 단백질, 지방 및 셀룰로스로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 영양성분에 대한 분해 활성
iv) 미발효 흰점박이꽃무지 추출물에 비해 높은 지방 산패 억제 활성
v) 세포 안전성의 장기간 유지
vi) 흰점박이꽃무지 분말 또는 흰점박이꽃무지 추출물 내 중금속 함량 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 95 중량부의 중금속 함량 및
vii) 미발효 흰점박이꽃무지 추출물 대비 높은 항멜라닌활성.
본 발명이 제공하는 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물 및 그 제조방법에 있어서, 상기 유산균은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 범위 내에서 제한없이 선택하여 사용 가능하며, 락토바실러스 플란터룸(Lactobacillus plantarum, ATCC 10241, NCTC7220), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactics, ATCC 11454, NCIC 8586), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei, ATCC 31063, ATCC 15521), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum, ATCC14931, NCDO 1750), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus, ATCC7469, KCTC3326), 락토바시러러스 브레비스(Lactobacillus brevis, ATCC15521), 락토바실러스 그라미니스(Lactobacillus graminis, ATACC 51150), 락토바실러스 덱스트린쿠스(Lactobacillus dextrinicus, ATCC 33087), 락토코커스 가르비에(Lactococcus garvieae, ATCC11454, LMG 8162), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium, ATCC 19634), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis, ATCC6057), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum, ATCC 49370), 웨이셀라 헬레니카(Weissella hellenica, ATCC 51523), 웨이셀라 파라메센테로이드(Weissella paramesenteroides, ATCC 33313), 페디오코쿠스 에시디락틱시(Pediococcus acidilactici, ATCC33314), 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus, ATCC 33316), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis, ATCC 27672) 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis, ATCC15697) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 균들은 한국생명공학연구원의 생물자원센터 또는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 분양 받아 이용할 수 있다. 바람직하게는 락토바실러스 플란터룸(KCCM 12299P), 웨이셀라 파라메센테로이드 KCCM 12300P 및 웨이셀라 파라메센테로이드 KCCM 12301P로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유산균 균주를 사용할 수 있다.
상기 락토바실러스 플란터룸 균주는, 서열번호 3의 염기서열과 99% 이상, 99.5%이상 또는 99.9% 이상의 서열 상동성(sequence identity)을 가지는 16S rRNA 유전자를 포함하는 균주일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 16S rRNA 서열을 포함하는 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2018년 8월 10일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁된 수탁번호 KCCM12299P 균주일 수 있다.
상기 웨이셀라 파라메센테로이드 균주는, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열과 99% 이상, 99.5% 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 가지는 16S rRNA 유전자 염기서열을 포함하는 균주일 수 있으며, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 16S rRNA 유전자를 포함하는 균주일 수 있으며, 바람직하게는 2018년 8월 10일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁된 수탁번호 KCCM12300P 균주 또는 동일자로 동일 기관에 기탁된 수탁번호 KCCM12301P 균주일 수 있다.
상기 락토바실러스 플란터룸 및 웨이셀라 파라메센테로이드 균주는 MRS 배지를 이용하여 30 내지 37 ℃에서 배양될 수 있다. 상기 락토바실러스 플란터룸 및 웨이셀라 파라메센테로이드 균주는 탄소원 또는 탄소원 및 질소원이 첨가된 흰점박이꽃무지 추출물, 흰점박이꽃무지 열수 추출물 또는 흰점박이꽃무지 주정 추출물을 배지로 이용하여 25 내지 40℃ 온도 범위에서 배양될 수 있다.
본 발명에 따른 추출발효물 제조에 있어서, 상기 유산균의 접종량은 1x108 내지 1x1015 cfu/ml, 예컨대, 1x108 내지 1x1012 cfu/ml, 1x108 내지 1x1010 cfu/ml 일 수 있다.
상기 흰점박이꽃무지 추출물에 유산균을 접종하고 발효 시, 발효 온도는 25 내지 40℃, 바람직하게는 30 내지 37℃에서 수행하는 것이 바람직하며, 발효 시간은 12시간 내지 48시간 미만, 12시간 내지 36시간, 12시간 내지 30시간, 또는 12 내지 24 시간, 예컨대 24시간 동안 발효될 수 있다. 온도와 배양시간이 상기 범위 외일 경우, 유산균이 기능성이 유지될 수 있을 정도의 유산균의 생균수가 유지되지 않고, 사균발생의 우려가 있는 바, 상기 조건에서 발효 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물에 유산균을 접종하고 발효 배양하는 단계를 종료한 후에 배양물과 균체 또는 배양물과, 침전물(균체포함)을 분리하기 위해, 추가로 원심분리(centrifugation)과 여과(filteration)과정을 수행할 수 있다. 이러한 단계는 식품, 화장품, 사료, 기능성 분야의 필요에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 균체의 제거는 통상적인 균체의 제거법을 통해 시행할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 제조방법으로 제조된 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물을 저온의 보관온도에서 1일 내지 400일 동안 보관하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 본 발명의 상기 방법으로 제조된 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물을 저온의 보관온도에서 1일 내지 400일 동안 보관하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 저온의 보관온도는 -70℃ 내지 10℃일 수 있다.
구체적으로, 상기 보관되는 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물은 액상 또는 분말 형태일 수 있으며, 상기 저온의 보관온도는 1℃ 내지 10℃, 예컨대 2℃ 내지 8℃, 3℃? 내지 7℃, 3℃? 내지 6℃, 4℃? 내지 5℃일 수 있다. 상기 온도 범위에서 보관할 경우, 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물에 포함된 유산균의 수가 기능성을 발휘할 수 있을 정도로 충분히 유지될 수 있다. 온도가 상기 범위를 초과할 경우, 예를 들어 30℃인 경우, 유산균 수가 급격히 감소하는 바, 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 기능성이 떨어질 수 있다. 상기 보관온도 1℃ 내지 10℃에서 보관할 경우, 추출 발효물의 보관일은 1일 내지 90일, 10일 내지 90일, 20일 내지 90일, 또는 30일 내지 90일 동안 유통, 보관하는 것이 적절하다. 상기 보관온도에서의 유통, 보관일을 초과할 경우 추출 발효물의 항균력, 효소기능, 항산화 기능 등의 저하가 발생할 수도 있기에, 상기 온도 조건과 보관일 범위에서 보관하는 것이 적절하다.
본 발명의 일 예에 따르면, 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 분말의 경우, 상기 저온의 보관온도는 -70℃ 내지 -10℃, 예컨대 -70℃ 내지 -20℃일 수 있다. 상기 온도 조건에서는 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 보관할 경우, 1일 내지 400일, 예컨대 1년(365일), 또는 360일 동안 보관할 수 있으며, 보관 후에도 발효물의 항균력, 효소기능, 항산화 기능적 특성이 그대로 유지된다.
본 발명에 따른 흰점박이꽃무지의 용매 추출물을 유산균으로 이용하여 발효한 유산균 발효물은 그 자체, 추가 분리 및 정제 공정을 거친 정제물, 또는 동결건조(frezze dry, lyophilization)하여 식품, 화장품, 사료, 기능성 소재로 사용할 수 있다.
본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물은 발효하지 않은 흰점박이꽃무지 분말 또는 흰점박이꽃무지 추출물에 비해 유해 중금속 성분이 저감되는 특성을 가진다. 따라서 인체 안정성이 증가할 수 있다.
상기 중금속은 카드뮴(Cadimium), 수은(Mercury), 비소(Arsenic), 셀레늄(Selenium), 및 크롬(Chromium)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 중금속일 수 있으며, 바람직하게는 카드뮴, 수은, 및 비소로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물은 흰점박이꽃무지 분말 또는 흰점박이꽃무지 추출물 내의 중금속 함량 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 95중량부 또는 1 내지 90 중량부의 중금속 함량을 가질 수 있다.
구체적으로, 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물 내 중금속 함량은 흰점박이꽃무지 분말 내의 중금속 함량 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 50 중량부, 0.5 내지 40중량부, 1 내지 50 중량부, 1 내지 40 중량부, 또는 1.5 내지 35 중량부일 수 있다.
구체적으로, 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물 내 중금속 함량은 흰점박이꽃무지 추출물 분말 내의 중금속 함량 100 중량부를 기준으로 50 내지 95 중량부, 50 내지 90 중량부, 60 내지 95중량부, 60 내지 90 중량부, 또는 65 내지 90 중량부일 수 있다.
본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물은 흰점박이꽃무지 분말에 포함된 중금속을 효과적으로 감소시킴으로써, 체내에 보다 안전한 식용곤충 식품, 화장료 조성물 등으로 활용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 흰점박이꽃무지 분말 용액, 흰점박이꽃무지 추출물 분말 용액 또는 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물 분말 용액을 각각 유도결합플라즈마 발광분광기를 이용해 성분 분석을 수행한 결과, 발효물 내 카드뮴, 비소, 수은의 농도가 감소하고 유효성분인 셀레늄, 크롬의 양은 유지되어, 유효 성분의 함량은 유지하면서 유해한 중금속 성분은 제거되는 특성이 있다.
본 발명의 일 예는 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항균제 조성물을 제공한다.
본 발명의 흰점박이꽃무지 용매추출의 발효물은 그람양성균, 그람음성균 등 다양한 세균에 대하여 항균력을 가짐을 특징으로 한다. 예를 들어, 그람양성균으로 Bicillus subtilis(ATCC 21770), Staphylococcus aureus(ATCC 29213), Bacillus megaterium(ATCC 14581), 그람음성균으로 Listeria monocytogenes(ATCC 15313)Escherichia coli(ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853), Salmonella enterica(ATCC 9184), Vibrio Parahaemolyticus(ATCC 17802) 등을 포함하는 다양한 세균에 대하여 항균력을 가질 수 있다.
본 발명의 흰점박이꽃무지 용매추출의 발효물은 리스테리아(Listeria), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균((Escherichia coli)), 바실러스(Bacillus), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스 균(Pseudomonas), 효모(Yeast), 곰팡이(Fungi), 여드름균 (Propionibacterium acnes), 및 비듬균(Malassezia furfur)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세균에 대해 항균성이 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 리스테리아(Listeria monocytogenes, L. monocytogenes, ATCC 15313), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus, ATCC 12600), 대장균(Escherichia coli, E. coli, ATCC 11775), 바실러스(Bacillus megaterium, B. megaterium, ATCC 14579), 비브리오(Vibrio parahaemolyticus, V. parahaemolyticus, ATCC 17802), 및 형광균(Pseudomonas flurorescens, P. flurorescens, ATCC 13525)에 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물을 첨가한 페이퍼 디스크를 올려 생성되는 억제환(inhibition clear zone)의 크기를 통해 항균 효과를 시험한 결과, 락토바실러스 플란터룸 및 웨이셀라 파라메센테로이드 균주를 모두 접종하여 발효한 발효물(HePbLp/Wp1)에서 유산균 단독 균주를 처리한 대조군과 유사한 직경의 환이 생성되었다 (도 3). 상기 억제환 실험 결과를 통해 본 발명이 제공하는 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물이 리스테리아, 황색포도상구균, 대장균, 바실러스, 비브리오, 및 형광균에 대해 항균 활성을 가짐이 확인되었다.
본 발명의 일 실시예에서, 여드름균(프로피오니박테리움 아크네스), 및 비듬균(멜라세지아 퍼퍼)에 대한 항균 활성을 억제환 형성 실험을 통해 확인하였다. 발효 과정을 거치지 않은 흰점박이꽃무지 열수추출물의 경우, 억제환을 형성하지 않았으나, 락토바실러스플란타룸 또는 웨이셀라 파라메센테로이드를 이용하여 발효를 수행한 발효물은 모두 억제환을 형성하여 (도 4), 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물에서 비듬균 및 여드름균에 대한 항균 활성이 확인되었다. 따라서 본 ㅂ날명이 제공하는 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물은, 여드름의 예방, 치료 또는 개선 및/똔은 비듬의 예방, 치료 또는 개선에 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매추출의 발효물은 우수한 항균성에 의해 천연 방부제 조성물 등으로 활용될 수 있다. 따라서, 흰점박이꽃무지 분말과 비교해 동일한 온도에서 더 오래 품질을 유지되며 부패되지 않아, 식품, 의약품, 화장품 등의 다양한 산업분야에 보다 광범위하게 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물이 흰점박이꽃무지 분말과 비교해 malodialdehyde(MDA) 값이 현저히 낮은 바, 흰점박이꽃무지의 지방의 산패를 억제할 수 있음을 확인하였다. 보다 구체적으로 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물은 흰점박이꽃무지 분말에 비해 MDA 생성량이 0.5배 내지 1.0배, 또는 0.7 내지 0.95배일 수 있다. 즉, 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물은 지질 산패가 흰점박이꽃무지 분말보다 적게 일어나, 오랫동안 보관한 후에도, 품질이 비교적 오래 지속되어 다양한 분야에서 활용될 수 있다.
본 발명의 일 예는, 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는, 단백질, 지방, 탄수화물, 및 셀룰로스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 영양소 분해용 조성물을 제공한다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물은 발효단계에서 접종한 유산균의 기능성을 그대로 포함하고 있으며, 단백질을 분해할 수 있는 프로테아제, 지방을 분해할 수 있는 리파아제, 탄수화물을 분해할 수 있는 아밀라아제, 셀룰로스를 분해할 수 있는 셀룰라아제를 모두 합성해 분비할 수 있다. 따라서, 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물을 식품 등에 사용할 경우, 식품의 영양소를 크기가 작은 분자로 분해시켜 영양분의 체내 흡수 효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 예는, 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는, 항산화용 조성물을 제공한다.
일 실시예에 따르면, DPPH(1,1-dipheyl-2-picrylhydrazyl) 분석에서 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물이 기존의 방부제인 BHA(Buylated hydroxyanisole), BHT(bytylated hydroxytoluene), 비타민 C와 비교해 항산화 기능을 가짐을 확인하였으며, 세포의 ROS를 상실시켜 노화억제 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 산화 스트레스와 관련된 각종 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 산화 스트레스와 관련된 각종 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품 및 화장료 조성물의 소재로 사용될 수 있다.
상기 산화적 스트레스와 관련된 각종 질환은 비만증, 고혈압, 당뇨병, 동맥경화증, 간질환, 폐질환, 갑상선 기능항진증, 갑상선 기능 저하증, 만성피로증후군, 심장병, 고지혈증, 중풍, 신장질환, 통풍, 암, 노화 및 신경퇴행성 질환을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 미백, 항산화, 여드름 예방 및 개선용, 및 비듬 예방 및 개선용으로 이루어진 군에서 1종 이상의 용도를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 비교예인 알부틴과 비교해 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물 세포에서의 우수한 멜라닌 합성 억제 효과를 나타냄을 확인하였다. 어떠한 시료도 처리하지 않은 무처리 세포의 멜라닌 함량을 100% 기준으로 했을 때, 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물을 세포에 처리시 멜라닌 함량은 60 내지 75% 정도에 불과하며, 현저히 우수한 미백효과를 가진다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물이 Vit의 DPPH 억제율을 100%를 기준으로 약 30 내지 50%의 DPPH 억제율을 가지며, 보관일이 길어져도 DPPH 억제율이 유지되거나 소폭 상승함을 확인하였는 바, 장기간 보관이 이루어지더라도 항산화 효능이 유지됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물은 보관 안정성이 우수하여 항산화, 피부 노화 방지, 피부 재생 촉진용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 일 실시예에서는, 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물이 여드름 균(Propionibacterium acnes), 비듬균(Malassezia furfur)의 항균효과가 우수함을 확인하였는 바, 여드름 예방 또는 치료, 비듬 예방 또는 치료용 세정 조성물, 화장료 조성물, 약학적 조성물 등으로 사용될 수 있다.
상기 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분들, 예를 들면, 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제와 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제나 담체를 포함하여 특정 제형으로 성형될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 팩, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 샴푸 및 린스 등의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예로, 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물은 식품 조성물로 사용할 수 있다.
본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물은 식품 조성물 내에 10 내지 100 중량%로 포함될 수 있다. 식품 조성물에 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물이 포함되는 경우, 미생물에 대해 안정한 항균성을 가지며, 방부 효과와 항산화 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 식품의 보관일이 길어져도 동등한 기능과 품질을 오랫동안 유지할 수 있다.
응용가능한 식품류는 쿠키, 제과, 에너지바, 제빵, 면류, 푸딩, 초코렛, 사탕, 젤리, 음료수 등이고, 본 발명의 목적을 달성하기 위해 이러한 제형 중 어떠한 형태로도 제조되어 상용화될 수 있으며, 상기 예에 한정하지 않는다.
본 발명은 또한 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물을 포함하는 방부제 조성물을 제공한다.
본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물은 천연 방부제로 활용될 수 있다. 본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물은 기존의 흰점박이꽃무지 분말에 비해 방부효과, 항산화 효과가 증가하며, 일반적인 저장, 보관, 유통 중에 발생하는 미생물의 증식을 억제하여 제품의 변화를 방지하는 목적으로 사용하는 방부제 아질산 나트륨, 프로피온산 칼슘, 프로피온산 나트륨 등을 대신하는 천연 방부제로 사용할 수 있다.
본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 유산균 발효물은 항균성을 가져 천연방부제로 사용할 수 있으며, 항산화 조성물, 지질산화 억제용 조성물, 미백용 화장료 조성물, 여드름 예방 및 치료용, 비듬 예방 및 치료용 화장료 조성물 등으로 사용될 수 있으며, 다양한 식품, 약학적 조성물 등에도 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 4에 따라, 흰점박이꽃무지 열수추출물 또는 MRS 배지에서 L. plantarum과 2종의 W. paramesenteroides 유산균을 배양한 후 측정한 LAB Counts 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 6에 따라 흰점박이꽃무지 분말, 흰점박이꽃무지 열수추출물, 및 흰점박이꽃무지 열수추출물의 각 발효물을 4℃에서 6개월 동안 보관한 후의 각 유해균 검출여부를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 7-1에 따라, 흰점박이꽃무지 열수추출물, 및 흰점박이꽃무지 열수추출물의 각 발효물의 각 유해균에 대한 항균성 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예 7-2에 따라, 흰점박이꽃무지 열수추출물, 및 흰점박이꽃무지 열수추출물의 각 발효물의 여드름균 및 비듬균에 대한 항균성 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 본 발명의 실시예 8에 따라, 흰점박이꽃무지 열수추출물, 및 흰점박이꽃무지 열수추출물의 발효물의 각 효소 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 9에 따라, 흰점박이꽃무지 열수추출물, 및 흰점박이꽃무지 열수추출물의 각 발효물의 유산균의 기능성이 유지될 수 있는 유산균의 생균수가 유지되는, 최적의 보관온도를 확인하기 위한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 10에 따라, 흰점박이꽃무지 분말, 흰점박이꽃무지 열수추출물, 및 흰점박이꽃무지 열수추출물의 각 발효물의 항산화 활성 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실시예 11에 따라, 흰점박이꽃무지 분말, 흰점박이꽃무지 열수추출물, 및 흰점박이꽃무지 열수추출물의 각 발효물의 지방 산패 억제 효능을확인하기 위해, TBA 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예 12-1에 따라, 흰점박이꽃무지 분말, 흰점박이꽃무지 열수추출물, 및 흰점박이꽃무지 열수추출물의 각 발효물의 사람 3T3-L1 세포를 대상으로 독성 실험을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예 12-2에 따라, 흰점박이꽃무지 분말, 흰점박이꽃무지 열수추출물, 및 흰점박이꽃무지 열수추출물의 각 발효물의 마우스 B16F10 세포를 대상으로 세포 독성 실험을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예 13에 따라, 흰점박이꽃무지 분말, 흰점박이꽃무지 열수추출물, 및 흰점박이꽃무지 열수추출물의 각 발효물의 멜라닌 색소 감소효능을 평가한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기에 기재된 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 흰점박이꽃무지 분말 제조
흰점박이꽃무지 3령(종령) 유충을 35일간 키우고 3일동안 절식시켜 흰점박이꽃무지 유충의 내장을 깨끗하게 하였다. 다음으로 흰점박이꽃무지 유충을 흐르는 물에 세척한 후, 60℃에서 48시간동안 열풍건조하여 살충 처리하였다.
상기 건조시킨 흰점박이꽃무지 유충을 식품용 분쇄기를 사용해 분말로 제조하였다. 구체적으로, 식품 분쇄기 사용에 의한 열 발생을 방지하기 위해 1분간 분쇄 후 3분간 휴지하는 분쇄 Cycle을 5회 반복하여, 흰점박이 꽃무지 분말(Pb)을 제조하였다.
실시예 2. 흰점박이꽃무지 용매 추출물 제조
2-1. 흰점박이꽃무지 열수추출물 제조
실시예 1-1에서 제조한 흰점박이 꽃무지 분말(Pb)을 사용해 열수추출물을 제조하였다. 흰점박이꽃무지 유충 분말(Pb) 100g과 물 900ml을 1 : 9 의 비율로 혼합한 후, 초음파를 750 watt, 10 kHz에서 10초 간격으로 5분간 조사하여 혼합하였다(Sonics Vibra-Cell, USA). 다음으로, 혼합물을 60℃의 열수에서 4 내지 6시간 동안 진탕 배양한 후, 배양한 추출물을 원심분리 (3,000 rpm, 10분) 하고 0.45 um corning bottle-top (Sigma, USA)를 사용하여 진공 여과(vacuum filter)하여 약 800~ 900ml(80~90%)의 흰점박이꽃무지 열수추출물(Hotwater Extract of Protaetia brevitarsis, HePb)을 제조하였다.
상기 액상 열수 추출물은, -70℃에서 보관 후 동결건조하거나 바로 동결건조하여 분말화한 후 이후 실험에 이용되었다.
2-2. 흰점박이꽃무지 주정 추출물 제조
실시예 1-1에서 제조한 흰점박이꽃무지 유충 분말(Pb) 100g과 주정(100 %(v/v) EtOH) 900mL(w/v)를 1 : 9의 부피비로 혼합한 후, 750 watt, 10 kHz의 초음파를 10초 간격으로 5분간 조사하여 혼합하였다(Sonics Vibra-Cell, USA). 다음으로, 상기 혼합물을 30℃에서 4시간 동안 진탕 배양하였으며, 배양한 추출물을 원심분리(3,000rpm, 10분)한 후, 0.45um corning bottle-top (Sigma, USA)을 사용해 진공 여과(vacuum filter)하여 약 700~800 ml(70~80%)의 주정 추출액을 얻었다. 이어서, 주정 추출액의 알코올을 Rotary evaporator를 사용해 50℃ 에서 1시간 동안 휘발한 후, 주정 추출액의 농축물을 제조하였다. 상기 주정 추출액의 농축물을 물로 2~3회 세정한 후, 800mL의 물을 넣어 최종적으로 흼점박이꽃무지 주정 추출물을 제조하였다.
실시예 3. 발효물 제조를 위한 유산균의 분리 및 동정
3-1. 균주의 분리
향장, 식품용 유효 균주를 이용한 발효물 제조를 위해, 항균활성과 효소활성 등의 기능을 가지는 유산균 균주인 락토바실러스 플란터룸(L. plantarum, Lp) 및 웨이셀라 파라메센테로이드(W. paramesenteroides, Wp)를 각각 해양심층수와 발효 톱밥에서 분리 및 동정하여 이용하였다.
락토바실러스 플란터룸(L. plantarum)은 해양심층수로부터 분리하였다. 상기 해양심층수는 2015년 11월부터 12월까지 울릉도 태하, 저동 및 현포에서 표층으로부터 수심 200m의 바닷물을 취수하여 냉장 상태로 운반하였다. 상기 해양심층수를 0.1%(v/v) BCP가 첨가된 MRS agar 배지에 도말하여 37℃에서 1일간 배양하였다. 이후 BCP와의 반응에 의해 형성된 노란색 콜로니의 선별을 반복하여 단일 종을 분리하였다.
웨이셀라 파라메센테로이드 균주는 식용 곤충의 먹이인 발효 톱밥에서 분리 및 동정되었다. 상기 식용 곤충의 먹이용 발효 톱밥은 영천곤충산업(대한민국)으로부터 구입하였다. 25℃에서 저장된 발효 톱밥을 PBS에 1%(w/v) 농도로 첨가 후 볼텍스하여 혼합하였다. 상기 발효톱밥 혼합액을 0.1%(v/v) BCP(Bromocresol purple, Sigma, USA)가 첨가된 MRS (Difco, USA) agar 배지에 도말 후 37℃에서 1일간 배양되었다. 상기 BCP는 유산균의 젖산에 의해 산성화되어 노란색 콜로니가 형성되도록 하는 기능을 수행한다. BCP와의 반응에 의해 형성된 노란색 콜로니만을 선별하여 MRS agar 배지에 도말하여 재선별하는 과정을 반복하여 단일 종 총 2종을 분리하였다.
상기 분리된 3종의 균주는 MRS 액체 배지에서 배양하여 50%(v/v) 글리세롤을 혼합하여 최종 글리세롤 농도가 25%가 되도록 한 후, -70℃에서 보관하였다.
3-2. 균주의 동정
상기 실시예 3-2에서 분리된 균주는 16S rRNA의 염기서열 분석을 이용하여 동정되었다. 3종의 균주를 동정하기 위해, 우선 mini genomic DNA extraction kit(Promega)를 이용하여 각 균주의 유전체 DNA(genomic DNA)를 분리하였다.
상기 분리된 유전체 DNA를 주형으로, 하기의 27F 및 1492R 프라이머 세트 및 AccPower PCR premix kit(Bioneer, Korea)를 이용하여 TaKaRa PCR Thermal Cycler(Japan)으로 상기 균주 2종의 16S rRNA 유전자 부위를 증폭하였다.
27F 프라이머 (서열번호 1): 5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3'
1492R 프라이머 (서열번호 2): 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
상기 PCR 산물은 PCR clean-up Gel extraction(Macherey Nagel, USA)로 정제하여 ABI3730 DNA analyzer(Applied Bioxyxtems, USA)로 유전자 서열을 분석하였다. 본 발명에서 분리된 락토바실러스 플란터룸 균주의 16S rRNA 서열은 서열번호 3에, 웨이셀라 파라메센테로이드 균주 2종의 16S rRNA 서열은 서열번호 4 내지 5에 나타내었다.
상기 분리된 락토바실러스 플란터룸 균주와 웨이셀라 파라메센테로이드 균주의 16s rRNA 서열정보를 이용하여 16S rRNA 서열 유사도 분석을 수행하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 해양심층수로부터 분리된 유산균은 16S rRNA 분석 결과 락토바실러스 플란터룸과 99%의 서열 유사도를 나타내었고, 발효톱밥으로부터 분리된 유산균은 웨이셀라 파라메센테로이드와 99%의 서열 유사도를 보여, 각각 락토바실러스 플란터룸 및 웨이셀라파라메센테로이드로 명명하였다.
번호 유산균 유래 분리 균주 근접종 16S rRNA sequence identity
1 해양심층수 Lactobacillus plantarum DSW#2-4(서열번호 3의 16S rRNA) Lactobacillus plantarum MK311261.1
(서열번호 6)		 99%
2 발효톱밥 Weissella paramesenteroides D12
(서열번호 4의 16S rRNA)		 Weissella paramesenteroides AB598954.1
(서열번호 7)		 99%
3 발효톱밥 Weissella paramesenteroides D20(서열번호 5의 16S rRNA) Weissella paramesenteroides LC094432.1
(서열번호 8)		 99%
상기 분리된 락토바실러스 플란터룸 균주는 한국미생물보존센터(KCCM)에 2018년 8월 10일자로 기탁되었으며, 수탁번호는 KCCM12299P이다. 상기 웨이셀라 파라메센테로이드 균주는 2종 모두 2018년 8월 10일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁되었으며, 각각 Weissella paramesenteroides D12은 수탁 번호 KCCM12300P 및 Weissella paramesenteroides D20는 KCCM12301P을 받았다.
실시예 4. 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물 제조의 최적조건 확인
흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 제조에 있어, 유산균 발효를 효과적으로 일어나게 할 수 있는 최적조건의 탄소원 첨가 필요 여부 및 최적 배양시간을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
먼저 3종류의 배지를 준비하였다. 상기 3가지 배지는 실시예 2에서 제조한 흰점박이꽃무지 열수추출물(HePb) 1L 배지, HePb 1L와 2%(w/v) 덱스트로스를 (D-glucose, Sigma, USA)를 80mL 혼합한 배지, 및 일반적으로 사용되는 유산균배지인 MRS 배지이다. 상기 3종의 배지에 세 종류의 유산균 L.plantarum (KCCM12299P), W.paramesenteroides (KCCM12300P), W.paramesenteroides (KCCM12301P)을 각각 1x108 cfu/ml 농도로 1mL씩 접종하고 30 ℃에서 24시간 또는 48시간동안 배양하였다. 24시간 및 48시간 후의 LAB Counts(log cfu/ml)를 측정하여 최적 발효물 배양 조건을 확인하였으며, 측정결과를 도 1 및 하기 표 2에 나타냈다.
배양 조건 배양 시간별 LAB Counts
(log cfu/ml)
배양배지 균주 24h 배양 48h 배양
열수추출물(HePb) L. plantarum KCCM12299P 8.0x103 6.10x102
W. paramesenteroides KCCM12300P 3.21x102 1.01x10
W. paramesenteroides KCCM12301P 3.21x102 2.01x10
HePb + 덱스트로스 L. plantarum KCCM12299P 2.7x1011 1.01x109
W. paramesenteroides KCCM12300P 5.7x109 7.0x108
W. paramesenteroides KCCM12301P 3.17x108 2.7x107
MRS L. plantarum KCCM12299P 6.26x109 1.27x107
W. paramesenteroides KCCM12300P 3.0x108 6.0x107
W. paramesenteroides KCCM12301P 1.11x109 1.91x102
상기 LAB Counts는 각 액체 배지에 아가로스 (BD Difco, USA)를 첨가하여 제작한 고체 배지에 배양물을 1%(v/v)로 희석하여 1 ml을 LAB 플레이트에 도말 후 30℃에서 24시간 배양하여 형성된 콜로니의 수를 측정하여 수행하였다.
도 1에서 확인 가능한 바와 같이, MRS 배지에 L.plantarum을 접종한 경우, 24시간동안 배양한 후 LAB Counts가 6.26x109/ml(6.26E+09)로 측정되었으나, W paramesenteroides KCCM12301P의 경우 4.53x108/ml (4.53E+08)로 측정되었으며, 48시간 동안 배양한 경우 유산균 증폭수가 크게 감소함을 알 수 있었다. 덱스트로스를 포함하지 않는 HePb 배지에 L. plantarum 을 접종하고 24시간동안 배양한 배양물의 유산균 수는 8.0x103/ml (8.0E+03)에 불과했으며, W. paramesenteroides를 접종한 경우에도 기탁번호 KCCM12300P 및 KCCM12301P 균주 모두 유산균 수가 3.21x102/ml (3.21E+02) 정도의 증식에 그쳤다.
반면, 덱스토스와 HePb 를 포함하는 배지에 L. plantarum 을 접종하고 24시간동안 배양한 배양물의 유산균 수는 2.7x1011/ml(2.7E+11)로 증식이 활발히 일어났으며, 48시간 동안 배양 후에는 1.3x1010(1.30E+10)로 나타났다.
따라서, 덱스트로스와 흰점박이꽃무지 추출물을 포함하는 배지가 덱스트로스를 첨가하지 않은 배지보다, 유산균의 생장을 현저히 증가시킴을 확인할 수 있었다. 또한, 모든 배지조건에서 L.plantarum 또는 W. paramesenteroides를 접종하고 48시간이 지나면 유산균의 수가 감소하였는바, 유산균 접종 후 30℃에서 24시간 동안 발효 배양하는 것이 적절함을 확인할 수 있었다.
따라서 이후 실험에는 흰색점박이꽃무지 열수추출물에 덱스트로스를 첨가하여 유산균을 접종 후 30℃에서 24시간 동안 발효 배양하여 발효물을 제조하였다.
실시예 5. 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 발효물 제조
실시예 2에서 제조한 흰점박이꽃무지 열수추출물 또는 주정추출물에 덱스트로스를 혼합하여 배지를 제조한 다음, 유산균을 접종하고 배양하여 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물을 제조하였다.
실시예 2에서 제조한 흰점박이꽃무지 열수추출물 1L (pH6.5~7.5)에 2%(w/v) 덱스트로스(D-glucose, Sigma, USA)를 80mL(열수추출물 무게의 약 8%)를 처리하여, 유산균 배양용 배지를 제조하였다. 제조한 배지에 1x108 cfu/ml 실시예 3-2에서 분리 및 동정된 유산균 1mL를 각각 접종하고 30 ℃에서 24시간 동안 배양하여 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물을 제조하였다.
상기 제조된 발효물은, 흰점박이꽃무지의 용매 추출물과 마찬가지의 방법으로 분말화되어 보관되었으며, 이후 실험에서 필요에 따라 물에 녹여 사용하였다.
접종한 유산균의 종류와 기탁번호, 및 유산균을 접종하여 제조한 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물을 아래 표 3에 나타냈다. 구체적으로, 대조시료 1은 흰점박이꽃무지 분말(Pb), 대조시료 2는 흰점박이꽃무지 열수추출물(HePb) 분말, 시료 1은 L. plantarum 을 접종한 흰점박이꽃무지 열수추출물의 발효물 분말(HePbLp), 시료 2는 W. paramesenteroides KCCM12300P 을 접종한 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물 분말(HePbWp0), 시료 3은 W. paramesenteroides KCCM 12301P을 접종한 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물 분말(HePbWp1), 및 시료 4는 L. plantarum 및 W. paramesenteroides 혼합균주를 접종한 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물 분말(HePbLp/Wp1)을 나타냈다.
구분 명명 유산균 종류
대조시료1 Pb 비발효
대조시료2 HePb 비발효
시료1 HePbLp 락토바실러스 플란터룸 KCCM12299P (Lactobacillus plantarum)
시료2 HePbWp0 웨이셀라 파라메센테로이드 KCCM12300P(Weissella paramesenteroides KCCM12300P)
시료3 HePbWp1 웨이셀라 파라메센테로이드 KCCM12301P(Weissella paramesenteroides KCCM12301P)
시료4 HePbLp/Wp1 락토바실러스 플란터룸및 웨이셀라 파라메센테로이드 KCCM12301P
실시예 6. 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 미생물 보관 안정성 분석
6-1. 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 미생물 보관 안정성 확인
본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물 또는 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물이 유해 미생물의 성장을 억제하고 미생물에 대한 보관안정성을 갖는지를 확인하기 위하여, 각 발효물을 일정 기간동안 보관 후 위생지표세균과 특정 식중독균이 존재하는지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다.
상기 표 3의 대조시료 1 및 2와, 시료 1 및 시료 3을 각각 4℃에서 6개월 동안 보관한 후, 0.01g/ml가 되도록 물에 희석하여 1%(w/v)의 균질용액 시료를 제조하였다. 제조한 각각의 시료 1mL를 리스테리아(Environmental Listeria), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus), 효모(yeast) 및 곰팡이(Fungi), 대장균(Escherichia coli, E.coli) 측정용 petrifilmTM(3M, USA)에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 리스테리아, 황색포도상구균, 효모 및 곰팡이, 및 대장균이 검출되는지를 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 시료 1의 HePbLp와 시료 3의 HePbWp1에서는 4℃에서 6개월 동안 보관한 후에도 리스테리아, 포도상구균, 효모 및 곰팡이, 및 대장균이 검출되지 않았으며, 시료1의 HePbLp, 시료 3의 HePbWp1이 이들 세균의 증식을 억제하고 보관안정성을 가짐을 확인하였다. 반면, 대조시료2(HePb)에서는 황색포도상구균이 검출되었으며, 대조군인 대조시료 1(Pb)에서는 리스테리아, 포도상구균, 효모 및 곰팡이, 및 대장균 모두가 검출되었다. 따라서, 흰점박이꽃무지 분말 또는 흰점박이꽃무지 추출물과 비교해, 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 미생물의 성장 억제능, 및 미생물에 대한 보관 안정성이 우수함을 확인할 수 있었다.
6-2. 흰점박이꽃무지 분말의 저장온도에 따른 미생물 수 측정
흰점박이꽃무지 분말(Pb)의 미생물에 대한 보관 안정성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 흰점박이꽃무지 분말을 -20℃ 또는 28℃ 온도 조건에서 6개월 동안 보관한 후, 0.01g/ml가 되도록 물에 희석하여 1%(w/v)의 균질용액 시료를 제조하였다. 상기 시료 1mL를 리스테리아(Environmental Listeria), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus), 효모(yeast) 및 곰팡이(Fungi), 대장균(Escherichia coli, E.coli) 측정용 petrifilmTM(3M, USA)에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 형성된 콜로니의 개수를 확인하였다. 전형적인 집락을 보이는 균주는 균주 X 희석배수로 계산하였으며, 그 결과를 아래 표 4에 나타냈다.
저장온도 리스테리아 황색포도상구균 대장균 효모 및 곰팡이 기타
-20℃ 0 0 0 0 2
28℃ 3 X 106 1.05 X 108 ∞ 0 ∞
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 흰점박이꽃무지 분말(Pb)의 경우, -20℃에서는 미생물이 거의 증식되지 않았으나 28℃에서는 리스테리아, 황색포도상구균, 대장균, 효모 및 곰팡이, 및 기타 미생물 등의 현저히 많이 검출되었다. 따라서, 흰점박이꽃무지 분말은 28℃ 에서 미생물에 대한 보관안정성이 취약함을 확인할 수 있었다.
실시예 7. 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 항균효과 확인
7-1. 항균활성 확인
본 발명의 흰점박이꽃무지 열수추출물 또는 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 항균활성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
항균효과를 확인하기 위한 시험균주인 리스테리아(Listeria monocytogenes, L. monocytogenes, ATCC 15313), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus, ATCC 12600), 대장균(Escherichia coli, E. coli, ATCC 11775), 바실러스(Bacillus megaterium, B. megaterium, ATCC 14579), 비브리오(Vibrio parahaemolyticus, V. parahaemolyticus, ATCC 17802), 및 형광균(Pseudomonas flurorescens, P. flurorescens, ATCC 13525)을 준비하였다. 각각의 시험균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 전배양(pre-culture)하였다. 이어서, 페트리디쉬에 1%(w/v)의 LB agar를 20mL씩 분주하고 응고하여 평판배지를 제조한 후, 앞서 전배양한 시험균주 각각을 200 μL씩 첨가하고 멸균된 유리봉으로 배지 위에 고르게 도포한 후, 30분동안 건조시켰다. 건조된 배지위에 페이퍼 디스크(8 mm, Toyo Roshi Kaicha Ltd, Japan)를 올렸다.
표 3의 대조시료 2(HePb)와 시료4(HePbLp/Wp1)의 분말을 각각 0.01g/ml가 되도록 물에 희석하여 1%(w/v)의 균질용액 시료를 제조한 후, 각각의 1%(w/v) 균질용액 시료 30 μL씩을 앞서 준비한 페이퍼 디스크에 주입하였다. 주입 후 37℃에서 24시간 동안 배양하고 페이퍼 디스크 주변의 억제환(inhibition clear zone)의 직경을 측정하여 항균성을 분석하였다. 대조군으로, 시험균주가 포함된 배지에 페이퍼 디스크를 올리고 L. plantarum, 또는 W. paramesenteroides KCCM12301P 균주를 30 μL씩 주입한 배지를 사용해 항균성을 분석하였다. 항균성 분석 결과를 도 3에 나타냈다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군인 L. plantarum, 또는 W. paramesenteroides KCCM12301P 균주를 접종한 경우, 균주 자체의 항균효과로 인해 페이퍼 디스크 주변으로 시험균주가 자라지 못해 원형의 환이 생성되었으나, 본 발명의 시료 4(HePbLp/Wp1)의 경우, 대조군과 유사한 직경의 환이 생성되었다. 따라서, 본 발명이 제공하는 발효물의 시험균주에 대한 항균 효과가 우수함을 확인할 수 있었다. 반면, 대조시료 2인 HePb 시료를 처리한 경우, 페이퍼디스크주변으로 원형의 환이 거의 생성되지 않았다.
따라서, 흰점박이꽃무지의 열수추출물은 항균활성이 거의 없으나, 본 발명의 흰점박이꽃무지의 추출물의 발효물의 경우, 유산균 접종 후 발효단계를 거침으로써, 유산균자체의 항균성이 유지되며 리스테리아, 황색포도상구균, 대장균, 바실러스, 비브리오, 및 슈도모나스 균에 대한 항균 활성이 존재함을 확인할 수 있었다.
7-2. 여드름균 및 비듬균에 대한 항균활성 확인
실시예 7-1과 실질적으로 동일한 실험 방법으로, 상기 표 3의 시료 1 (HePbLp) 및 시료 3(HePbWp1), 및 대조시료 2의 열수추출물(HePb)의 여드름균 (Propionibacterium acnes, ATCC 6919), 및 비듬균(Malassezia furfur, ATCC 14521)에 대한 항균활성을 확인하였으며, 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타난 바와 같이, 대조시료 2(HePb)는 여드름균 및 비듬균을 거의 사멸시키지 못해 페이퍼디스크 주변으로 둥근 억제환이 거의 생성되지 않았으나, 시료 1의 HePbLp, 시료 3의 HePbWp1은 페이퍼디스크 주변으로 대조군과 유사한 직경의 둥근 환을 생성하였다.
따라서, 본 발명의 흰점박이꽃무지의 추출물의 발효물의 경우, 유산균 접종 후 발효단계를 거침으로써, 여드름균과 비듬균에 대해 우수한 항균효과를 가짐을 확인할 수 있었다. 이에, 본 발명의 흰점박이꽃무지의 추출물의 발효물은 여드름 및 비듬 개선 또는 치료용 물질로 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 8. 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 효소 활성 분석
본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물 또는 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 단백질, 지방, 탄수화물, 및 셀룰로스의 분해능력을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
먼저 효소 활성을 시험하기 위한 기질로서, MRS배지에 1%(w/v) 스킴밀크(MB cell), 트리브틸린(trybutyrin, MB cell), 0.2%(w/v) 전분(starch, MB cell), 0.2%(w/v) 메틸셀룰로오스(methylcellulose, Sigma)을 각각 첨가한 플레이트를 준비하였다.
다음으로, 표 3의 대조시료 2(HePb) 또는 시료 4(HePbLp/Wp1)의 분말을 각각 0.01g/ml가 되도록 물에 희석하여 1%(w/v)의 균질용액 시료를 제조한 후, 각각의 1%(w/v) 균질용액 시료 100μl를 상기 플레이트의 paper disc에 넣고 30℃에서 24시간동안 배양하였다. 대조군으로 L. plantarum, 또는 W. paramesenteroides KCCM12301P균주를 상기 제조된 기질 플레이트에 접종하고 동일한 조건에서 배양하였다.
각각의 실험 플레이트에서 스킴밀크, 트리브틸린, 전분, 메틸셀룰로오스가 분해되는지를 관찰하였으며, 그 결과를 도 5에 나타냈다. 아밀라아제와 셀룰라아제의 생성여부는 배양후 0.2 %(w/v)의 Congo Red로 염색하여 관찰하였다. 스킴밀크가 분해될 경우 프로테아제가 형성된 것이며, 트리브틸린이 분해될 경우 리파아제가 형성된 것이고, 전분이 분해될 경우 아밀라아제가 형성된 것이며, 셀룰로스가 분해될 경우 셀룰라아제가 형성된 것이다. 도 5에 효소 생성여부 측정 결과를 나타냈다.
도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군인 락토바실러스(KCCM12299P), 웨이셀라(KCCM12301P) 균주 자체를 접종할 경우, 프로테아제, 리파아제, 아밀라아제, 셀룰라아제 효소가 모두 생성되었으며, 본 발명의 시료 4(HePbLp/Wp1)에서도 상기 4가지 효소가 모두 생성됨을 확인할 수 있었다. 그러나 대조시료 2(HePb)에서는 효소의 기질 분해 활성이 나타나지 않았다.
따라서, 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물은 프로테아제, 리파아제, 아밀라아제 및 셀룰라아제를 모두 포함하며, 단백질, 탄수화물 및 지방 성분을 분해하여 저분자화할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물은 분자가 큰 물질을 크기가 작은 분자로 분해함으로써 각 성분의 체내 흡수 효율을 향상시킬 수 있다.
실시예 9. 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 보관온도에 따른 생균수 확인
본 발명의 실시예 5에서 제조한 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물 내에서 유산균의 기능성이 유지될 수 있는 정도로 유산균의 생균수가 유지되는, 최적의 보관온도를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
상기 표 3의 대조시료 2(HePb), 시료 1(HePbLp), 시료 3(HePbWp1), 시료4(HePbLp/Wp1) 각각을 4℃(냉장온도) 또는 30℃ 에서 총 30일간 보관하였다. 대조군으로 실시예 5의 방법으로 제조한 직후의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물 분말의 유산균 수를 측정하였다.
다음으로, 각 온도에서 보관한 날로부터 1일, 7일, 15일, 30일 째의 분말을 채취해 10mg/ml가 되도록 물에 희석하여 0.1%(w/v) 시료용액을 제조하였다. 제조한 0.1%(w/v) 시료를 MRS배지(BCP 포함)에 스프레딩한 후, 37℃에서 24시간동안 배양하고 생균수(LAB counts)를 측정했으며, 그 결과를 하기 표 5 및 도 6에 나타냈다.
Figure 112019057540959-pat00001
도 6에 나타낸 바와 같이, 4℃ 저장온도에서 가장 적은 생균수를 나타낸 것은 보관일로부터 1일이 경과한 시료 4 (HePb/Wp1) 분말이였으며, 생균수는 1.93 x1011 (log cfu/ml) 이였다. 가장 많은 생균수를 나타낸 것은 보관일로부터 30일이 경과한 시료 4 (HePbLp/Wp1) 분말이였으며, 4.93 x 1011 의 생균수가 측정되었다. 4℃에서는 보관 후 30일이 지날 동안 생균수가 크게 감소되지 않으며 비교적 유사하게 생균수가 유지됨을 확인할 수 있었다. 30℃에서 각 시료분말을 보관한 경우, 보관 7일 후 모든 분말에서 생균수가 감소하였으며, 30일이 경과한 후에는 시료 1(HePbLp)는 240개, 시료 3(HePbWp1)은 0개, 시료 4(HePbLp/Wp1)의 경우는 260개로 생균수가 현저히 감소하였다.
따라서, 본 발명의 흰꽃점박이꽃무지 추출물의 발효물의 유산균의 기능성이 유지되기 위해서는 일정 생균수가 유지되어야 하며, 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물 또는 이의 분말은 4℃ 또는 그 이하의 온도에서 보관하는 것이 적절함을 확인하였다.
실시예 10. 보관 조건에 따른 항산화 활성 확인
본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 보관온도 및 보관기간에 따른 항산화 효과를 확인하기 위해 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 이용하여 자유라디칼 소거 활성 분석을 수행하였다.
표 3의 대조시료 1(Pb), 대조시료 2 (HePb), 시료 1 (HePbLp), 시료 3 (HePbWp1), 및 시료 4 (HePbLp/Wp1) 각각을 보관온도 3℃(냉장온도) 또는 30℃ 에서 30일간 보관하였다.
각 온도에서 보관한 날로부터 1일 및 30일 후의 분말을 채취해 10mg/ml 농도로 멸균수 1mL에 희석하여 0.1%(w/v) 시료용액을 조제하였다. 저장(Stock) 용액(100mM Tri-HCl, Ph 7.4)은 메탄올 1mM에 DPPH를 용해하여 제조하였으며, 분석 실험에서는 100 μM 농도로 희석해 사용하였다.
이어서, 96 웰 플레이트에 앞서 제조한 0.1%(w/v) 농도의 각각의 시료용액을 10μL씩 분주하고, 시간경과에 따른 항산화 효과의 변화를 DPPH 억제율(%)로 측정하였다. 대조군으로 아스코르브산(vit C), 및 BHT(butyl hidroxytoluene)를 사용하였다.
항산화 효과는 상기 웰 플레이트에 100 μM DPPH를 100 μL씩 첨가하고 차광한 후에 실온에서 10-30 분간 방치한 다음에, 517 nm 파장의 빛을 조사해 흡광도를 측정하여 확인하였다. 음성 대조군으로 메탄올 또는 물에 100 uL DPPH를 처리하여 흡광도를 측정하여 영점 처리를 수행하였다. 상기 흡광도를 측정한 후 하기 수학식 1으로 DPPH 억제율을 계산하였으며, 실험결과를 도 7에 나타냈다. 측정한 DPPH 억제율(%)을 도 7 및 하기 표 6에 나타냈다.
[수학식 1]
DPPH 억제율(scavenging activity, %) = (1-OD sample/OD blind) x 100
상기 수학식 1에서, OD smaple은 각 시료의 흡광도를, OD blind는 어떤 시료도 첨가하지 않은 DPPH 용액의 흡광도를 의미한다.
시료 보관 조건 DPPH 억제율 (%)
대조시료 1 (Pb) 4℃, 1일 42
4℃, 30일 36
30℃, 1일 36
30℃, 30일 27
대조시료 2 (HePb) 4℃, 1일 50.6
4℃, 30일 48.04
30℃, 1일 50.12
30℃, 30일 55.4
시료 1 (HePbLp) 4℃, 1일 34.7
4℃, 30일 37.2
30℃, 1일 33.2
30℃, 30일 42.5
시료 3 (HePbWp1) 4℃, 1일 44.6
4℃, 30일 43.9
30℃, 1일 43.3
30℃, 30일 42.3
시료 4 (HePbLp/Wp1) 4℃, 1일 41.4
4℃, 30일 41.7
30℃, 1일 41.7
30℃, 30일 43.1
대조군(VitC) 없음 95.1
대조군(BHT) 없음 91.8
도 7에 나타낸 바와 같이, 흰점박이꽃무지 분말의 경우, 4℃ 조건에서 보관일로부터 1일 후에 측정한 DPPH 억제율은 42%였으나, 30일이 지난 후 36%로 DPPH 억제율이 감소했다. 30℃ 조건에서는 1일 후에 측정한 DPPH 억제율이 36% 였으나, 30일 후 27%로 감소하였다. 대조시료 (HePb)의 경우 4℃ 조건에서 1일 후에 측정한 DPPH 억제율은 50.6% 였으나, 30일 후 48.04%로 약간 감소하였으며, 30℃에서 보관일로부터 1일 후의 DPPH 억제율은 50.12% 였으나 30일 후에는 55.4%로 약간 증가하였다. 시료 1(HePbLp), 시료 3(HePbWp1), 및 시료 4(HePbLp/Wp1)은 4 ℃에서 보관일로부터 1일 후에 측정한 DPPH 억제율은 각각 34.7%, 44.6%, 41.4%이었으며 30일 경과 후에는 각각 37.2%, 43.9%, 41.7%정도로 약간 증가됨을 확인하였다. 30℃ 조건에서는 보관일로부터 1일 후의 DPPH 억제율은 각각 33.2%, 43.3%, 41.7%이었으나, 30일 경과 후에는 각각 42.5%, 42.3%, 43.1 %정도로 DPPH 억제율이 상승됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물은, 흰점박이꽃무지 분말과 비교해 보관온도에 상관없이, 보관 후 30일이 경과되어도 항산화 효과가 감소되지 않고 오히려 증가됨을 확인하였다.
실시예 11. 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 지방 산패 억제 효과 확인
흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 지방산패 억제 효능을 확인하기 위해, TBA를 이용해 유지의 산화과정 중 처음 생성되는 malodialdehyde(MDA) 값을 측정하였다. TBA는 유지의 산화과정 중 최초로 생성되는 malodialdehyde(MDA) 와 반응하여 적색 색소를 형성한다. MDA는 지질 산화과정의 중간 산물인 다가 불포화지방산이 유리 라디칼에 의해 산화 분해될 때 생성되므로 유지의 산패 정도를 알 수 있다.
상기 표 3의 대조시료 1 (Pb), 대조시료 2(HePb), 시료 1 (HePbLp), 시료 3 (HePbWp1), 및 시료 4 (HePbLp/Wp1)의 분말을 각각 보관온도 3℃(냉장온도) 또는 30℃ 에서 30일간 보관하였다. 각 온도에서 보관한 날로부터 1일, 30일 후의 분말을 채취해 10mg/ml의 농도로 멸균수 1mL에 희석하여 0.1%(w/v) 시료 용액을 조제하였다.
이어서, 각각의 시료용액에 벤젠(benzene), 0.7%(v/v) TBA 용액, 및 아세트산(acetic acid)을 1ml씩 혼합하여 TBA용액 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물을 혼합교반한 후, 생성된 아래층을 회수하였으며, 회수한 아래층을 95℃에서 10분간 방치한 후 분광광도계에서 530 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때 시료대신 증류수를 시료와 동량으로 가하여 대조군으로 사용하였다. 이어서, 저장온도를 30℃로 바꾸어 동일한 실험을 수행하였으며, malodialdehyde(MDA)(nmol/μg) 측정결과를 도 8 및 표 7에 나타냈다.
시료 보관 조건 MDA (nmol/ug)
대조시료 1 (Pb) 4℃, 1일 238.8
4℃, 30일 222.4
30℃, 1일 212.6
30℃, 30일 239.6
대조시료 2 (HePb) 4℃, 1일 233.5
4℃, 30일 236.9
30℃, 1일 194.8
30℃, 30일 208.3
시료 1 (HePbLp) 4℃, 1일 196.8
4℃, 30일 195.6
30℃, 1일 201.4
30℃, 30일 204,1
시료 3 (HePbWp1) 4℃, 1일 184.4
4℃, 30일 179.3
30℃, 1일 198.7
30℃, 30일 190.8
시료 4 (HePbLp/Wp1) 4℃, 1일 196.0
4℃, 30일 191.9
30℃, 1일 194.4
30℃, 30일 196.4
대조군(증류수) 없음 0
도 8에 따르면, 대조시료 2(HePb)의 경우 4 ℃와 30℃ 온도조건 모두에서 보관일로부터 1일 후보다 30일 후에 MDA가 높게 측정된 반면, 시료 1(HePbLp), 시료 3, (HePbWp1), 및 시료 4(HePbLp/Wp1)의 경우 4 ℃와 30℃ 온도조건 모두에서 1일 후와 30일 후의 malodialdehyde(MDA)의 수치가 비슷한 수준으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물은 유산균 발효과정을 통해 흰점박이꽃무지의 지방의 산패를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 12. 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 세포주 독성 실험
12-1. 저장온도에 따른 비만세포 에서의 세포주 독성실험
사람 비만세포 3T3-L1(ATCC CRL-3242)에서 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 온도 및 보관일에 따른 세포주 독성 실험을 수행하였다.
3T3-L1 cell의 세포주 독성은 Cell counting kit-8(CCK-8, Dojindo)을 이용하여 측정하였다. 실험에 사용할 3T3-L1 cell 세포주를 제조하기 위해, 3T3-L1 cell 세포주를 10 % fetal bovine serum(FBS), 1%(w/v) Penicillin-streptomycin이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지에서 37℃, 5% CO2 배양조건에서 배양하여 이후 실험에서 사용하였다.
3T3-L1 cell 세포에 대조시료 1(Pb), 대조시료 2(HePb)과 시료 1(HePbLp), 시료 3(HePbWp1), 및 시료 4(HePbLp/Wp1) 각각을 4 ℃ 또는 30℃ 조건에서 30일간 보관하여, 보관일로부터 1일 후에 채취한 시료, 30일 후에 채취한 시료 각각을 1mg/ml씩 3T3-L1 cell 세포에 첨가한 후, Cell viability(% of control)을 측정하였으며 측정결과를 도 9 및 표 8에 나타냈다. 세포 생존율은 대조군의 세포 생존율을 100%로 두어 상대값을 표시하였으며, 대조군(Control)으로는 새로운 DMEM 배지를 3T3-L1 세포에 첨가하여 이용하였다.
시료 보관 조건 세포 생존율 (%)
대조시료 1 (Pb) 4℃, 1일 100.2
4℃, 30일 101.2
30℃, 1일 103.9
30℃, 30일 128.2
대조시료 2 (HePb) 4℃, 1일 96.4
4℃, 30일 99.8
30℃, 1일 98.9
30℃, 30일 122.4
시료 1 (HePbLp) 4℃, 1일 104.7
4℃, 30일 97.9
30℃, 1일 100.2
30℃, 30일 117.1
시료 3 (HePbWp1) 4℃, 1일 123.7
4℃, 30일 117.7
30℃, 1일 130.8
30℃, 30일 132.4
시료 4 (HePbLp/Wp1) 4℃, 1일 140.8
4℃, 30일 124.0
30℃, 1일 128.9
30℃, 30일 135.6
대조군 (DMEM 배지) 없음 100.0
도 9에 나타낸 바와 같이, 각 시료를 처리한 3T3L1 세포는 4℃ 또는 30 ℃ 온도조건 모두에서 보관일로부터 30일 후에도 세포수가 대조군 대비 100% 정도를 유지되거나 소폭으로 세포가 증식됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물은 저장온도에 상관없이 사람의 비만세포주인 3T3-L1 세포주에 있어 독성이 낮고 안전함을 확인할 수 있었다.
12-2. Raw264.7 cell 에서 세포주 독성실험
마우스 세포주인 Raw264.7 cell(ATCC TIB-71)에서 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 독성 실험을 수행하였다.
Raw264.7 cell의 세포주 독성은 Cell counting kit-8(CCK-8, Dojindo)을 이용하여 측정하였다. 실험에 사용할 Raw264.7 cell 세포주를 제조하기 위해, Raw264.7 cell 세포주를 10 % fetal bovine serum(FBS), 1%(w/v) Penicillin-streptomycin이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한 후, 이후 실험에 사용하였다.
Raw264.7 세포에 대조시료 1(Pb), 대조시료 2 (HePb)과 시료 1 및 3(HePbLp 및 HePbWp1), 및 시료 4(HePbLp/Wp1) 각각을 4 ℃, 30℃? 조건에서 30일간 보관하였으며, 보관일로부터 1일 후에 채취한 시료, 30일 후에 채취한 시료 각각을 1mg/ml씩 배양된 쥐의 대식세포주인 Raw264.7 세포에 첨가한 후, Cell viability(% of control)를 측정하였으며 측정결과를 도 10 및 표 9에 나타냈다. 대조군(Control)으로는 새로운 DMEM 배지를 첨가한 세포를 사용하여, 대조군에서의 Cell viability(%)를 100%로 두고 각 시료의 Cell viability를 계산하였다.
시료 보관 조건 세포 생존율 (%)
대조시료 1 (Pb) 4℃, 1일 105.7
4℃, 30일 100.2
30℃, 1일 103.1
30℃, 30일 111.2
대조시료 2 (HePb) 4℃, 1일 104.5
4℃, 30일 103.1
30℃, 1일 105.3
30℃, 30일 110.3
시료 1 (HePbLp) 4℃, 1일 101.8
4℃, 30일 105.9
30℃, 1일 105.3
30℃, 30일 114.8
시료 3 (HePbWp1) 4℃, 1일 103.8
4℃, 30일 100.9
30℃, 1일 101.4
30℃, 30일 110.4
시료 4 (HePbLp/Wp1) 4℃, 1일 105.1
4℃, 30일 102.2
30℃, 1일 100.4
30℃, 30일 112.2
대조군 (DMEM 배지) 없음 100.0
도 10에 나타낸 바와 같이, 각 시료를 처리한 Raw264.7세포는 4℃ 또는 30 ℃ 온도조건 모두에서 보관일로부터 30일 후에도 세포수가 대조군 대비 100% 정도를 유지되거나 소폭으로 세포가 증식됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물은 저장온도에 상관없이 Raw264.7 세포주에 대해 독성이 낮고 안전함을 확인할 수 있었다.
실시예 12. 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 중금속 저감 효과 확인
표 3의 흰점박이꽃무지 분말(대조시료 1, Pb), 흰점박이꽃무지 열수 추출물(대조시료 2, HePb)과 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물(시료 1 (HePbLp), 및 시료 3(HePbWp1))의 중금속 저감 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
상기 표 3의 대조시료1(Pb), 대조시료2 (HePb), 시료 1 및 시료 2 (HePbLp, HePbWp0)를 각각 물에 용해하여 1 중량%의 용액을 제조한 후, 각각을 유도결합플라즈마 발광분광기에 주입하여, 비소와 카드뮴의 2개 원소에 대한 발광 강도를 측정하고 검량선의 회귀방정식에 대입하여 관심원소의 농도를 정량하였다. 유도 결합 플라즈마에서 검액 중 관심원소에 대한 농도가 정량 되면 시료 중 관심 원소의 농도는 다음 수학식 2에 따라 계산하였다.
[수학식 2]
시료 중 원소 농도 (ug/g) ={(검량선결과 ug/L x 최종량 ml x 희석배수) / 시료무게(g) x 1000} x 규격 (g)
식품공전 일반시험법에 준하여 비소(As)와 카드뮴(Cd)의 경우 물에 용해하여 1 %(w/w) 용액으로 제조하였으며, 질산으로 처리하고 유도결합플라즈마 발광분광기(Inductiviely Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry, ICP-MS, KHSI-A-158)로 성분 분석을 수행하였다(한국고분자시험연구소, KOPTRI). 유도 결합 플라즈마에서 검액 중 관심원소에 대한 농도가 정량 되면 시료 중 관심 원소의 농도는 다음 수학식 3에 따라 계산하였다.
[수학식 3]
시료 중 관심 원소 농도 (mg/kg) = 시험용액 농도(ug/kg) x 최종부피(ml)/시료채취량(g) x 희석배수 x 1/1000
수은의 경우는 위의 방법으로 준비된 시료를 Mercyry analyzer Hydra-C(KHSI-A-060) 으로 분석하였다. 분석기에서 검액 중 관심원소에 대한 농도가 정량 되면 시료 중 관심 원소의 농도는 다음 수학식 4에 따라 계산하였다.
[수학식 4]
시료 중 관심 원소의 농도(ng/g) = 검출량 (ng) / 시료채취량 (g)
크롬과 셀레늄의 경우는 시료 일정량을 마이크로웨이브(Microwave MARS CEM, KHSI-A-063)에 넣고 질산 등으로 처리하여 분해하고 플라스크에 옮겨 증류수를 넣어 용액으로 제조하여 유도결합플라즈마 발광분광기(Inductiviely Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry, ICP-MS agilent 7700, KHSI-A-059)로 성분분석을 수행하였다(한국고분자시험연구소, KOPTRI).
상기 방법에 따라 얻어진 5가지 중금속 분석 결과를 표 10에 나타냈다.
항 목 대조시료1
(Pb)		 대조시료2
(HePb)		 시료1
(HePbLp)		 시료3
(HePbWp0)
1 카드뮴(Cadimium, mg/kg) 0.1326 0.0583 0.0443 0.0475
2 수은(Mercury, mg/kg) 0.0236 0.0027 0.0021 0.0024
3 비소(Arsenic, mg/kg) 10.0192 0.2387 0.2102 0.1662
4 셀레늄(Selenium,ug/100g) 21.44 20.89 17.23 20.78
5 크롬(Chromium,ug/100g) 27.28 26.03 23.89 23.01
표 10에서 대조시료 1(Pb)은 카드뮴, 수은, 비소, 셀레늄, 크롬이 각 0.1326 mg/kg, 0.0236 mg/kg, 10.0192 mg/kg, 21.44 ug/100g, 27.28 ug/100g으로 측정되었으며, 식품의약처의 식품공전에 제시된 식용곤충의 중금속 기준값 카드뮴 0.05 mg/kg, 수은 0.5 mg/kg, 비소 0.1 mg/kg 보다 3배, 10배가 높게 타나났다. 대조시료 2(HePb)는 카드뮴, 수은, 비소, 셀레늄, 크롬이 각 0.0583 mg/kg, 0.0027 mg/kg, 0.2387 mg/kg, 20.89 ug/100g, 26.03 ug/100으로 약 2배 내지 10배로 감소되었으나, 셀레늄과 크롬은 크게 감소 되지 않았다.
시료 1 및 시료 2(HePbLp, HePbWp0)의 경우는 카드뮴(각 0.0443, 0.0475 mg/kg), 수은(각 0.0021,0.0024 mg/kg), 비소 (0.2102, 0.1662)로 대조시료 2(HePb) 보다 더 적은 양이 측정되었으며, 셀레늄과 크롬은 크게 감소 되지 않았다. 셀레늄은 영양 보조제로 사용되고 있고 항산화, 면역 강화, 모발과 눈의 건강 강화, 갑상선 기능향상, 심장 건강 향상 기능이 알려져 있으며 성인의 경우 55mg의 일일권장량으로 알려져 있다. 크롬은 당내성 인자로 인슐린 작용을 강화하며 단백질, 탄수화물, 지질 대사에 관여하는 필수 영양소로 에너지 생성에 관여, 혈당조절, 관상동맥질환 예방 등의 효과가 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물은 유산균발효로 인해 셀레늄과 크롬과 같은 유효성분의 함량은 유지하면서, 유해한 중금속 성분은 제거되는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 13. 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 멜라닌 색소 감소효과 확인
본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 멜라닌 색소 감소효능을 확인하기 위해, 마우스의 B16F10 세포에 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물을 처리하고 멜라닌(Melanin)의 함량을 정량 분석하였다.
실험에 사용할 세포를 준비하게 위해, 쥐의 B16F10세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양한 B16F10세포 3 x 105 cell 을 6 웰 플레이트에 분주하고 12 시간 동안 배양하였다.
이어서, 대조시료 1(Pb), 대조시료 2(HePb) 과 시료 4(HePbLp/Wp1) 각각을 4 ℃ 에서 30일간 보관하여, 보관일로부터 1일 째, 30일 째의 분말을 채취해, 1mg/ml씩 물에 용해하여, 0.1%의 시료용액을 제조하였다.
앞서 준비한, B16F10세포가 배양된 6웰 플레이트에 200nmol a-MSH(a-melanin sitmulating hormone, sigma)와 앞서 제조한 각각의 0.1%(w/v) 시료용액을 처리하고, 37℃의 인큐베이터에서 24시간동안 배양하였다. 대조군(Control)으로, 200nmol a-MSH만을 처리한 세포군(대조군, Control)을, 비교예로 200nmol a-MSH(a-melanin sitmulating hormone, sigma)와 알부틴(albutin 0.1%(w/v))을 같이 사용하였다. 배양을 완료한 세포를 수집하여 10% DMSO 가 첨가 된 1N NaOH 에서 용해시킨 후, 80℃에서 1시간 동안 배양하고 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. B16F10세포에 a-MSH만을 처리한 경우의 흡광도를 100%로 하여, 각 시료에서의 상대적인 흡광도를 나타낸 결과를 도 11 및 표 11에 나타냈다.
시료 조건 멜라닌 함량 (%)
대조군 무처리 100
대조시료 1 Pb, 4℃, 1일 보관 87.9
Pb, 4℃, 30일 보관 75.7
대조시료 2 HePb, 4℃, 1일 보관 77.3
HePb, 4℃, 30일 보관 77.8
시료 4 HePbLp/Wp1, 4℃, 1일 보관 64.5
HePbLp/Wp1, 4℃, 30일 보관 71.5
비교예 Albutin 68.7
도 11에 나타낸 바와 같이, 시료 4(HePbLp/Wp1)경우, 4 ℃조건에서 1일간 보관한 후 B16F10 세포의 멜라닌 함량이 약 70%로 감소하였다. 상기 결과는 비교예인 알부틴(albutin)보다도 멜라닌색소의 억제효과가 우수한 것으로, 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물의 우수한 미백효과를 확인할 수 있었다.
한국미생물보존센터 KCCM12299P 20180810 한국미생물보존센터 KCCM12300P 20190810 한국미생물보존센터 KCCM12301P 20190810
<110> Marine Industry Research institute for East sea <120> Fermented product of Protaetia brevitarsis extract, its preparation method and use <130> DPP20191806KR <150> KR 10-2018-0153921 <151> 2018-12-03 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cmtggctca 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1472 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus plantarum KCCM12299P 16SrRNA <400> 3 gaagcagtgg cgggtgctat acatgcagtc gaacgaactc tggtattgat tggtgcttgc 60 atcatgattt acatttgagt gagtggcgaa ctggtgagta acacgtggga aacctgccca 120 gaagcggggg ataacacctg gaaacagatg ctaataccgc ataacaactt ggaccgcatg 180 gtccgagctt gaaagatggc ttcggctatc acttttggat ggtcccgcgg cgtattagct 240 agatggtggg gtaacggctc accatggcaa tgatacgtag ccgacctgag agggtaatcg 300 gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360 cacaatggac 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Claims (21)

  1. 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물로서
    상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물은 흰점박이꽃무지 유충의 물 및 에탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 이용한 용매 추출물이며,
    상기 유산균 발효물은 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물에 탄소원 및 질소원으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 첨가하여 유산균을 배양한 것이며,
    상기 유산균은 웨이셀라 파라메센테로이드(Weissella paramesenteroides) (기탁번호 KCCM12300P) 및 웨이셀라 파라메센테로이드(Weissella paramesenteroides) (기탁번호 KCCM12301P)균으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유산균인 것인, 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 플란터룸(L. plantarum) (기탁번호 KCCM12299P)을 추가로 포함하는 것인, 발효물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 용매는 70 내지 100 %(v/v)의 에탄올 함량을 갖는 것인, 발효물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 탄소원은 덱스트로스(dextrose), 글루코스(glucose), 수크로스(sucluse), 락토스(lactose), 및 갈락토오스(galactose)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이거나, 상기 질소원은 소고기 추출물(beef extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 및 스킴밀크(skim milk)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 발효물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물의 중금속 함량이 흰점박이꽃무지의 추출 원료 내 중금속 함량 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 50 중량부이고,
    상기 중금속은 비소, 카드뮴 및 수은으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 중금속인, 발효물.
  6. 삭제
  7. 물 및 에탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 이용하여 흰점박이꽃무지 유충의 용매 추출물을 제조하는 단계; 및
    상기 용매 추출물을 포함하는 발효 원료에 탄소원 및 질소원으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 첨가하여 유산균을 접종하고 발효하는 단계를 포함하고
    상기 유산균은 웨이셀라 파라메센테로이드(Weissella paramesenteroides) (기탁번호 KCCM12300P) 및 웨이셀라 파라메센테로이드(Weissella paramesenteroides) (기탁번호 KCCM12301P)균으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유산균인 것인,
    흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서, 상기 용매 추출물의 제조에 있어서 추출온도는 30℃ 내지 90℃이며, 추출시간은 4 내지 6시간인, 제조방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) (기탁번호 KCCM12299P)을 추가로 포함하는 것인, 제조방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 탄소원은 덱스트로스(dextrose), 글루코스(glucose), 수크로스(sucluse), 락토스(lactose), 및 갈락토오스(galactose)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이거나, 상기 질소원은 소고기 추출물(beef extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 및 스킴밀크(skim milk)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 제조방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제7항에 있어서, 상기 발효하는 단계는 25 내지 45℃ 온도에서, 12시간 내지 48시간 동안 발효하는 것인, 제조방법.
  15. 제7항에 있어서, 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 1℃ 내지 10℃ 보관온도에서 1일 내지 90일 동안 보관하는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.
  16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), 및 말라세지아 퍼퍼 (Malassezia furfur)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 미생물에 대한 항균제 조성물.
  17. 삭제
  18. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 단백질, 지방, 탄수화물, 및 셀룰로스로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 영양성분의 분해제인, 영양성분의 분해제 조성물.
  19. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 항산화제 조성물.
  20. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
  21. 제16항에 있어서, 상기 항균제 조성물은 여드름 예방 및 개선 용도로 사용되는 화장료 조성물인, 항균제 조성물.
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Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Curr. Top. Lactic Acid Bac. Probio., Vol. 2, pp. 1-6 (2014.)*
Journal of Food Hygiene and Safety, Vol. 33, pp. 369-374 (2018.11.03.)
Journal of Life Science, Vol. 26, pp. 970-975 (2016.)*
Journal of Life Science, Vol. 28, pp. 827-834 (2018.07.30.)*
Korean J. Food Sci. An., Vol. 32, pp. 678-684 (2012.)*
Letters in Applied Microbiology, Vol. 64, pp. 379-385 (2017.)*

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