KR100414187B1

KR100414187B1 - 흰점박이꽃무지 추출물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR100414187B1
Application number: KR10-2001-0036463A
Authority: KR
Inventors: 이희삼; 김선여; 류강선; 김진원; 오영륜; 여주홍
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2001-06-26
Filing date: 2001-06-26
Publication date: 2004-01-07
Also published as: KR20030001659A

Abstract

본 발명은 사염화탄소 등과 같은 약물에 의해 유발된 간독성 회복효과가 탁월한 흰점박이꽃무지 추출물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 흰점박이꽃무지 추출물은 종래의 간질환 치료제인 실리마린(silymarin)과 거의 동일한 간보호효과를 갖고 있는 것으로 확인되었으므로, 간질환 치료제, 건강보조식품 등으로 개발하는 경우 농가의 소득증대 및 국민 건강의 증진에 기여할 것으로 기대된다.

Description

흰점박이꽃무지 추출물 및 이의 용도{Hepatoprotective extract derived from Protaetia brevitarsis and its use}

본 발명은 약물에 의한 간질환 예방 및 치료효과를 갖는 흰점박이꽃무지 추출물 및 이것의 용도에 관한 것이다.

현대인들은 불규칙한 식사, 스트레스, 과다한 음주 및 흡연 등으로 인하여 간기능이 손상되거나, 심하면 간질환으로 발전하는 경우가 빈번하게 일어나고 있다. 이와 같은 간기능의 손상 및 간질환은 인체에 치명적인 영향을 미치며 또한 회복하기도 어렵다. 이와 같은 간질환에는 여러 종류가 있으며, 예를 들어 급성간염 , 만성간염, 간경화증, 알콜성지방간, 간암 등이 있다. 특히 B형 바이러스 간염은 전염성이 있어 사회로부터 격리치료를 요하고 단체생활을 어렵게 한다. 게다가 만성간염, 간경변 및 간암으로 발전하는 경우도 빈번하고, 이들 간질환은 거의 불치병으로 인식되어 현대인들에게 큰 위협이 되어 온 것도 사실이다. 따라서 이들 간기능 손상 및 간질환을 부작용이나 재발 없이 효과적으로 치료할 수 있는 약제의 개발이 강하게 요구되고 있다.

따라서, 종래 천연물로부터 간질환을 치료할 수 있는 약제를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 예로서 영지버섯에 함유되어 있는 다당류, 구기자 추출물 등이 간세포 보호활성이 있음이 밝혀졌다.

본 발명자들도 이러한 상황하에서 천연물로부터 간질환을 예방 및 치료할 수 있는 약물을 찾고자 연구하였고, 그 결과, 흰점박이꽃무지로부터 간질환의 예방 및 치료 효과가 탁월한 추출물을 얻을 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 간질환 예방 및 치료 효과가 우수한 흰점박이꽃무지 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환 치료제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강보조 식품을 제공하는 것이다.

도 1은 사염화탄소에 의해 유발된 생쥐에서의 간보호 효과를 나타내는 전자현미경 사진으로, 도 1a는 정상간조직을, 도 1b는 사염화탄소에 의해 독성이 유발된 간조직을, 도 1c는 사염화탄소에 의해 간독성이 유발된 간조직이 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물에 의해 회복됨을 나타내는 사진이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 흰점박이꽃무지 추출물은흰점박이꽃무지 유충 분말에 증류수를 부가하여 물 추출액을 제조한 후, 이 추출액을 투석막에 통과시켜 분자량 1,000이하의 농축물을 수득하는 것에 의해 얻어지는 것임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 민간 및 동의보감(東醫寶鑑) 등의 전통 한방의서에서 '제조' 또는 '굼벵이' 라는 속명으로 불리어지고 있는 딱정벌레목(目), 풍뎅이과(科), 꽃무지아과(亞科)에 속하는 크기 17~24㎝의 식식성(植食性) 곤충으로, 우리나라를 비롯하여 중국, 일본 및 시베리아 동부 지역에 서식하며, 5월에서 10월에 걸쳐 1~2년에 1회 발생한다고 알려져 있으며(古川 등, 원색곤충백과도감, 集英社, 東京, 573- 574(1977); 張芝利, 중국경제곤충지 28책, 초시목, 중국과학원 중국동물지 편찬위원회, 과학출판사(1984)), 전통적으로 한방 의료 및 민족의학적 분야에서 사용되어 왔던 흰점박이꽃무지로부터 약물에 의해 유발된 간질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 추출물을 분리한 것이다.

본 발명은 우선 간질환 예방 및 치료 효과가 우수한 추출물을 얻기 위하여, 흰점박이꽃무지 유충 분말에 증류수를 첨가하여 물 추출액을 제조한 후, 이 추출액을 투석막에 통과시켜 분자량 1,000이하의 추출물을 수득하였다.

수득된 추출물을 가지고 사염화탄소에 의해 유발된 간독성 회복효과를 확인한 결과, 본 발명에 따른 추출물은 간독성 회복효과가 탁월하다는 것을 발견하였다. 즉, 본 발명에 따른 추출물은 약물에 의해 손상된 간에 있어서 종래 간질환 치료제로 알려진 실리마린(silymarin)과 거의 유사한 간질환 효과를 나타내는 것으로확인되었다.

따라서, 본 발명의 추출물은 약물에 의해 손상된 간질환 치료용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

이때 본 발명에 따른 흰점박이꽃무지 추출물은 상기한 간질환 치료에 유효한 양으로 함유되는데, 유효량은 투여경로, 제형, 사용하는 목적, 환자의 질환의 정도 등에 따라 광범위한 범위 내에서 결정될 수 있다. 그러나, 일반적으로 흰점박이꽃무지 추출물이 1~2500㎎/㎏/day, 바람직하게는 10~500㎎/㎏/day의 농도로 투여되도록 제형화될 수 있다.

흰점박이꽃무지 추출물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약, 캅셀 형태나 드링크제, 의약품 내지는 건강보조 식품의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여 경로를 통해 약물에 의한 간질환을 예방 및 치료를 위해 투여될 수 있으며, 투여 제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하지만 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다. 한편, 하기 시험예에서 사용된 시약, 재료 및 실험동물은 다음과 같이 준비하였다.

(1) 시약 및 재료

세포배양용 및 활성 검색용 시약은 모두 시그마사에서 구입하였고, 말혈청과 우태아혈청은 하이클론(Logan, UT., USA)의 제품을 사용하였다. 또한 사염화탄소,올리브유 및 기타시약은 준세이 케미칼(Junsei chemicals)사에서 구입하였고, GPT, 담즙산 및 빌리루빈 측정용 키트는 영동제약사에서 구입하였다.

(2) 실험동물

실험용 동물은 삼육실험동물센터에서 구입하였으며 체중 22±3g 정도의 웅성 ICR계 생쥐를 사용하였다. 10마리씩을 1군으로 각각 무작위로 나누어 22±1℃, 습도 50∼60%로 유지되는 실험동물 사육실에서 12시간 주기로 명암을 바꾸어 주었다. 물과 사료를 자유롭게 섭취하도록 하여 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 세포배양용 흰쥐는 체중 200±6g정도의 웅성 위스타 흰쥐만을 사용하였다.

<실시예 1>

2000년 5~6월경에 경기도 구리에 있는 초가농산으로부터 구입한 5령의 흰점박이꽃무지를 액체질소처리하고 동결건조하여 100g의 분말상태로 만든 후, 여기에 증류수를 가하여 수용성 물질만을 추출하였다. 추출방법은 초음파로 약 2시간 동안 5회에 걸쳐서 추출한 다음, 와트만 여과지 #4를 사용하여 여과하였다. 얻어진 물 추출액을 Spectra/Por^ⓡBiotech cellulose Ester MWCO 100 및 500 투석막 50㎝에 100㎖를 넣고 양끝이 새지 않도록 고정한 다음, 500㎖의 비이커에 넣고 자성교반을 48시간동안 냉장고에서 하면서 분자량 1,000이하의 분획물을 얻고 동결건조하여 분말화하였다(수율 20%). 이때 분자량은 겔투과크로마토그래피(Viscoteck, USA)장치를 사용하여 측정하였다.

<비교예 1>

상기 실시예 1에서 증류수로 추출하고 남은 잔사에 메탄올을 부가한 다음, 초음파로 5분동안 5회에 걸쳐 추출하고, 여과하여 유기용매 추출물을 얻었다.

<비교예 2>

상기 실시예 1의 분획물을 얻은 다음, 투석막안에 존재하는 내용물을 다시 Spectra/Por^ⓡBiotech cellulose Ester MWCO 1000 및 5000 투석막 50㎝에 100㎖를 넣고 양끝이 새지 않도록 고정한 다음, 500㎖의 비이커에 넣고 자성교반을 48시간동안 냉장고에서 하면서 분자량 1,000~8,000정도의 분획물을 얻고 동결건조하여 분말화하였다(수율 27%).

<비교예 3>

상기 비교예 2의 분획물을 얻은 다음, 투석막안에 존재하는 내용물을 다시 Spectra/Por^ⓡBiotech cellulose Ester MWCO 12000 및 14000 투석막 50㎝에 100㎖를 넣고 양끝이 새지 않도록 고정한 다음, 500㎖의 비이커에 넣고 자성교반을 48시간동안 냉장고에서 하면서 분자량 8,000~13,000정도의 분획물을 얻고 동결건조하여 분말화하였다(수율 35%).

<비교예 4>

상기 비교예 3의 분획물을 얻은 다음, 투석막안에 존재하는 내용물을 다시 Spectra/Por^ⓡBiotech cellulose Ester MWCO 1000 및 50000 투석막 50㎝에 100㎖를 넣고 양끝이 새지 않도록 고정한 다음, 500㎖의 비이커에 넣고 자성교반을 48시간동안 냉장고에서 하면서 분자량 30,000이상의 분획물을 얻고 동결건조하여 분말화하였다(수율 18%).

<시험예 1> 흰점박이꽃무지 추출물과 장수풍뎅이 추출물의 간보호 효과

현재 농가에서는 흰점박이꽃무지와 장수풍뎅이가 모두 굼벵이라고 불리우고 있다. 따라서, 이들의 간보호 효과를 비교하였다.

먼저, Berry와 Friend의 방법을 약간 수정한 콜라게나아제 관류법으로 간세포를 분리하여 24시간 동안 배양하였다(Berry, et al., 1991).그 다음, 사염화탄소 10mM을 처리하여 인위적인 독성을 유발하였다. 그 다음, 실시예 1의 흰점박꽃무지 물추출물과, 장수풍뎅이(allomyrina dichotoma) 유충에 증류수를 부가하여 실시예 1과 동일한 방법으로 추출한 장수풍뎅이 물추출물을 각각 50㎍/㎖의 농도로 첨가한 후, 1.5시간 동안 더 배양하였다. 그 다음, 간독성의 회복정도를 알아보기 위하여 배양액으로 유리되는 GPT활성과, 담즙산 및 비리루빈의 양을 측정하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

측정방법은 영동제약 키트를 사용하여 Reitman-Frankel의 방법에 의하여 측정하였다(Reitman, et al., 1957).

사염화탄소첨가량	시험군	GPT(Iμ/L)	담즙산(μmol/L)	빌리루빈(μmol/L)
0	대조군	21.8±3.3(100)	9.0±2.06(100)	7.65±1.30(100)
10mM	사염화탄소 투여군	525.5±22.2(0)	59.30±1.51(0)	14.50±1.29 (0)
10mM	흰점박이꽃무지 물추출물(50㎕/㎖)	318.0±20.8(41.2)	21.30±1.14(75.5)	12.75±2.14(25.5)
10mM	장수풍뎅이 물추출물(50㎕/㎖)	481.2±42.7(8.4)	37.50±3.81(43.3)	26.07±9.07 (0)
10mM	실리마린(2.0㎕/㎖)	465.8±46.8(11.9)	33.45±2.26(51.4)	13.03±0.80(21.5)
상기 값은 평균±표준편자(n=4)이다.상기 ()부분은 보호효과를 %로 나타낸것으로서, 하기 식에 의해 계산됨.100×[(사염화탄소투여군-시험물질투여군)/(사염화탄소투여군-대조군)]

상기 표 1로부터, 사염화탄소 처리로 인하여 간세포가 독성을 입게 되면, GPT효소가 배양액으로 유리되어 그 수치가 525.5±22.2(U/ml serum)으로 증가되었다. 50㎍/㎖농도의 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis) 물추출물과, 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)물 추출물을 처리할 때에는 GPT치가 318.0±20.8(U/ml serum)과 481.2±42.7(U/ml serum)로 감소되어, 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)와 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma) 추출물은 각각 41.2%와 8.4%의 간세포 회복효과를 나타냄을 알 수 있었다. 결과적으로, 사염화탄소에 의해 유도된 간독성의 회복효과에 대하여 흰점박이꽃무지 유충의 물추출물이 간세포 회복효과가 장수풍뎅이보다 좋다는 것을 알 수 있다.

<시험예 2> 사염화탄소에 의해 유도된 간독성에 흰점박이꽃무지의 물추출물과 유기용매 추출물의 영향

실시예 1의 흰점박이꽃무지 물추출물과, 비교예 1의 흰점박이꽃무지 메탄올 추출물의 간보호 효과를 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 측정하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.

사염화탄소 첨가량(mM)	시험물질	시험물질첨가량(㎍/㎖)	GPT(%)
0	대조군	0	100.0
10	사염화탄소투여군	0	0.0
10	흰점박이꽃무지 물 추출물	10	29.2±7.3
10	"	50	38.4±3.6
10	"	100	47.8±2.1
10	흰점박이꽃무지 메탄올 추출물	10	0.0
10	"	50	0.0
10	"	100	12.4±1.0

상기 표 2로부터, 사염화탄소 처리로 인하여 간세포가 독성을 입게 되면, GPT효소가 배양액으로 유리되는데 흰점박이꽃무지의 메탄올 추출물은 간독성 회복효과가 없지만, 물추출물은 농도의존적으로 간세포 회복효과를 나타냄을 알 수 있다

<시험예 3>갈락토사민에 의해 유도된 간독성에 흰점박이꽃무지의 물추출물과 유기용매 추출물의 영향

사염화탄소 대신에 갈락토사민에 의해 간독성을 유발시킨다는 것을 제외하고는 시험예 2와 동일한 방법으로 간보호 효과를 측정하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

갈락토사민투여량(mM)	시험물질	시험물질첨가량(㎍/㎖)	GPT(%)
0	대조군	0	100.0
10	갈락토사민 투여군	0	0.0
10	흰점박이꽃무지 물추출물	10	-26.5±1.2
10	"	50	-17.2±3.5
10	"	100	-13.8±2.6
10	흰점박이꽃무지 메탄올 추출물	10	7.4±0.2
10	"	50	-38.9±3.6
10	"	100	-45.7±4.8

상기 표 3으로부터, 갈락토자민에 의해 유발된 간독성에 대하여 흰점박이꽃무지의 물 추출물 및 메탄올 추출물 모두에서 간보호 효과가 나타나지 않았다. 이러한 결과로 볼 때 바이러스에 의한 간질환에는 흰점박이꽃무지 추출물이 보호효과를 나타내지 않는다는 것을 알 수 있었다.

<시험예 4> 흰점박이꽃무지 물추출물의 분자량에 따른 영향

사염화탄소에 의해 유도된 간독성회복에 흰점박이꽃무지의 4개의 분획물(실시예 1 및 비교예 2~4)이 미치는 영향을 알아보기 위하여, 흰쥐의 간으로부터 직접분리한 간세포를 24시간동안 배양하였다. 그리고 사염화탄소 10mM로 독성을 유발시키면서 실시예 1 및 비교예 2~4의 흰점박이꽃무지 추출물 각각을 동시에 첨가한 후 1.5시간 동안 더 배양하였다. 이후 간독성회복 정도를 알아보기 위하여 배양액으로 유리되는 GPT활성을 측정하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

사염화탄소투여량(mM)	시험물질	시험물질 첨가량(㎍/㎖)	GPT(%)
0	대조군	0	100.0
10	사염화탄소 투여군	0	0.0
10	실시예 1	50	64.2±7.3
10	비교예 2	50	20.2±3.2
10	비교예 3	50	0.0±1.5
10	비교예 4	50	27.8±2.2

상기 표 4로부터, 분자량 1000이하의 분획물이 64.2%의 회복도를 갖는 가장 우수한 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

<시험예 5> 흰점박이꽃무지 추출물의 이화학적 특성

간세포 회복효과가 가장 우수한 분자량 1,000이하의 흰점박이꽃무지 추출물을 Bradford법에 의한 단백질 정량 시험을 한 결과, 단백질은 거의 함유되어 있고, 물에 용해되는 것과 알코올에 녹는 두 부분으로 나뉘어지는 것으로 관찰되었다.

Ninhydrin reagents와 Dragendoff reagent에 양성반응을 보이는 물질이 존재하는 것으로 보아 알카로이드성 물질로 추측된다.

<시험예 6> 간보호효과의 병리·조직학적 측면

간조직을 H＆E와 M＆A 염색을 하여 현미경으로 관찰을 하였다. 정상쥐의 간조직에서는 특별한 병변을 관찰할 수가 없었으나(도 1a), 사염화탄소에 의한 간독성이 유발되면 간세포가 괴사됨을 알 수 있었고, 특히 중심정맥 오른쪽에 염증세포가 증가됨을 확인할 수 있었고, 정상적인 형태의 간세포가 사라지고 콜라겐이 많이 형성되고, 미토콘드리아의 크기가 비대해짐을 알 수 있었다(도 1b).

흰점박이꽃무지추출물의 투여군은 중심정맥쪽에 아주 경미한 허혈성 변성 이외에는 다른 병변을 찾을 수 없었고, 세포내 세포기관이 유지된 편이고 콜라겐 형성이 매우 많이 줄어들었다(도 1c). 이와 같이 흰점박이꽃무지 투여군은 사염화탄소로 생쥐에 간독성을 유발시켰을 때 뚜렷한 간보호 활성을 나타냄을 간조직검사로 밝힐 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 흰점박이꽃무지 추출물은 사염화탄소와 같은 약물에 의해 간독성이 유발되었을 때 효과적으로 간을 회복시킬 수 있고, 더구나, 공지의 간질환 치료제인 실리마린과 유사한 간질환 치료효과를 나타내므로, 간질환 치료제, 건강보조 식품 등의 유효성분으로 사용될 수 있다.

Claims

간질환 예방 및 치료작용을 나타내며, 흰점박이꽃무지 유충의 분말에 증류수를 가하여 물 추출액을 얻은 후, 이 추출액을 투석막에 통과시켜 얻은 분자량 1,000이하의 흰점박이꽃무지 추출물.
제 1항의 흰점박이꽃무지 추출물을 유효성분으로 하는 간질환 치료제 조성물.
제 1항의 흰점박이꽃무지 추출물을 유효성분으로 하는 건강 보조식품.