KR0122426B1

KR0122426B1 - 신규 항생물질 프로테신 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR0122426B1
Application number: KR1019930025095A
Authority: KR
Inventors: 박호용; 박순식; 박두상; 김정일; 이형규; 한창훈; 오현우; 고영희
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1993-11-24
Filing date: 1993-11-24
Publication date: 1997-11-24
Also published as: KR950013528A

Abstract

본 발명은 흰점박이꽃무지로부터 분리한 신규 항생물질 프로테신, 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 항생제에 관한 것이다. 프로테신은 자연 상태의 흰점박이꽃무지로부터, 또는 물리적 자극, 미생물 또는 기타 이물질을 주입한 흰점박이꽃무지로 부터 추출할 수 있으며 지금까지 알려지지 않은 신규의 항생물질이다.

Description

신규 항생물질 프로테신 및 그 제조방법

제1도는 프로테신(protaecin)의 자외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명은 항생물질로 작용하는 신규 생리활성물질 프로테신(protaecin)과 그 제조방법 및 프로테신을 유효성분으로 하는 항생제에 관한 것이다.

본 발명자들은 곤충의 생체방어 기구를 이용하여 곤충으로부터 신규 생리활성물질을 탐색하던 중 흰점박이꽃무지(protaetia brevitarsis)의 체액으로 부터 항생활성을 지니고 있는 물질을 발견하고, 그 물질의 특성 규명과 함께 그 제조방법을 확립하고 약리활성을 확인한 것이다. 본 프로테신(protaecin) 물질은 그람양성세균 및 그람음성세균에 강한 항균력을 나타내며 그 특성 및 제조방법이 기존에는 보고된 적이 없는 물질로 본 발명자들에 의해 처음으로 발견된 새로운 물질임을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적 및 배경은 다음과 같다.

지구상의 고등 생물 중 가장 많은 종을 차지하고 있는 곤충은 인류보다도 더 지구 생태학적 선점자이며 환경에 대한 적응력이 대단히 높아 지구 전지역에 걸쳐 광범위하게 분포하고 있다. 곤충의 생존능력이 높은 이유는 몸구조의 특이성 때문이기도 하지만, 병리 생리학적인 면에서 외부로부터의 물리적 자극이나 손상, 이물질 또는 미생물의 침입으로부터 자신을 보호할 수 있는 몇가지 생체 방어 메카니즘이 발달해 있기 때문이라 생각하여, 본 발명자들은 이미 알려진 곤충의 생체방어 기구의 포식작용(phagocytosis)이나 용균물질(lysozyme)분비 등 외에 포유동물의 체액성 면역반응에 해당한다고 생각되는 면역물질을 곤충의 체액으로부터 탐색하여 신규 생리 활성 물질로 활용하고자 이를 수행하였다. 곤충에는 포유동물에서 존재하고 있는 것과 같은 항원(antigen)에 대한 항체(antibody)반응, 즉 면역글로브린 지(IgG) 등을 생성하는 반응은 존재하지 않는다. 하지만 외부로부터의 물리적 손상을 가하거나, 이물질 또는 미생물을 주입하였을 경우에는 빠른 시간 내에 이에 대응하는 면역성 물질을 생산해 낸다는 사실이 파리목이나 나비목의 몇 종류 곤충에서 보고되고 있다.(Kanost, M.R. et al., Advances in Insect Physiology 22, 299-396(1990)). 본 발명에 사용된 흰점박이꽃무지(일명 흰점박이풍뎅이)는 생활사의 많은 시간을 농촌의 초가지붕 속이나 퇴비더미 등 비교적 열악한 환경 속에서 서식을 하며, 일부 민간요법에선 굼벵이라는 속명으로 질병의 치료에 사용되어 지고 있는 점에 착안하여 생리 활성물질탐색의 대상 곤충으로 선정하였다.

흰점박이꽃무지(일명 흰점박이풍뎅이, Protaetia brevitarsis)는 딱정벌레목(Coleoptera) 풍뎅이상과(Scarabaeidae) 꽃무지아과(Cetoninae)에 속하는 17~24mm 크기의 식식성 곤충으로서 우리나라를 비롯하여 중국, 일본 및 시베리아 동부지역에 서식하고 있으며, 5월에서 10월경에 걸쳐 일년에 1회 발생한다고 알려져 있다. 흰점박이꽃무지는 3령 성숙유충 상태로 월등하며 성충은 주간에 활동을 하고, 복숭아, 배 등의 성숙한 과일이나 옥수수, 상수리나무 등의 즙액을 먹이로 하며, 항상 군집성이고, 유충은 퇴비나 건초더미 등의 유기물이 풍부한 부식성 토양 속에서 서식하며 , 살아있는 식물의지하 부위는 잘 가해하지 않는다고 보고되어 있다.(古川 등, 원색곤충백과도감, 集英社, 1977 ; 張芝利, 중국경제곤충지 28책, 초시목, 중국과학원중국동물지편찬위원회, 과학출판사, 1984).

본 발명은 항생활성을 나타내는 신규물질을 곤충으로부터 생산, 분리정제한 후 그 약리활성 등을 규명하여 독성이 없으면서도 새롭고 진보적인 천연물 유래의 항생물질 및 그 제조방법을 개발하는 데에 목적이 있다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

흰점박이꽃무지(이하 실험곤충이라 함)가 생산하는 항생물질을 얻기 위해, 야외에서 채집하거나 인공 사육한 본 실험곤충의 유충에 미생물 또는 기타 이물질을 체강 내에 주입하여 일정시간 후 체액(haemolymph) 중에 유발(induction) 생성된 강력한 항생활성을 지닌 분획을 분리, 정제하면 신규 항생물질 프로테신을 얻을 수 있다. 또한, 자연상태의 실험곤충 유충 또는 물리적 자극을 가한 유충으로부터도 프로테신을 추출할 수 있다.

본 실험 곤충의 3령 유충을 사용하는 것이 바람직하며 미생물 방법을 사용할 경우로는 대장균, 엔테로박터 등 다양한 종류의 미생물들이 사용 가능하다.

유충 1마리당 1㎕ 내지 10㎕의 부피로 미생물을 포함하는 용액을 주입한 후 일정시간 경과 후, 바람직하게는 24 내지 72시간 경과 후 유충의 충체로부터 체액을 회수하며 회수한 체액은 원심분리, 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 사용하여 항생활성이 있는 분획만을 분리하므로서 프로테신을 추출해 낼 수 있다. 7×10^uCFU(colony forming unit)의 미생물을 투입하는 것이 가능하며 바람직하게는 유충 1마리당 3-7㎕의 부피로 3×10⁴내지 7×10⁴CFU의 미생물을 주입한다.

프로테신의 항균활성은 페이퍼 디스크법(Hewitt, W. et al., Theory and Application of Microbiological Assay, Academic Press, 1989) 등의 방법으로 측정할 수 있으며 그 결과 다양한 그람음성세균 및 일부 그람양성세균에 강한 항균 활성이 있음이 나타났다.

프로테신의 이화학적 특성은 다음과 같다.

(1) 물질의 성상 : 백색분말의 펩타이드(peptide)

(2) 분자량 : 약 4,000 달톤, 약 9,000 달톤, 약 12,000 달톤

(3) 자외선 흡수 스펙트럼(UV_maxnm) : 없음(End absorption)

물에서 흡수한 자외선 흡수 스펙트럼은 제1도와 같다.

(4) 열안정성 : 100℃에서 30분 이상 처리하여도 항균 활성이 유지됨.

(5) 산도(pH)에 대한 안정성 : pH 2.0에서 pH 12.0까지 광범위한 활성 안정도를 보여주고 있음.

(6) P.I값 : 6.9-7.5

(7)용해도 : 수용성

이상의 결과로, 프로테신 물질은 지금까지 보고된 항생활성을 가진 물질과는 명확히 다른 특성을 가지고 있음을 알 수 있으며, 특히 본 발명에 사용된 실험곤충인 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)에서 추출 또는 정제한 생리활성물질에 대한 보고는 지금까지 전혀 없으므로 프로테신 물질은 새로운 미생물 생육 억제제 내지는 항생제로서 이용할 수 있다.

본 발명의 프로테신 물질을 유효성분으로서 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 항생제 조성물을 제조할 수 있다. 항생제 조성물은 통상적으로 사용도는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 프로테신 물질을 유효성분으로 함유되는 항생제는 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 kg 당 1 내지 1000mg의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정환자에 대한 투여 용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 따라 구체적으로 기술하면 다음과 같으며, 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것 일뿐 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

참조예 : 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)의 실내인공사육

본 발명에 사용된 흰점박이꽃무지는 대전광역시 및 충청남도 일원의 농가 등에서 야외채집한 뒤, 온도 23-27℃, 상대습도 55-75%, 광주기(명 : 암) 14-16 : 8-10 시간의 조건으로 자연상태에서 충분히 발효시킨 볏집과 사과, 배, 복숭아 등의 과일을 사료원으로 하여 개체 또는 20-60마리씩 집단을 실내사육하였다. 사육곤충은 3령 노숙유충이 되면 짚이나 흙 등의 사육공간내 주변재료로 자신의 몸을 타원구형으로 완전히 감싼 후 번데기 상태로 들어가며, 성충으로 우화 후 교미, 산란한 알은 멸균된 사육배양기로 옮겨 부화시켜, 필요한 실험곤충을 양적, 질적으로 안정적 확보를 하였다.

[실시예1 : 프로테신(protaecin) 물질의 제조 및 분리]

야외 채집 또는 실내사육한 실험곤충의 3령 유충에, 엘비(LB) 액체배지를 이용하여 37℃의 진탕배양기에서 하룻밤 동안 배양한 대장균(Escherichia coli) KCTC 2597 또는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) KCTC 2631 미생물 배양액(10⁷cells/㎖)을 실험곤충 한 마리당 3-7㎕씩 경피적으로 주사한 뒤, 참조예의 조건에서 사육하면서 24시간에서 72시간 경과 후에 충체로부터 체액(haemolymph)을 회수하였다. 체액의 회수는 미생물을 주입하여 사육한 실험곤충의 충체를 예리한 기구로 찔러 체액을 흘러 나오게 한 후, 미리 준비해 둔 용기에 담는 방법을 이용하였다. 회수한 체액은 100℃에서 5분간 처리하고 3,000g에서 10분간 원심분리하여 침전물을 제거한 뒤, 시엠 세파로스(CM-Sepharose, 분자량 4×10⁶, Sigma CCF-100) 컬럼 크로마토그라피(직경 1cm×길이 20cm)와 세파덱스 지-50(Sephadex G-50) 컬럼크로마토그라피(직경 2cm× 길이 90cm)를 통과시켜 페이퍼 디스크(paper-disc)방법에 의해 항생활성이 있는 분획을 선택구별하여 이를 회수하였다. 프로테신 물질의 정제도를 높이기 위하여 15% 산성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 행하여 얻은 밴드(band)를 잘라내어 추출(elution)하거나, (아세토니트릴 : 트리플루오로아세트산=2,000 : 1) : 물을 38-43 : 62-57 비율의 밀도구배(gradient) 농도용액으로 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 통과시켜서 얻은 활성분획을, 증류수에 대해 충분히 투석(dialysis)을 한 후 동결건조하였다.

프로테신 물질의 이화학적 특성은 다음과 같이 측정하였다.

* 자외선 흡수 스펙트럼 : 100㎍의 프로테신 물질을 포함하는 증류수 1㎖를 자외선 및 가시광선 스펙트로포토메터(UV/Vis spectrophotometer, Milton Roy 3000)를 이용하여 200nm 부터 320nm까지의 파장에서 연속적인 자외선 흡수 스펙트럼을 측정하였다.

* P.i.값 : 폴리아크릴아마이드 겔에서 분획한 밴드 중에서 프로테신 활성을 보이는 것을 아이소일렉트릭포커싱겔(Iso-electric focusing gel, pH range : 3.5-10, 6-9)을 이용하여 pI 값을 측정하였다.

[실시예2 : 프로테신(protaecin) 물질의 항생활성]

상기 실시예1에서 정제하여 얻어진 프로테신 물질의 미생물에 대한 항생 활성을 1㎎/㎖ 농도에서 페이퍼 디스크법(Hewitt, W. et al., Theory and Application of Microbiological Assay, Academic Press, 1989)으로 조사하였다. 그 결과 표1에 나타난 바와 같이 프로테신 물질은 피검주 중 그람음성세균 대부분과 일부 그람양성세균에 강한 항생활성을 보여주었는데, 특히 마이크로코카스 루테우스 KCTC 3063에는 대단히 강한 항생활성을 나타내었다.

* 항생활성의 측정 : 1㎎/㎖의 정제된 펩타이드 10㎕를 페이퍼디스크에 첨가하였을 때 나타나는 고체배지상의 생육저지환의 직경(+, 2-4mm : ++, 4-8m : +++, 8-16mm : ++++, 16mm 이상 : -, 환이 형성되지 않음)

프로테신을 100℃에서 30분간 처리하여도 상기 항생활성이 유지되었으며, pH의 변화에 따른 항균 활성도를 측정해 본 결과 pH 2.0 내지 pH 12.0 사이에서 광범위하게 안정적인 활성을 유지하였다.

* 페이퍼디스크법으로 측정시의 항생활성 크기(할로우) 직경(mm)

[실시예3 : 프로테신(protaecin) 물질의 독성시험]

프로테신 물질을 4주령된 5마리의 ICR계 수컷 마우스 및 5마리의 암컷 마우스(구입처)에 각 1,000mg/kg 체중의 양으로 경구투여하고 14일간 관찰한 결과, 10마리 모두에서 아무런 이상을 발견하지 못하였다. 또한 부검 후 장기의 이상유무를 관찰한 결과 아무런 이상도 발견하지 못하였다.

Claims

흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)의 체액으로부터 분리된, 하기의 이화학적 성질을 갖는 항생물질 프로테신 :

물질의 성상 : 백색분말의 펩타이드

분자량 : 4,000 달톤, 9,000 달톤 또는 12,000 달톤

자외선 흡수 스펙트럼(UV_maxnm) : 없음(End absorption)

열안정성 : 100℃에서 30분 이상 처리하여도 항균 활성이 유지됨

산도에 대한 안정성 : pH 2.0에서 pH 12.0까지 광범위한 활성안정도를 보임

pI 값 : 6.9-7.5

용해도 : 수용성
흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)의 유충에 미생물 또는 이물질을 주입하여 유충의 체액 중의 항생활성 물질이 생성되도록 하고, 유충으로부터 체액을 채취하고, 채취된 체액을 열처리하고, 원심분리한 후, 상층액으로부터 컬럼 크로마토그래피에 의해 항생활성이 있는 분획을 분리하는 것을 포함하는, 제1항의 항생물질 프로테신의 제조방법.
유효성분으로 제1항의 항생물질 프로테신과 함께 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항생제.