KR20230008622A - 잎응애 퇴치용 단백질 bvp8 및 그 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 농업 미생물학 기술 분야에 관한 것이며, 구체적으로 잎응애 퇴치용 단백질 BVP8 및 그 응용에 관한 것이다. 상기 단백질은 서열번호 2에 표시된 바와 같다. BVP8 단백질의 점박이응애에 대한 50% 치사농도는 12.98 μg/mL이고, 귤응애에 대한 50% 치사농도는 33.45 μg/mL이며, 점박이응애 붙이에 대한 50% 치사농도는 26.32 μg/mL이고, 점박이응애의 알에 대해 부화 억제 및 용해 역할을 가지며, 72시간의 알 용해율은 75.86%이다. 상기 단백질은 신규한 잎응애 퇴치제의 제조를 위해 새로운 선택성을 제공한다.
Description
본 발명은 농업 미생물학 기술 분야에 관한 것이며, 구체적으로 잎응애 퇴치용 단백질 BVP8 및 그 응용에 관한 것이다.
잎응애는 농업 생산에서 중요한 해충 응애이다. 목화, 곡물, 과수, 산림수 및 관상용 식물을 해친다. 목화 응애(목화 붉은 거미)는 중국의 10대 해충 중 하나이다. 점박이 응애는 1분당 18~22개의 식물 세포를 뚫을 수 있다. 귤응애는 귤 나무의 중요한 해충 응애이고, 사과 응애 및 산사 응애는 중국 북방 과수의 중요한 해충 응애로서, 매우 심각한 경우에는 과일 생산량을 1/3~2/3 감소시킬 수 있다. 밀 응애는 전국의 밀 생산 구역에 퍼져있고 피해가 심각한 경우에는 밀을 수확할 수 없다. 목화밭에 피해를 입히는 목화 응애에는 여러 종류가 있는데, 생산량을 30% 이상 감소시킬 수 있으며, 심지어 목화 나무를 완전히 시들게 할 수 있다.
온도는 잎응애 개체 수의 증감에 영향을 미치는 하나의 중요한 요소이다. 잎응애의 활동에 적합한 온도와 범위는 종(種)에 따라 다르다. 사과 응애와 같은 고온 활동형인 종의 생존에 적합한 온도는 25~28℃이고, 작은 클로버 응애와 같은 저온 활동형인 종의 생존에 적합한 온도는 21~24℃이다. 대부분의 잎응애는 상대 습도가 40~70%인 건조한 기후를 좋아한다. 따라서, 건조하고 무더운 날씨에서 보통 잎응애는 창궐한다. 잎응애의 번식 방식은 주로 양성 생식이지만, 단성 생식일 수도 있다. 작은클로버 응애 등의 종은 암컷 응애에서만 보이며, 단성 생식한다. 잎응애속(屬) 등의 종은 자웅 양성이며, 유성 생식을 할 수 있을 뿐만 아니라, 수정하지 않은 암컷 응애가 수컷 자손만 생식하는 단성 생식을 할 수도 있다.
잎응애의 방제 방법은 주로 농업 방제, 생물학적 방제 및 화학적 방제로 나뉜다. 농업 방제에는 겨울에 과수원을 정리하고, 병든 잎을 제거하고 이들을 집중적으로 태워 해충 응애의 월동 개수를 감소시키며, 액체 비료 관리를 강화시켜 과수원의 미기후를 개선하는 것 등이 포함된다. 생물학적 방제는 천적, 생물학적 잎응애 퇴치제 등의 친환경적이고 안전한 수단을 이용하여 예방 및 관리를 강화하는 것을 포함한다. 화학적 방제는 주로 화학적 잎응애 퇴치제 등의 약제를 사용하여 방제를 진행한다. 최근 잎응애 퇴치제의 대체품 부족으로 인해, 잎응애 퇴치제를 대량으로 반복적으로 사용하게 되어, 해충 응애의 저항성 발달이 가속화되고, 점점 더 심각한 응애 피해가 발생하여, 재배자들에게 막대한 경제적 손실을 초래하고 있다.
현재 국제적으로 개발된 잎응애 퇴치제 대부분은 물에 용해되기 어려운 화학물질 또는 고분자 항생제이며, 저분자 단백질에 대한 보고는 거의 없으므로, 이러한 배경에 기초하여 잎응애를 방제하는 단백질 제제를 개발하여 잎응애의 생물 방제 분야에 사용할 필요가 있으며, 이는 생산에서 중요한 실용적 의미를 가진다.
본 발명은 서열번호 2에 표시된 잎응애 퇴치용 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 잎응애 퇴치용 단백질의 잎응애 퇴치제의 제조에서의 응용을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
서열번호 2에 표시된 잎응애 퇴치용 단백질을 제공하며, 서열번호 2에 표시된 단백질을 인코딩하는 유전자도 본 발명의 보호 범위에 속하며, 바람직한 유전자는 서열번호 1에 표시된 바와 같다.
상기 단백질의 당업계에서 통상적인 방식의 사용, 예를 들어 원핵생물, 진핵생물 발현 또는 직접 합성은 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.
잎응애 퇴치용 단백질이 잎응애 퇴치제의 제조에서의 응용에 있어서, 서열번호 2에 표시된 단백질을 유효성분 중의 하나, 또는 유일한 유효성분으로 사용하여, 잎응애 퇴치제를 제조하는 것을 포함한다. 본 발명의 잎응애 퇴치용 단백질은 잎응애 알의 부화 억제제로도 사용될 수 있다.
상기와 같은 응용에 있어서, 상기 잎응애는 점박이응애, 귤응애 또는 점박이응애붙이인 것이 바람직하다.
본 발명은 잎응애를 퇴치하는 신규한 단백질 및 그 잎응애 퇴치 활성에 대해 처음으로 기재하고 있으며, 신규한 잎응애 퇴치제를 제조하는데 새로운 선택성을 제공한다.
BVP8 단백질을 포함하는 잎응애 퇴치제는 효율이 높고 독성이 낮으며 친환경인 장점들을 구비한다.
도 1은 BVP8 단백질을 정제한 후의 SDS-PAGE 전기영동 분석을 나타낸다.
도 2는 BVP8 단백질의 점박이응애 알에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 BVP8 단백질의 점박이응애 알에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
하기의 실시예에서의 실험 방법은 달리 명시되지 않는 한 보고된 미생물학 분야의 통상적인 조작 방법이다. 상기 시약 또는 재료는 달리 명시되지 않는 한 당업계의 통상적인 방안이다.
본 발명에 관한 BVP8 단백질은 당업계의 통상적인 방식, 예를 들어 원핵생물 발현, 통상적인 합성 등에 의해 얻을 수 있다. 본 발명은 BVP8 단백질의 원핵생물 발현시키는 것을 예로 하고, 그의 잎응애 억제 기능에 대해 설명하며, 기타 방식으로 얻은 상기 단백질도 동일한 기능을 수행할 수 있다.
실시예 1:
잎응애 퇴치용 BVP8 단백질의 획득:
1) 서열번호 1에 표시된 서열(서열번호 2에 표시된 단백질을 인코딩함)에 따라, BVP8 단백질 유전자 조각 (생공 생물 공정(상해)Co., Ltd.(生工生物工程（上海）股
有限公司))을 인공적으로 합성시키고, 대장균 발현 벡터 pet28a 플라스미드 상에 연결하여 재조합 발현 플라스미드 pet28a-BVP8를 조성하였다.
2) 대장균 BL21에서 잎응애 퇴치용 BVP8 단백질 유전자의 발현 및 정제
잎응애 퇴치용 BVP8 단백질을 대량으로 발현하기 위해, 상기 코딩 서열을 함유하는 상술한 재조합 발현 플라스미드 pet28a-BVP8를 대장균 BL21에 형질전환시켜, 재조합 박테리아 BL21/pet28a-BVP8을 수득하였다. 상기 재조합 박테리아를 5 mL의 LB 액체 배지에 접종시키고, 37℃ 진탕기(shaker)에 넣고 0.6의 OD600까지 배양한 후, 유도를 위해 1.0 mmol/L의 이소프로필-B-D 티오갈락토시드(즉 IPTG, Sigma사로부터 구입함)를 첨가하고 30℃에서 3시간 동안 배양하였다. 상술한 50 mL의 재조합 박테리아 BL21/pet28a-BVP8의 3시간 유도된 배양액을 12,000 rpm으로 30초 동안 원심분리시켜 세포를 수집하고, 초음파(기술 파라미터:300 W, 파쇄 30초, 간격 30초)를 이용하여 세포를 파쇄한 후, 12,000 rpm으로 15분 동안 원심분리를 진행하고 상등액을 취한 후, 구멍 크기가 0.4 μm인 필터로 여과하여 불순물을 제거하고, GST 융합 단백질의 친화성 크로마토그래피로 각 단백질을 정제시켰다. 최종 정제 산물은 SDS-PAGE 전기영동에 의해 검출되었고, 그 결과는 도 1에서 도시된 바와 같이, 정제된 단백질을 단백질 분자량 표준과 비교하였고, 추정된 분자량은 9 kDa이었으며, 이는 예상된 BVP8 단백질 분자량인 8.34 kDa에 기본적으로 일치되므로, 본 발명의 BVP8 단백질이 대장균 BL21에서 성공적으로 발현되었음을 증명하였다.
실시예 2:
1) BVP8 단백질의 점박이응애(
Tetranycus urticae
)에 대한 퇴치
FAO(국제연합식량농업기구)에서 권장하는 해충응애를 측정하는 표준 방법인 슬라이드-침지 방법(Slide-dip method)을 참조한다. 양면 테이프를 2-3cm 길이로 잘라서 현미경 슬라이드의 한쪽 끝에 부착하고, 핀셋으로 테이프 상의 종이 조각을 뜯어내고, 0호 붓으로 크기가 같고 몸 색이 밝은 움직임이 활발한 암컷 성충을 선별하고, 그 뒷면은 양면 테이프로 부착시키고(주의점: 응애의 발, 수염 및 입 부분은 부착하지 말것), 시트마다 4줄, 줄마다 10마리를 부착한다. 온도가 25℃이고, 상대 습도가 약 85%인 생화학 배양기에 4시간 동안 넣고, 쌍안 현미경으로 관찰하여 사망하거나 움직임이 활발하지 않은 개체를 제외시킨다. 사전 테스트를 근거로 하여, 약물을 물로 5-7개의 농도로 희석시키고, 잎응애가 있는 슬라이드 글라스의 한쪽 끝을 약물 용액에 넣고 5초 동안 살살 흔든 후 꺼내고, 흡수지로 신속하게 잎응애 몸 및 그 주위의 남은 약물 용액을 흡수하여 말린다. 상술한 생화학 배양기에 넣고, 24시간 후에 쌍안 현미경으로 결과를 검사한다. 붓으로 잎응애 몸을 살짝 터치하여, 발을 움직이지 않는 잎응애는 사망한 것으로 간주하였다. 매 농도마다 3번 반복하고, 맑은 물에 침지하는 것을 대조군으로 하였다. 상기 실험 절차에 따라, BVP8 단백질 현탁액의 점박이응애에 대한 생물 검정 결과는 하기의 표 1에 나타낸 바와 같이 12.98 μg/mL이다. LC50 값은 SPASS 19.0 데이터 처리 소프터웨어를 이용하여 계산하였다.
| 조제량 (μg/mL) |
사망율(%) | 조제량 로그 | 확률 단위(P+5) | 회귀방정식 | 50% 치사 농도(LC50, μg/mL) |
| 165.5 | 56.7 | 2.219 | 5.170 | Y=4.7430+0.2308X（r=0.5130） | 12.98 |
| 82.75 | 58.3 | 1.918 | 5.210 | ||
| 33.1 | 62.5 | 1.520 | 5.320 | ||
| 16.55 | 44.4 | 1.219 | 4.859 |
2） BVP8 단백질의 귤응애(
Panonychus citri
)에 대한 퇴치
FAO(국제연합식량농업기구)에서 권장하는 해충응애를 측정하는 표준 방법인 슬라이드-침지 방법(Slide-dip method)을 참조한다. 양면 테이프를 2-3cm 길이로 잘라서 현미경 슬라이드의 한쪽 끝에 부착하고, 핀셋으로 테이프 상의 종이 조각을 뜯어내고, 0호 붓으로 크기가 같고 몸 색이 밝은 움직임이 활발한 암컷 성충을 선별하고, 그 뒷면은 양면 테이프로 부착시키고(주의점: 응애의 발, 수염 및 입 부분은 부착하지 말것), 시트마다 4줄, 줄마다 10마리를 부착한다. 온도가 25℃이고, 상대 습도가 약 85%인 생화학 배양기에 4시간 동안 넣고, 쌍안 현미경으로 관찰하여 사망하거나 움직임이 활발하지 않은 개체를 제외시킨다. 사전 테스트를 근거로 하여, 약물을 물로 5-7개의 농도로 희석시키고, 잎응애가 있는 슬라이드 글라스의 한쪽 끝을 약물 용액에 넣고 5초 동안 살살 흔든 후 꺼내고, 흡수지로 신속하게 잎응애 몸 및 그 주위의 남은 약물 용액을 흡수하여 말린다. 상술한 생화학 배양기에 넣고, 24시간 후에 쌍안 현미경으로 결과를 검사한다. 붓으로 잎응애 몸을 살짝 터치하여, 발을 움직이지 않는 잎응애는 사망한 것으로 간주하였다. 매 농도마다 3번 반복하고, 맑은 물에 침지하는 것을 대조군으로 하였다. 상기 실험 절차에 따라, BVP8 단백질 현탁액의 귤응애에 대한 생물 검정 결과는 하기의 표 2에 나타낸 바와 같이 33.45 μg/mL이다. LC50 값은 SPASS 19.0 데이터 처리 소프터웨어를 이용하여 계산하였다.
| 조제량 (μg/mL) |
사망율(%) | 조제량 로그 | 확률 단위(P+5) | 회귀방정식 | 50% 치사 농도(LC50, μg/mL) |
| 165.5 | 76.9 | 2.591 | 2.219 | Y=3.5091+0.9780X（r=0.9781） | 33.45 |
| 82.75 | 63.6 | 1.892 | 1.918 | ||
| 33.1 | 45.5 | 1.591 | 1.520 | ||
| 16.55 | 41.7 | 1.289 | 1.219 |
3) 상기 실험 절차에 따라, BVP8 단백질 현탁액의 점박이응애 붙이에 대한 생물 검정 결과는 하기의 표 3에 나타낸 바와 같이 26.32 μg/mL이다. LC50 값은 SPASS 19.0 데이터 처리 소프터웨어를 이용하여 계산하였다.
| 조제량 (μg/mL) |
사망율(%) | 조제량 로그 | 확률 단위(P+5) | 회귀방정식 | 50% 치사 농도(LC50, μg/mL) |
| 165.5 | 97.2 | 2.219 | 6.918 | Y=1.8201+2.2390X（r=0.9904） | 26.32 |
| 82.75 | 82.1 | 1.918 | 5.922 | ||
| 33.1 | 59.5 | 1.520 | 5.239 | ||
| 16.55 | 34.3 | 1.219 | 4.596 |
4）점박이응애 알에 대한 BVP8 단백질의 억제 효과
점박이응애가 알을 낳는 기간에 잎을 취하여 흐르는 물에 성충 및 약충 잎응애를 씻어낸다. 흡수지로 잎의 수분을 흡수하여 말린다. 양면 테이프가 부착된 슬라이드 글라스로 알을 살살 부착하여 뜯어내고, 현미경으로 관찰하여 계수한 다음, 계수한 알을 측정할 샘플에 3초 동안 침지시키고 꺼낸다. 그런 다음 25도 항온 배양기에 넣고, 각각 24시간, 48시간 및 72시간 후에 현미경으로 BVP8 단백질의 점박이응애 알에 대한 억제 효과를 관찰하고, 상이한 형태의 알을 계수하고 촬영한다.
상기 결과는 BVP8 단백질이 점박이응애 알에 대해 억제 효과를 가지며, 알의 부화를 억제할 수 있고, 알이 24시간 후에 수축하기 시작하며 점차적으로 용해되고, 48시간 및 72시간 후의 알의 용해율은 각각 22.41% 및 75.86%이었음을 보여주었다(표 4, 도 2).
| 명칭 | 0 시간 | 24 시간 | 48 시간 | 72 시간 | ||||
| 상태 | 부화률 (%) |
상태 | 부화률 (%) |
상태 | 부화률 (%) |
상태 | 부화률 (%) |
|
| BVP8 단백질 | + | 0 | ++++ | 0 | ++++ | 0 | +++++ | 0 |
| 순수물대조군 | + | 0 | ++ | 17.86 | +++ | 50 | +++ | 83.93 |
비고: +, 알이 통통하고, 연황색이며, 부화 예정임; ++, 정상 알, 부분적으로 부화됨； +++, 알이 부화됨； ++++, 알이 수축되고，부화되지 않음； +++++, 알이 용해됨.
Claims (2)
- 서열번호 2에 표시된 단백질, 또는 서열번호 2에 표시된 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는, 점박이응애, 귤응애, 또는 점박이응애붙이인, 잎응애 퇴치용 조성물.
- 서열번호 2에 표시된 단백질, 또는 서열번호 2에 표시된 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는, 점박이응애 알의 부화 억제용 조성물.
Applications Claiming Priority (2)
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