CN117285607B - 杀螨蛋白bvp28在防治螨害中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及杀螨蛋白BVP28在防治螨害中的应用。所述蛋白为SEQ ID NO.2所示。通过对不同害螨的生物活性测定，发现BVP28蛋白对二斑叶螨的半致死浓度为4.07 mg/L，对柑橘全爪螨的半致死浓度为6.39 mg/L，对麦长腿蜘蛛的半致死浓度为6.29 mg/L，对屋尘螨的半致死浓度为7.01 mg/L，对粉螨的半致死浓度为13.50 mg/L，表明该蛋白对多种害螨具有很强的杀灭作用。通过处理二斑叶螨的虫卵发现BVP28蛋白还可以引起螨卵降解，10 mg/L的BVP28蛋白处理24 h后螨卵的平均杀灭率达到94.55%。该蛋白为新型杀螨剂的研发提供了新的资源。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及杀螨蛋白BVP28在防治螨害中的应用。
背景技术
螨虫是一类蜱螨目的节肢动物，种类繁多，目前已知螨类超过5万种。其中自由生活的螨虫可以在多种环境(包括淡水、温泉、土壤、人类居室环境等)中生存，寄生类螨虫可以寄生植物、动物，也包括人类。植物寄生螨以植物叶片为食，同时也会传播植物病毒，造成植物生长受阻，发育不良。动物寄生螨可以生活在动物的体表、鼻腔、肺、胃或更深的身体组织中，部分寄生螨还会携带人类、动物病原菌进行传播。由于螨虫栖息地的广泛分布，螨虫与人类日常活动的各个方面密切相关，因此，针对螨害的防治研究十分重要。
对农业危害严重的螨虫主要是叶螨科(Tetranychidae)的害螨，这一类植食性螨虫包括二斑叶螨(Tetranychus urticae)、柑橘全爪螨(Panonychus citri)、麦长腿蜘蛛(Petrobia latens)、棉红蜘蛛(Tetranychus cinnabarinus)等。叶螨宿主谱广，可以取食室内植物及重要农业植物(包括果树)的叶和果实。叶螨具有个体小、繁殖快、适应性强及容易产生抗药性等特点，对我国小麦、果蔬、棉花、茶叶等粮食、经济作物产业造成严重危害。目前防治叶螨的主要方法为化学防治，但现有的农用杀螨剂存在抗药性问题严重、造成农业面源污染等问题，不利于绿色农业的可持续性发展。
人类家居环境中分布的主要螨虫为尘螨，其中以屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)、粉尘螨(Dermatophagoides farinae)、梅氏嗜霉螨(Euroglyphusmaynei)为代表。尘螨主要寄生在地毯、床垫、沙发、被褥、枕头以及空调过滤网等处，以人或动物的皮屑为主食，可引起人类的变态反应性疾病，如支气管哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎等。目前国内外防治尘螨的方法可分为物理防治和化学防治，其中物理防治是通过物理隔绝、日晒等方法减少活螨数量，该类方法实施起来效率较低，还存在一定困难；化学防治是通过杀螨剂处理直接杀死螨虫，但传统杀螨剂存在对人类、动物等非靶标生物有害，对家具环境不友好等问题，需要开发高效低毒的环境友好型杀螨剂。
在粮食仓库中定栖的主要螨类是属于粉螨科(Acaridae)的螨虫，约占整个储粮螨类的60％，常见的有腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)、粗脚粉螨(Acarus siro)、椭圆食粉螨(Aleuroglyphus ovatus)等。粉螨的生活史短，产卵量大，在条件合适的情况下粉螨可在1-2个月内大量繁殖，成千上万的粉螨产生的尸体、排泄物、蜕下的皮壳、代谢产物以及伴生的微生物会污染储藏的粮食(特别是面粉和大米)和食品。此外，粉螨还可以引起人体螨病，例如肠螨病、肺螨病、螨性过敏和螨性皮炎等。现用的杀螨剂均为高效高毒的化合物，不能应用于储粮。因此，亟需高效低毒杀虫剂来防治储粮螨类对储藏粮食的危害。
目前市面上的杀螨剂大多数为难溶于水的化学物质或大分子抗生素，应用于螨害防治易产生药物残留等问题。相较之下，小分子蛋白类的物质报道较少。因此针对害螨防治中出现的问题，有必要开发新型绿色高效的害螨生防制剂，这对人类生产实践具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供蛋白BVP28在防治螨害中的应用，所述的螨害包括植物螨害、家居环境螨害和/或粮储螨害，所述蛋白BVP28为SEQ ID NO.2所示。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
蛋白BVP28在防治螨害中的应用，所述的螨害包括植物螨害、家居环境螨害和/或粮储螨害，所述蛋白BVP28为SEQ ID NO.2所示。优选的，其对应的基因为SEQ ID NO.1所示。
以上所述的应用中，包括以SEQ ID NO.2所示蛋白作为有效成分之一，或者唯一有效成分用于防治螨害。
蛋白BVP28在制备防治害螨药剂中的应用，所述的害螨包括植物害螨、家居环境害螨和/或粮储害螨，所述蛋白BVP28为SEQ ID NO.2所示；
以上所述的应用中，包括以SEQ ID NO.2所示蛋白作为有效成分之一，或者唯一有效成分用于制备防治害螨药剂。
蛋白BVP28在杀灭螨卵中的应用，所述蛋白BVP28为SEQ ID NO.2所示；
以上所述的应用中，包括以SEQ ID NO.2所示蛋白作为有效成分之一，或者唯一有效成分用于杀灭螨卵。
蛋白BVP28在制备螨卵杀灭剂中的应用，所述蛋白BVP28为SEQ ID NO.2所示；
以上所述的应用中，包括以SEQ ID NO.2所示蛋白作为有效成分之一，或者唯一有效成分用于制备螨卵杀灭剂。
以上所述的应用中，优选的，当SEQ ID NO.2所示蛋白作为有效成分之一时，其可以为含有SEQ ID NO.2所示蛋白的微生物发酵产物，或含有SEQ ID NO.2所示蛋白的复配制剂。
以上所述的应用中，优选的，所述的螨卵为二斑叶螨(Tetranychus urticae)螨卵；
以上所述的应用中，优选的，所述的害螨为二斑叶螨(Tetranychus urticae)、柑橘全爪螨(Panonychus citri)、麦长腿蜘蛛(Petrobia latens)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)和/或粉螨(Tyrophagus putrescentiae)；
以上所述的应用中，优选的，所述的蛋白BVP28可利用本领域的常规方法制备，包括但不限于原核、真核表达，或是直接合成该蛋白。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明首次报道了一种对螨虫具有毒杀活性的新蛋白及其对多种害螨的毒杀活性，包含BVP28蛋白的杀螨剂具有高效、低毒、对环境友好的特点，为新型绿色杀螨剂的创制提供了新资源。
本发明发现的编码杀螨蛋白的基因序列可以通过应用于转化微生物和植物，使其表现出对于相关害螨的毒性，可以克服或延缓害螨对现有杀螨产品抗药性的产生，在绿色防治害螨方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为BVP28蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳分析图。
图2为BVP28蛋白对二斑叶螨的作用效果图。
图3为BVP28蛋白对螨卵的作用效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明以下实施例中所使用的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法，所述试剂或材料，如未特别说明，均为本领域的常规方案。
本发明所述的BVP28蛋白，可用本领域的常规方法，例如原核表达、化学合成等方式得到。本发明以原核表达BVP28蛋白为例，对其杀螨活性进行性说明，其他方式获得的该蛋白也能行使相同的功能。
实施例1：
BVP28杀螨蛋白的制备
1)构建重组质粒：本发明涉及的编码基因片段由金开瑞生物科技有限公司进行人工合成，编码序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示。将合成片段连接到大肠杆菌表达载体pET28a质粒上，构建重组表达质粒pET28a-BVP28。
2)BVP28杀螨蛋白的表达与纯化：将重组质粒pET28a-BVP28转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，获得重组菌株BL21(DE3)pLysS/pET28a-BVP28。将单克隆的重组菌接种于100mL Luria-Bertani(LB)液体培养基(含有终浓度为50mg/L卡那霉素)中，37℃、220rpm振荡培养至菌液浓度(OD600)达到0.7，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于25℃诱导培养16h；之后将发酵液12000rpm离心5min收集菌体，利用10mL 10mM的磷酸缓冲液重悬菌体，低温高压破碎菌体后12000rpm离心20mins收集裂解液上清；最后将裂解液上清用滤膜(孔径为0.45μm)过滤除杂后，利用组氨酸标签的镍柱纯化目标蛋白。对最终的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，与蛋白分子量标准(Marker)比对后显示纯化获得的蛋白与预计的BVP28蛋白分子量大小28.14kDa基本吻合，证明本发明的BVP28蛋白在大肠杆菌中成功表达并顺利纯化。
实施例2：
BVP28蛋白在防治叶螨类害螨中的应用：
参照联合国粮农组织(FAO)推荐的标准方法和我国农药室内生物测定试验准则(NY/T1154.12-2008)，采用叶螨玻片浸渍法检测BVP28蛋白对叶螨类害螨的杀灭活性。将双面胶带剪成2-3cm长的方形，贴在载玻片的一端，揭去胶带上的纸片，用0号毛笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，将其背部黏于双面胶上(注意：不要粘住螨足、螨须和口器)。在温度25℃、相对湿度85％的生化培养箱中放置2-3h后，用双目镜镜检，剔除死亡、受伤与不活泼个体。将实施例1中纯化获得的BVP28蛋白在预试基础上用10mM的磷酸缓冲液稀释5-7个浓度梯度，再将带螨玻片的一端浸于药液中轻轻振荡5s后取出，迅速吸去螨体及其周围的多余药液，随后置于上述生化培养箱中，24h后用双目镜观察试验结果。用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡。每个处理重复3次，另以浸渍10mM的磷酸缓冲液作为空白对照。统计各处理组中螨虫的死亡率，若对照组中的死亡率<5％，无需校正死亡率；若对照死亡率在5％-20％之间，则按公式校正死亡率＝(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)*100对处理组死亡率进行校正；若对照组死亡率>20％，本次实验需重做。
按照上述实验方法，纯化获得的BVP28蛋白对二斑叶螨(Tetranychus urticae)的生测结果如表1所示，死亡的螨虫表现出虫体裂解的表型，如图2所示。利用SPSS v22.0(IBM)数据处理软件计算获得BVP28蛋白杀灭二斑叶螨的概率单位模型方程为PROBIT(P)＝-1.291+2.117X(变量X使用底数为10的对数进行转换)。通过观察置信区间(如表2所示)，得到BVP28蛋白溶液处理二斑叶螨24h的LC50为4.07mg/L，95％置信区间为(3.76mg/L-4.41mg/L)，展现出良好的杀螨活性。
表1 BVP28对二斑叶螨的杀灭活性测定数据
表2二斑叶螨不同死亡概率所对应的BVP28蛋白浓度以及95％置信区间(部分)
按照上述实验步骤，测定了BVP28蛋白溶液对柑橘全爪螨(Panonychus citri)、麦长腿蜘蛛(Petrobia latens)的杀灭活性。SPSS v22.0数据处理软件计算获得BVP28蛋白处理柑橘全爪螨24h的LC50为6.39mg/L，95％置信区间为(5.56mg/L-7.7mg/L)；BVP28蛋白处理麦长腿蜘蛛24h的LC50为6.29mg/L，95％置信区间为(5.42mg/L-7.30mg/L)。表明BVP28蛋白对主要的叶螨类害虫均有较高杀灭活性。
实施例3：
BVP28蛋白在防治尘螨和粉螨中的应用
参照我国农药室内生物测定试验准则(NY/T 1154.6-2006)，采用改良的浸虫法检测BVP28蛋白对尘螨和粉螨的杀灭活性。将实施例1中纯化获得的BVP28蛋白在预试基础上用10mM的磷酸缓冲液稀释5-7个浓度梯度，挑取大小一致、行动活泼的成螨，将螨虫浸入药液5s后挑取到96孔板中，每个孔中挑取螨虫15-30头，随后置于温度25℃、相对湿度85％的生化培养箱中，24h后用倒置显微镜观察试验结果。用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡。每个处理重复3次，另以浸渍10mM的磷酸缓冲液作为空白对照。统计各处理组中螨虫的死亡率，若对照组中的死亡率<5％，无需校正死亡率；若对照死亡率在5％-20％之间，则按公式校正死亡率＝(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)*100对处理组死亡率进行校正；若对照组死亡率>20％，本次实验需重做。
按照上述实验方法，纯化获得的BVP28蛋白对主要尘螨——屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的生测结果如表3所示。利用SPSS v22.0数据处理软件计算获得BVP28蛋白杀灭屋尘螨的概率单位模型方程为PROBIT(P)＝-1.019+1.205X(变量X使用底数为10的对数进行转换)。通过观察置信区间(如表4所示)，得到BVP28蛋白溶液处理屋尘螨24h的LC50为7.01mg/L，95％置信区间为(4.73mg/L-10.43mg/L)，展现出良好的杀螨活性。
表3 BVP28对屋尘螨的杀灭活性测定数据
表4屋尘螨不同死亡概率所对应的BVP28蛋白浓度以及95％置信区间(部分)
按照上述实验步骤，测定了BVP28蛋白溶液对主要粉螨——腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae)的杀灭活性。SPSS v22.0数据处理软件计算获得BVP28蛋白处理腐食酪螨24h的LC50为13.50mg/L，95％置信区间为(8.59mg/L-22.93mg/L)，表明BVP28蛋白对主要的家居环境害螨和储粮螨害均有较高杀灭活性。
实施例4：
BVP28蛋白在杀灭螨卵中的应用
采用玻片浸渍法检测BVP28蛋白对二斑叶螨螨卵的杀灭活性。将双面胶带剪成2-3cm长的方形，贴在载玻片的一端，揭去胶带上的纸片，用0号毛笔挑取螨卵黏于双面胶上，每片玻片上挑取螨卵30粒左右。将实施例1中纯化获得的BVP28蛋白在预试基础上用10mM的磷酸缓冲液调整浓度至10mg/L，再将带螨卵玻片的一端浸于药液中轻轻振荡5s后取出，迅速吸去螨卵表面及其周围的多余药液，随后置于上述生化培养箱中，24h后用双目镜观察试验结果。螨卵破裂、皱缩的记为螨卵被杀灭，孵出1龄若螨的螨卵仍记为螨卵存活。每个处理重复3次，另以浸渍10mM的磷酸缓冲液作为空白对照。结果如表5所示，10mg/L的BVP28蛋白处理螨卵24h后，螨卵的平均杀灭率达到94.55％。被BVP28蛋白杀灭的螨卵出现裂解破碎的表型(图3)。该结果表明BVP28蛋白对螨卵也具有良好的杀灭活性。
表5 BVP28对二斑叶螨螨卵的杀灭活性测定数据
Claims (8)
1. 蛋白BVP28在防治螨害中的应用，所述的螨害包括植物螨害、家居环境螨害和/或粮储螨害，所述蛋白BVP28为SEQ ID NO.2所示。
2. 蛋白BVP28在制备防治害螨药剂中的应用，所述的害螨包括植物害螨、家居环境害螨和/或粮储害螨，所述蛋白BVP28为SEQ ID NO.2所示。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药剂是以SEQ ID NO.2所示蛋白作为活性成分之一，或者唯一有效成分。
4. 蛋白BVP28在杀灭螨卵中的应用，所述蛋白BVP28为SEQ ID NO.2所示。
5. 蛋白BVP28在制备螨卵杀灭剂中的应用，所述蛋白BVP28为SEQ ID NO.2所示。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述杀灭剂是以SEQ ID NO.2所示蛋白作为活性成分之一，或者唯一有效成分。
7. 根据权利要求3或6中的应用，其特征在于：当SEQ ID NO.2所示蛋白作为活性成分之一时，所述药剂或杀灭剂为含有SEQ ID NO.2所示蛋白的微生物发酵产物，或含有SEQ IDNO.2所示蛋白的复配制剂。
8. 根据权利要求1或2所述的应用，所述螨为二斑叶螨（Tetranychus urticae）、柑橘全爪螨（Panonychus citri）、麦长腿蜘蛛（Petrobia latens）、屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）和/或腐食酪螨（Tyrophagus putrescentiae）。
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