CN101019556A - 一种杀虫型复合功能菌剂Bt微胶体制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防治鳞翅目、直翅目、鞘翅目、双翅目等多种害虫的复合功能菌剂Bt的配方与工艺，同时还能对作物起到防病促生的作用。其特征在于以苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种ACCC10027、苏云金芽孢杆菌柏氏变种ACCC10022、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种ACCC10066的复合菌液为主要活体成分制成微胶体制剂。

Description

一种杀虫型复合功能菌剂Bt微胶体制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种防治鳞翅目、直翅目、鞘翅目、双翅目等多种害虫的复合功能菌剂Bt的制备方法。

背景技术

农业生产中比较难防治的害虫种类，如：鳞翅目的菜青虫、小菜蛾、松毛虫，直翅目的东亚飞蝗，鞘翅目的金龟甲，双翅目的蚊蝇类等，每年在全国各区域都有大规模的发生，使得农产品产量下降、品质降低，某些发生严重的地区甚至绝收。

本发明以3个Bt菌株(苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种ACCC10027、苏云金芽孢杆菌柏氏变种ACCC10022、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种ACCC10066，均来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，见《中国农业菌种目录》中国，中国农业微生物菌种保藏管理中心编，2005年版，中国农业科学技术出版社，18-21页)为菌源进行菌剂发酵，在发酵菌液中添加载体物质(海藻酸，在水溶液中以微胶体的形式存在，)、增效剂(腐殖酸)、表面活性剂(鼠李糖脂)、电解质(硝酸钙)，使得复合的活体Bt菌以载体物质(海藻酸)为核心吸附在海藻酸胶体周围，海藻酸胶体吸附Ca²⁺形成带正电荷的阳离子微胶体(直径在1-10nm)，通过微胶体间的电荷排斥作用使得活体Bt菌均匀悬浮在液剂中，经过实验室的生物测定与田间的实际应用筛选出杀虫效果比较好的杀虫型复合功能菌剂Bt微胶体制剂的配方与工艺。

本发明杀虫型复合功能菌剂Bt微胶体制剂中的三个微生物菌株之间充分发挥协同互补的优势，可以分泌杀虫酶类(几丁质酶、磷脂酶C、溶血素、VIP杀虫蛋白)、醇类(双效菌素)、核苷类(苏云金素)、蛋白质(杀虫晶体蛋白、免疫抑制因子、肠毒素)、活芽孢。

发明内容

一、复合互生的活体菌剂的培养方法

1、营养肉汁蛋白胨培养基的制备

培养基配方：蛋白胨-5克：NaCI-5克；牛肉膏-5克；；酵母膏-3克：5-硝基愈创木酚钠(促进菌落快速良好生长)-1毫升：MnSO₄·H₂O-5毫克；营养琼脂-15克；添加蒸馏水至1000毫升；PH值6.5-7.2。121℃高压灭菌30分钟。取出冷却至60℃左右，在超洁净工作台上，于无菌条件下倒入灭过菌的培养皿中，分别将苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种ACCC10027、苏云金芽孢杆菌柏氏变种ACCC10022、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种ACCC10066转到营养肉汁蛋白胨培养基中培养，于30℃培养箱中培养72小时，然后进行生物测定。

2、生物测定将培养好的苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种ACCC10027、苏云金芽孢杆菌柏氏变种ACCC10022、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种ACCC10066分别制成浓度为100万/毫升的菌液100毫升，然后各取25毫升和以1∶1∶1的比例配成混合菌液。将配好的上述菌液，分别浸泡新鲜的甘蓝叶，将从田间采集到的鲜活菜青虫，粘虫，放到浸泡过的叶子上在30℃室温中饲养，测定对菜青虫与粘虫的杀虫效果。(杀虫效果见表1)。

表1、ACCC10022、ACCC10027、ACCC10066的杀虫效果

名称	ACCC10022	ACCC10027	ACCC10066	混合菌液
					菜青虫	82.5％	75.3％	78.1％	98.2％
小菜蛾	82.2％	77.5％	76.7％	96.5％
					菜粉蝶	76.3％	78.4％	83.3％	95.3％

从表1可以看出苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种ACCC10027、苏云金芽孢杆菌柏氏变种ACCC10022、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种ACCC10066本身杀虫效果不是很高，但是经过混合以后，三者发挥复合共生的作用，共同抑菌杀虫的效果得到了显著的提高。

3、拮抗试验

苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种ACCC10027、苏云金芽孢杆菌柏氏变种ACCC10022、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种ACCC10066分别两两组合，在营养肉汁蛋白胨培养基上，两点放置相距4cm，每个组合重复三次，进行交叉拮抗试验，结果表明三者相互之间不存在拮抗，能够共同生长。将三者以1∶1∶1的比例混合配制成复合共生的“功能菌液”，然后在营养肉汁蛋白胨培养基上共同培养，试验表明三者能够共同均匀地生长.

二、活体互生的杀虫菌剂的制备与发酵工艺

1、菌液的制备：营养肉汁蛋白胨培养液配方：蛋白胨-5克；NaCl-5克；牛肉膏-3克；0.2％的5-硝基愈创木酚钠(促进菌落快速良好生长)-1毫升：MgSO₄·H₂O-0.005克；PH值6.5-7.2。

按上述配方将营养肉汁蛋白胨培养基配制好后，倒入三角摇瓶中，然后121℃高压灭菌30分钟，待冷却后在超净工作台上，在无菌操作的条件下，将保存培养苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种ACCC10027、苏云金芽孢杆菌柏氏变种ACCC10022、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种ACCC10066的三个菌株各自配成菌液，分别接种到三角摇瓶中，每瓶接种比例为3％，在30℃条件下于摇床上振荡培养72小时后，将三个菌株的菌液以1∶1∶1的比例混合摇匀，然后以3％的比例接种到发酵罐。

2、复合互生的活体杀虫菌剂的发酵

发酵罐营养液配方：蛋白胨-0.5％；NaCI-0.5％；牛肉膏-0.3％；MgSO₄·H₂O-0.5‰克；5-硝基愈创木酚钠(促进菌落快速良好生长)2ppm；PH值6.5-7.2。罐体装料后在121℃，0.12MPa下灭菌30分钟。冷却至30℃左右后按3％的比例接种；培养温度30℃，通气量开始在1∶1(v.v.m)，培养24小时后增至1∶1.5(v.v.m)，48小时后降至1∶1.2(v.v.m)。发酵至72小时发酵完毕，经过镜检苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种ACCC10027、苏云金芽孢杆菌柏氏变种ACCC10022、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种ACCC10066的比例在1∶1∶1左右，含菌量达到80-100亿/毫升时为合格菌液。

3、微胶体制剂的配制

在发酵菌液中添加30％的载体物质(海藻酸，在水溶液中以微胶体的形式存在，)、3％增效剂(腐殖酸)、1％表面活性剂(鼠李糖脂)、3％电解质(硝酸钙)、3％螯合剂(EDTA)，使得复合的活体Bt菌以载体物质(海藻酸)为核心吸附在海藻酸胶体周围，海藻酸胶体吸附Ca²⁺形成带正电荷的阳离子微胶体(直径在1-10nm)，通过微胶体间的电荷排斥作用使得活体Bt菌均匀悬浮在液剂中，然后计量包装制成复合功能菌剂Bt的微胶体制剂。

具体实施方法

本复合功能菌剂Bt的微胶体制剂适用于：玉米、甘蓝、大白菜、西兰花、黄瓜、辣椒、茄子、西红柿、果树等多种植物，对鳞翅目的菜青虫、小菜蛾、松毛虫，直翅目的东亚飞蝗，鞘翅目的金龟甲，双翅目的蚊蝇类等都有很好的效果。稀释1000倍后喷施。

本发明具有如下优点：

1.本发明是一种杀虫型复合功能菌剂Bt的微胶体制剂，对菜青虫、小菜蛾、螟虫等具有显著药效。

2.本发明对环境、人畜、天敌及其它有益生物安全，且害虫不易对其产生抗药性。

3.本发明复合功能菌剂Bt的微胶体制剂贮存稳定性良好，保质期在1年以上。

实例1、将复合功能菌剂Bt的微胶体制剂配成1000倍液，做防治菜青虫田间药效试验，每次处理重复3次，分别于施药后2天，4天，6天调查幼虫的数量。实验统计结果表明，对菜青虫的2、4、6天的防治效果为56.4％、77.6％、95.5％。

实施例2、将复合功能菌剂Bt的微胶体制剂配成1000倍液，做防治小菜蛾田间药效试验，按实施例1的田间试验方法。得出结果表明，对小菜蛾的2、4、6天的防治效果为50.4％、73.6％、91.6％。

实例3、将复合功能菌剂Bt的微胶体制剂配成1000倍液，做防治菜粉蝶田间药效试验，按实施例1的田间试验方法。实验统计结果表明，对菜粉蝶的2、4、6天的防治效果为56.8％、72.8％、94.1％。

Claims (3)

1.本发明涉及一种防治鳞翅目、直翅目、鞘翅目、双翅目等多种害虫的复合功能菌剂Bt微胶体制剂的制备方法，其特征在于该复合功能菌剂由苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种ACCC10027、苏云金芽孢杆菌柏氏变种ACCC10022、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种ACCC10066三个菌株组成，其比例为1∶1∶1。

2.根据权利要求1所述的复合功能菌剂Bt微胶体制剂，在苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种ACCC10027、苏云金芽孢杆菌柏氏变种ACCC10022、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种ACCC10066(比例为1∶1∶1)的复合菌液中添加30％的载体物质(海藻酸，在水溶液中以微胶体的形式存在，)、3％增效剂(腐殖酸)、1％表面活性剂(鼠李糖酯)、3％电解质(硝酸钙)、3％螯合剂(EDTA)，使得复合的活体Bt菌以载体物质(海藻酸)为核心吸附在海藻酸胶体周围，海藻酸胶体吸附Ca2+形成带正电荷的阳离子微胶体(直径在1-10nm)，制成复合功能菌剂Bt的微胶体制剂。

3.根据权利要求1所述的复合功能菌剂Bt微胶体制剂，用于防治：鳞翅目的菜青虫、小菜蛾、松毛虫，直翅目的东亚飞蝗，鞘翅目的金龟甲，双翅目的蚊蝇类。