CN103333831A - 短稳杆菌gxw15-4野外驯化提纯方法 - Google Patents

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Abstract

短稳杆菌GXW15-4野外驯化提纯方法是一种将保藏在中国典型培养物保藏中心的短稳杆菌（拉丁文学名为Empedobacterbrevis ，保藏编号：CCTCC NO：M202046）GXW15-4驯化，使之保持对鳞翅目害虫较高致死活性，并提纯作为原种用于产业化生产的方法。短稳杆菌GXW15-4是解剖罹病死亡的害虫尸体分离、获得的一种植物害虫病原细菌。短稳杆菌GXW15-4在工厂化条件下重复繁殖，其杀虫活性会逐渐下降，且杂菌含量会逐渐提高，经野外驯化、提纯后的短稳杆菌GXW15-4能够适应短稳杆菌杀虫剂工厂化培育的要求，且对植物鳞翅目害虫杀虫效果好，对植物本身、对植物害虫天敌、对人畜禽都安全。

Description

短稳杆菌GXW15-4野外驯化提纯方法
技术领域
本发明涉及对中国典型培养物保藏中心保藏的短稳杆菌（拉丁文学名为Empedobacter brevis）GXW15-4进行野外驯化、提纯，使之保持较高的杀虫活性，制备成适合短稳杆菌杀虫剂产业化生产用原种的方法，属于微生物技术领域。 
背景技术
植物的主要害虫是鳞翅目害虫。长期使用化学农药不仅导致农产品化学残留量加大，而且导致害虫对化学农药的抗药性增强，药效显著降低。例如，大剂量的常规化学杀虫剂对蔬菜小菜蛾、斜纹夜蛾、水稻纵卷叶螟等主要鳞翅目害虫的杀虫效果也只有60%甚至更低，农产品生产者和消费者因此对化学农药的使用普遍担忧。 
就对化学农药抗药性较强的小菜蛾、斜纹夜蛾、水稻纵卷叶螟等重大鳞翅目害虫的生物农药开发应用而言，国内外市场上主要产品仍然是50年前由日本人研究制造成功的苏云金杆菌杀虫剂（BT），长期使用也出现药效下降趋势。短稳杆菌杀虫剂是本公司自主开发成功的一种全新的细菌性杀虫剂，国内外首创，截止2013年3月已取得国家新农药全部生产许可证，同时取得中国绿色食品生产资料证书，现已正式投产，有希望成为苏云金杆菌杀虫剂（BT）理想的替代产品。 
需要指出的是：近年来，国内外农药市场上出现了一些植物源杀虫剂品种，但因植物源杀虫剂受植物品种和资源限制，产业化生产难度较大，且因植物源杀虫剂开发成本普遍较高，农户选择使用植物源杀虫剂的积极性不高。 
  
发明内容
短稳杆菌Empedobacter brevis（菌株号：GXW15-4）是镇江市润宇生物科技开发有限公司高级农艺师高小文于2001年9月解剖罹病死亡的斜纹夜蛾尸体发现的一种植物害虫病原菌。该菌于2002年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号CCTCC NO：M202046，保藏单位地址：武汉市武昌区珞珈山武汉大学。 
短稳杆菌GXW15-4个体形态特征为：菌体呈短杆状，长2.6-3.8μm，宽0.8-1.1μm，两端钝圆，无鞭毛，用扫描电镜观察其内部有约1μm3的正方晶体状。 
依据中国科学院微生物研究所检测鉴定报告（[2009]微检字第175号），短稳杆菌GXW15-4理化试验结果见表1： 
表1  短稳杆菌农药理化试验结果（BIOLIG GN2）表
Figure 20131026919551000021
短稳杆菌GXW15-4再生能力强，可在工厂化条件下大量繁殖，但在重复繁殖过程中往往会出现其杀虫活性下降现象。本发明是通过对中国典型培养物保藏中心保藏的短稳杆菌GXW15-4进行野外驯化、提纯手段保持其具有较高的杀虫活性、获得可以适合短稳杆菌杀虫剂产业化生产的优良菌种的一种方法。
本发明的产物是获得可以用于工厂化生产短稳杆菌杀虫剂的短稳杆菌GXW15-4原种。 
   具体实施方式
1、短稳杆菌GXW15-4野外驯化方式
野外驯化短稳杆菌GXW15-4步骤如下：
步骤一、在晴天室外温度370C以上的夏季烈日下，将短稳杆菌杀虫剂按常规用药方法喷施在有4龄以上小菜蛾或者斜纹夜蛾幼虫的田间植物体上，喷施在植物体上的短稳杆菌GXW15-4经白天紫外线照射后，让小菜蛾或者斜纹夜蛾高龄幼虫在夜间捕食并经口进入其体内；
步骤二、选择药后2天内死亡的小菜蛾或者斜纹夜蛾高龄幼虫尸体，晒干备用；
步骤三、将干瘪的小菜蛾或者斜纹夜蛾幼虫尸体粉碎后均匀撒布于无菌琼脂培养皿中培养24小时，获得野外驯化1次、含有高浓度短稳杆菌GXW15-4的混合物质；
步骤四、将获得的混合物质稀释，按照前（1）～（3）的步骤重复2次以上，获得野外驯化3次以上、含有高浓度短稳杆菌GXW15-4的混合物质。
2、驯化后的短稳杆菌GXW15-4提纯方式 
提纯短稳杆菌GXW15-4是根据短稳杆菌GXW15-4 特征采取非相同特征淘汰法获得杂菌率小于2%的短稳杆菌GXW15-4优良原种的方法，步骤如下：
步骤一、提取野外驯化3次以上、含有高浓度短稳杆菌GXW15-4的混合物质，用无菌水稀释并涂布接种在无菌的琼脂培养皿中，在370C条件下培养24小时；
步骤二、在JSM-7001F扫描电镜下观察菌落，选择并挑取菌株呈黄色、短杆状、两端钝圆、边缘光滑完整的15个菌落，将菌落逐个稀释、涂布、接种在与菌落数相同的15个无菌琼脂培养皿中分别在370C条件下培养24小时；
步骤三、将15个培养皿中的培养物分别用无菌水冲洗，形成15种菌液，再用移液器分别提取1ml，分别稀释至10-5～10-6，再分别取0.01ml于2cm2的载玻片上烤干后制成喷铂金载玻片，用JSM-700IF扫描电镜分析仪观察，将未出现约1μm3的正方体荧光色晶体的视为非短稳杆菌GXW15-4培养物，将提取该培养液的培养皿中的培养物淘汰之；
步骤四、将剩余的培养皿中的培养物分别取样、用革兰氏染色法染色，在油镜下观察，选择菌体被染成红色的阴性菌比率在98%以上的培养物作为原种用于短稳杆菌杀虫剂生产。
3、用野外驯化、提纯后的短稳杆菌GXW15-4生产出来的短稳杆菌悬浮剂杀虫效果 
（1）对高抗化学杀虫剂的小菜蛾致死效果
据山东省农科院植保所试验，100亿孢子/ml短稳杆菌悬浮剂防治小菜蛾，药后7～10天的防效为：800倍液处理的药效为95%左右，1000倍液处理的防效为90%左右（表1）。
表1  100亿孢子/ml短稳杆菌悬浮剂对小菜蛾防效   山东青州 
Figure 414619DEST_PATH_IMAGE004
（2）对高抗化学杀虫剂的斜纹夜蛾致死效果
据山东省农科院植保所试验，100亿孢子/ml短稳杆菌悬浮剂防治斜纹夜蛾，药后7～10天的防效为：800倍液处理的药效为91%左右，1000倍液处理的防效为83%左右（表2）。
表2  100亿孢子/ml短稳杆菌悬浮剂对斜纹夜蛾防效   山东费城 
Figure 194356DEST_PATH_IMAGE006
（3）对高抗化学农药的稻纵卷叶螟致死效果
据江苏省农药检定所2011年试验，100亿孢子/ml短稳杆菌悬浮剂防治稻纵卷叶螟，药后13天的防效为79～94%，防效随施药量的适当加大有所提高（表3）。
表3  100亿孢子/ml短稳杆菌悬浮剂对稻纵叶螟防效  江苏句容 
Figure 527249DEST_PATH_IMAGE008
依据中国科学院微生物研究所检测鉴定报告（[2009]微检字第175号），短稳杆菌GXW15-4的16SrRNA基因序列为：
AACATGCAAGCCGAGGGGTACGATTCTTTCGGGAATCTGAGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATGCAACTTGCCCTACTGAAAAGGATAGCCCTTCGAAAGGAGGATTAATACTTTATAACAGATTGAATGGCATCATTTAATTTTGAAAGATTTATCGCAGTAGGATAGGCATGCGTAAGATTAGTTAGTTGGAGAGGTAACGGCTCACCAAGACGATGATCTTTAGGGGGCCTGAGAGGGTGAACCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGTGGAAGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTAGGATGACTGCCTTATGGGTTGTAAACTACTTTTATCTGGGGATAAACCTACTCACGTGTGAGTAGCTGAAGGTACCAGAAGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGATTAATCAGTCAGTGGTGAAATCCCGCAGCTTAACTGTGGAACTGCCATTGATACTGTTAGTCTTGAGTGATGTTGAAGTGGCTGGAATGTGTAGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATTACGCAGAACACCAATTGCGAAGGCAGGTCACTAAGTATCAACTGACGCTGATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTTGCTGTTGGGGTTTCGGCTTCAGTGGCTAAGCGAAAGTTATAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAGGCTTAAATGCATAATGACAGATCTAGAAATAGATTTTTCTTCGGACAGAATGCAAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTATCATTAGTTGCCAGCGTTTAAAGACGGGGACTCTAATGAGACTGCCGGTGCAAACCGCGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCACGGCCCTTACGTCTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAAGTACAGAGGGCAGCTACTTGGCAACAAGATGCGAATCTCGAAAACTTATCTCAGTTCGGATTGGAGTTTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCATATCAGCCATGATGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCTGGGGGTACCTGAAGTCGGTGACCGTAAAAGGAGCTGCATAAGTTAG。
申请人：镇江市润宇生物科技开发有限公司，高小文;
专利申请名称：短稳杆菌GXW15-4野外驯化提纯方法；
短稳杆菌GXW15-4的16SrRNA基因序列
AACATGCAAGCCGAGGGGTACGATTCTTTCGGGAATCTGAGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATGCAACTTGCCCTACTGAAAAGGATAGCCCTTCGAAAGGAGGATTAATACTTTATAACAGATTGAATGGCATCATTTAATTTTGAAAGATTTATCGCAGTAGGATAGGCATGCGTAAGATTAGTTAGTTGGAGAGGTAACGGCTCACCAAGACGATGATCTTTAGGGGGCCTGAGAGGGTGAACCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGTGGAAGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTAGGATGACTGCCTTATGGGTTGTAAACTACTTTTATCTGGGGATAAACCTACTCACGTGTGAGTAGCTGAAGGTACCAGAAGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGATTAATCAGTCAGTGGTGAAATCCCGCAGCTTAACTGTGGAACTGCCATTGATACTGTTAGTCTTGAGTGATGTTGAAGTGGCTGGAATGTGTAGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATTACGCAGAACACCAATTGCGAAGGCAGGTCACTAAGTATCAACTGACGCTGATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTTGCTGTTGGGGTTTCGGCTTCAGTGGCTAAGCGAAAGTTATAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAGGCTTAAATGCATAATGACAGATCTAGAAATAGATTTTTCTTCGGACAGAATGCAAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTATCATTAGTTGCCAGCGTTTAAAGACGGGGACTCTAATGAGACTGCCGGTGCAAACCGCGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCACGGCCCTTACGTCTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAAGTACAGAGGGCAGCTACTTGGCAACAAGATGCGAATCTCGAAAACTTATCTCAGTTCGGATTGGAGTTTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCATATCAGCCATGATGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCTGGGGGTACCTGAAGTCGGTGACCGTAAAAGGAGCTGCATAAGTTAG
依据：中国科学院微生物研究所检测鉴定报告（[2009]微检字第175号）。

Claims (3)

1.短稳杆菌GXW15-4野外驯化提纯方法是对保藏在中国典型培养物保藏中心的短稳杆菌（拉丁文学名为Empedobacter brevis，保藏编号CCTCC  NO：M 202046）GXW15-4进行野外驯化、提纯，使之保持较强杀虫活并成为能够用于工厂化生产的原种的方法，其特征在于：经野外驯化、提纯培育的菌种能够保持对高抗化学杀虫剂的蔬菜小菜蛾、斜纹夜蛾、水稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫致死效果在85%以上并能够用于短稳杆菌杀虫剂工厂化生产。
2.根据权利要求1所述的野外驯化短稳杆菌GXW15-4，其特征包括以下步骤：
（1）在晴天室外温度370C以上的夏季烈日下，将短稳杆菌杀虫剂按常规用药方法喷施在有4龄以上小菜蛾或者斜纹夜蛾幼虫的田间植物体上，喷施在植物体上的短稳杆菌GXW15-4经白天紫外线照射后，让小菜蛾或者斜纹夜蛾高龄幼虫在夜间捕食并经口进入其体内；
（2）选择药后1～2天死亡的小菜蛾或者斜纹夜蛾高龄幼虫尸体，晒干备用；
（3）将干瘪的小菜蛾或者斜纹夜蛾幼虫尸体粉碎后均匀撒布于无菌琼脂培养皿中培养24小时，获得野外驯化1次、含有较高纯度的短稳杆菌GXW15-4混合物质；
（4）将获得的混合物质稀释，按照前（1）～（3）的步骤重复2次以上，获得野外驯化3次以上、含有高浓度短稳杆菌GXW15-4的混合物质。
3.根据权利要求1所述的提纯短稳杆菌GXW15-4是根据短稳杆菌GXW15-4 特征采取非相同特征淘汰法获得杂菌率小于2%的短稳杆菌GXW15-4优良原种的方法，其特征包括以下步骤：
（1）提取野外驯化3次以上、含有高浓度短稳杆菌GXW15-4的混合物质，用无菌水稀释并涂布接种在无菌的琼脂培养皿中，在370C条件下培养24小时；
（2）在JSM-7001F扫描电镜下观察菌落，选择并挑取菌株呈黄色、短杆状、两端钝圆、边缘光滑完整的15个菌落，将菌落逐个稀释、涂布、接种在与菌落数相同的15个无菌琼脂培养皿中分别在370C条件下培养24小时；
（3）将15个培养皿中的培养物分别用无菌水冲洗，形成15种菌液，再用移液器分别提取1ml，分别稀释至10-5～10-6，再分别取0.01ml于2cm2的载玻片上烤干后制成喷铂金载玻片，用JSM-700IF扫描电镜分析仪观察，将未出现约1μm3的正方体荧光色晶体的视为非短稳杆菌GXW15-4培养物，将提取该培养液的培养皿中的培养物淘汰之；
（4）将剩余的培养皿中的培养物分别取样、用革兰氏染色法染色，在油镜下观察，选择菌体被染成红色的阴性菌比率在98%以上的培养物作为原种用于短稳杆菌杀虫剂生产。
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