CN105754873A - 一种药剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种药剂，特别涉及一种农药药剂及其应用。所述药剂包括微生物和能够使所述微生物增殖的营养组分。在施用本发明的药剂后，特别是温湿度等条件最为合适的情况下，有利于药剂中的活体微生物的增殖，从而有利于微生物药剂药效的提高，进而本发明的药剂具有较高的应用潜力。

Description

一种药剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种药剂，特别涉及一种农药药剂及其应用。
背景技术
微生物杀虫剂具有(1)对脊椎动物和人类无害，特异性强；(2)有自然传播感染的能力；(3)害虫不易产生抗药性；(4)能保护害虫天敌；(5)容易进行生产；(6)不污染环境等特点
然而活体微生物容易受到外界环境如温度、湿度等因素的影响。并且一般来讲，微生物杀虫剂在田间中对病虫害的防治效果慢于化学农药。与此同时，微生物杀虫剂成本也远高于化学农药，因此其在田间应用过程中往往出现活菌含量低、用量大、成本高、杀虫活性低等问题，这些都大大限制了微生物杀虫剂在农业上的大规模应用。
因此，有必要开发出一种能够扩大微生物使用的药剂。
发明内容
本发明提供了一种药剂，其包括微生物和能够使所述微生物增殖的营养组分。由于药剂中含有能够使微生物增殖的营养组分，因此，在施用本发明的药剂后，特别是温湿度等条件最为合适的情况下，有利于药剂中的活体微生物的增殖，从而有利于微生物药剂药效的提高，进而本发明的药剂具有较高的应用潜力。
在本发明中，所述微生物为细菌和/或真菌。
在本发明优选的方式中，所述细菌为芽胞杆菌(Bacillus)；更优选所述微生物为苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)、萎缩芽胞杆菌(Bacillusatrophaeus，Ba)和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis，Bs)中的至少一种。
其中，苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)，它及其所产生的具有杀虫活性的伴胞晶体蛋白普遍存在于自然环境中，对昆虫具有特异性杀虫活性。从1992年发现第一株对蛴螬有特异性杀虫活性的Bt菌株并克隆到cry8Ca1基因以来，国内外一直围绕利用Bt防治蛴螬进行研究，到目前为止，已经发现了cry3、cry8、cry23、cry37、cry43等对蛴螬有杀虫活性的Bt基因。到2000年，我国也首次发现了对黄褐丽金龟幼虫和铜绿丽金龟幼虫有较高杀虫活性的HBF-1菌株，随后又发现了能杀灭暗黑鳃金龟幼虫的BtSU4菌株和Bt185菌株以及对大黑鳃金龟幼虫有活性的HBF-18菌株和B-JJX菌株；此外，中国农业科学院植物保护研究所还构建了扩大杀虫谱的工程菌株BIOT185并进行了田间防效和安全性评价，这些都为利用Bt防治地下害虫蛴螬奠定了基础。
在本发明优选的方式中，所述真菌为白僵菌(Beauveria)、绿僵菌(Metarhizium)和木霉(Trichoderma)中的至少一种。
在本发明中，所述营养组分包括花生粕。本发明的营养组分的营养成分高、价格低廉，并有利于菌体在土壤、植物叶片等环境中增殖，从而将菌种发酵由工厂转移到田间，既大大降低了微生物制剂的成本，也保证了菌种的活性，提高了其在田间的杀虫效果。
在本发明中，所述营养组分的重量占所述药剂总重量的10-99.5％；优选为20-80％；更优选为40-60％。
在本发明中，所述的营养组分为膨化处理后的营养组分。
在本发明中，所述药剂中还包括微晶纤维素。
在本发明中，所述药剂为颗粒剂。
在本发明中，所述颗粒剂的体积为5-500立方毫米，优选所述颗粒剂的体积为25-150立方毫米。
在本发明中，所述营养组分的重量占与所述营养组分与所述微晶纤维素总重量的40-99％；优选为40-70％。
本发明还提供了本发明的药剂在防治植物病虫害中的应用。
在本发明中，所述的药剂在防治植物的地下病虫害中的应用。
在本发明中，所述的药剂在防治金龟子(Scarabaeoidea)幼虫中的应用。
其中，蛴螬，俗称土蚕，是鞘翅目(Coleoptera)金龟总科(Scarabaeoidea)，特别是金龟子科(Scarabeidae)幼虫的总称。我国已记载的蛴螬种类有约1800种，其中能对农业、林业和牧草造成危害的有大约110种，以华北大黑鳃金龟(Holotrichiaoblita)、暗黑鳃金龟(H.parallela)、铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)在我国分布最广，因其种类多、分布广，是危害最为严重的地下害虫，据调查统计，植物地下部分的损失86％是由蛴螬造成的。蛴螬不仅为害小麦、玉米等粮食作物，还会对花生、大豆等经济作物造成损失。其成虫喜食果树、林木的叶和花器等；幼虫则终生栖居土中，取食种子、根、块根、块茎以及幼苗等，造成缺苗断垄。据调查，单头蛴螬幼虫在花生生长期对有效果为害可达3.8个，此外还会为害部分果皮，造成荚果霉烂。
蛴螬因长期生存于土壤中危害隐蔽，且生活史较长，故难以预测和防治。近年来，浅耕、免耕和滴灌等栽培方式的大面积推广为蛴螬提供了良好的栖息、取食和繁殖场所；此外，全球气候变暖也为蛴螬越冬、发育创造了有利条件，导致其数量增加。
本发明的药剂达到提高了对蛴螬的防治效果。例如，根据本发明的实施例，通过对暗黑鳃金龟幼虫进行生物活性测定，发现在相同Bt菌量情况下，加入花生粕的颗粒剂比未加入的其杀虫活性提高了41.7％。
此外，本发明还提供了一种药剂的制备方法，其包括将微生物和能够使所述微生物增殖的营养组分混合，压制成颗粒。
在本发明中，将能够使所述微生物增殖的营养组分进行膨化处理。
附图说明
图1为Bt菌株在不同的营养物质上的生长状态。根据图片可以明显地看出Bt菌株HD73和Bt185在花生粕中的生长状态最好，其次是LB培养基，而玉米浆膏和豆粕几乎不生长。
图2为Bt185菌株和HD73菌株在花生粕培养基和LB培养基中生长48小时后的菌体和/或晶体形态图。
图3为对花生粕膨化处理后，其在不同浓度下对Bt菌株的单位含菌量的影响。
图4为含有花生粕的Bt颗粒剂内的Bt活菌数量在无菌条件下的变化。
图5为含有花生粕的Bt颗粒剂的活菌数量在土壤中的变化。
图6为几种生防菌在膨化后的花生粕上的生长情况。其中，2575为绿僵菌(Metarhizium)；Ba59和Ba75均为萎缩芽胞杆菌(Bacillusatrophaeus)；Bs54、Bs70和B916均为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)芽胞杆菌；610和437均为木霉(Trichodermaspp.)。
具体实施方式
以下通过优选的实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。
实施例1
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株和昆虫
苏云金芽胞杆菌野生菌HD73菌株(携带cry1Ac基因)为实验室常用模式菌株；苏云金芽胞杆菌野生菌Bt185菌株(携带cry8Ea1基因)对暗黑鳃金龟有较高的杀虫活性，其LC50为0.9464×108cfu/mL(Yu,H.,etal.,CharacterizationofBacillusthuringiensisStrainBt185ToxictotheAsianCockchafer:Holotrichiaparallela.CurrentMicrobiology,2006.53(1):p.13-17.)；萎缩芽胞杆菌(Bacillusatrophaeus)Ba59、Ba75与枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)Bs54、Bs70分离自棉花的根部；绿僵菌(Metarhizium)菌株2575由浙江大学方卫国教师惠赠；木霉(Trichodermaspp.)菌株610和437由蒋细良研究员惠赠；苏云金芽胞杆菌工程菌Bt185-gfp菌株(携带cry8Ea1基因和gfp基因，卡那霉素抗性)；暗黑鳃金龟幼虫由沧州市农林科学院植保所提供。
将可以在Bt菌株中正常表达的绿色荧光标记基因gfp(杨慧，融融，宋福平等，苏云金芽胞杆菌中荧光分析融合杀虫晶体蛋白的形成，中国科学：生命科学2010，(8)：738-744。)插入到Bt-大肠杆菌穿梭表达载体pSTK(WangG,JieZ,SongF,WuJ,FengS,HuangD.EngineeredBacilusthuringiensisGO33AwithbroadinsecticidalactivityagainstLepidopteranandColeopteranpests.AppliedMicrobiology&Biotechnology2006；72(5):924-930.)的酶切位点BamHI与SalI之间，构建出pSTK-gfp表达载体，用于Bt菌株Bt185的标记。将pSTK-gfp表达载体转化入野生菌Bt185菌株中，构建工程菌Bt185-gfp菌株，其携带卡那霉素抗性基因。
1.1.2培养基
液体LB：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，1％NaCl，121℃灭菌20min。
LB固体培养基：1％NaCl，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.3％琼脂粉，121℃高温灭菌20min。
花生粕固体培养基：5％花生粕粉，1.3％琼脂粉，121℃高温灭菌20min。
豆粕固体培养基：5％豆粕粉，1.3％琼脂粉，121℃高温灭菌20min。
玉米浆膏固体培养基：5％玉米浆膏，1.3％琼脂粉，调节pH为7.0～7.5，121℃高温灭菌20min。
固体琼脂：1.5％琼脂粉，121℃灭菌20min。
豆粕、玉米浆膏、花生粕和微晶纤维素等常用试剂均购自北京冰达生物技术有限公司。
1.2方法
1.2.1膨化处理
花生粕内含有一些杂菌，这些杂菌的存在可能会影响Bt对花生粕的利用，尤其是当Bt制剂应用于田间时，颗粒剂内滋生的杂菌也会大大影响其在田间的杀虫效果，因此，本发明在利用花生粕制备颗粒剂之前先通过高温膨化对花生粕进行处理，达到杀灭杂菌的目的。
膨化机为国产干法膨化机(圣德M-31，广东高广机械公司)，内轴转速为440-500rpm/min，配用动力为4kw、380V，生产效率为125-200kg/h。
将花生粕以20％的量加入蒸馏水，即加入的蒸馏水的体积为花生粕质量的20％，搅拌均匀后，取出一部分部分加入到运转的膨化机内，将从膨化机内输出的产出物再次加入膨化机内，如此反复操作对膨化机进行预热，直至产出物为干燥的细条状物质，膨化机预热工作结束，将剩余花生粕缓慢加入膨化机内，产出物即为膨化处理的花生粕。
1.2.2平板菌落计数法
将待测菌液样品混匀后吸取100μL，加入900μL灭菌水中，以10n进行梯度稀释(其中，n为正整数)，稀释到适当梯度后将该梯度菌液及上一梯度菌液取200μL均匀涂布于平板表面，将其置于30℃恒温培养箱中培养48h，统计平板表面单菌落数量(菌落数量在20-300个区间内较为适宜)，计算原菌液活菌浓度并利用SPASS13.0对数据进行处理。
1.2.3颗粒压制方法
压片机为国产电动涡轮单冲压片机TDP-5，最大压片压力为15kN，最大压片直径为12mm，最大填充深度为12mm，最大片剂厚度为6mm，生产效率为4000片/h，电动机功率为0.75kw。
将膨化处理的花生粕打碎成粉状，与辅料微晶纤维素以2:1比例均匀混合，再以0.5％质量比加入制备的Bt185-gfp菌粉，混合均匀，利用压片机压制成粒径为直径6mm，厚度为3mm的片状颗粒。空白对照为仅含有Bt菌粉与微晶纤维素。
1.2.4生物活性测定
将马铃薯丝(2mm×2mm×50mm)和花生粕颗粒剂(Bt185活菌含量为(5.90±0.53)×106cfu/粒)放入12孔板内(每孔一个)，之后用经紫外线处理(40W，5h)的含水量为20％的土壤覆盖，等待30～60min后，每孔接入1头5～7d龄的健康、个体大小均匀的暗黑鳃金龟幼虫，每板为一个处理，重复3次，以微晶纤维素压制的颗粒剂(Bt185菌粉含量为活菌含量为(5.90±0.53)×106cfu/粒)处理为对照组。在温度为28℃，湿度为40～50％的人工气候箱中饲养，以未加菌粉的花生粕颗粒和微晶纤维素颗粒为阴性对照，在第7天时分别统计死虫数和活虫数，并计算其死亡率。
2.实验结果与分析
2.1营养物质的筛选
为了测试Bt利用营养物质的生长情况，首先制备花生粕、玉米浆膏、豆粕、LB等固体培养基平板，进行稀释涂板接种培养，30℃培养48小时后，比较苏云金芽胞杆菌HD73和Bt185菌株在上述培养基上的生长情况。结果显示(图1)，不同培养基质对Bt生长效果有较大的差异，花生粕对两株Bt菌株均有较好的效果，与实验室常用的LB培养基基本一致，而豆粕和玉米浆膏培养基未见到菌落，Bt不能生长，因此在本发明中选用花生粕作为培养基质用于进一步的分析。进一步检测了Bt菌株在花生粕培养基和LB培养基上产生晶体的情况(图2)，结果显示菌株HD73在花生粕培养基上可以产生明显的、完整的菱形晶体，Bt185菌株在花生粕培养基上能产生明显的球形晶体，表明Bt菌株在花生粕培养基上不仅可以有效生长，而且还可以正常表达杀虫晶体蛋白。
2.2膨化处理对花生粕的影响
2.2.1膨化处理前后花生粕所含杂菌量变化情况
分别称取10g膨化处理过的花生粕以及未经膨化处理的花生粕，加入100mL灭菌水中，震荡混匀，利用平板计数法统计杂菌数量。根据菌落数量统计结果显示，在膨化处理前花生粕内杂菌量为2.12×103cfu/g，膨化处理后花生粕杂菌量变为0.29×103cfu/g，膨化处理使花生粕内杂菌量减少86.32％，达到了去除杂菌的目的。
2.2.2膨化处理前后Bt对花生粕利用情况
分别称取1g膨化处理的花生粕及未经膨化处理(未经膨化处理作为对照)的花生粕，加入100mL灭菌的蒸馏水中，以1％的接菌量接入新鲜培养的Bt185-gfp菌液，同时将菌液也接入LB液体培养基和1/2LB液体培养基中，以上每个处理重复3次，30℃220rpm培养30h(菌体生长达到稳定期)后，以平板计数法统计各个处理中Bt185-gfp活菌数量，利用SPASS13.0对各个处理组单位体积的活菌数量进行显著性差异(P＝0.05水平)分析，发现经过膨化处理的花生粕和未经膨化处理的花生粕最终所获得的活菌数量无显著性差异，由此可以说明花生粕进行膨化处理后并未影响Bt利用其营养成分增殖的效率。
2.3不同浓度膨化的花生粕对Bt增殖的影响
将膨化的花生粕以0.5％、1％、2％(质量与体积比)的比例加入蒸馏水中(即加入的蒸馏水的体积为花生粕质量的0.5％、1％和2％)，并进行常规的高温灭菌。以LB和1/2LB为对照培养基，以上每个处理重复3次，以1％接菌量接入Bt185-gfp菌液，在30℃220rpm情况下培养30h(菌体生长达到稳定期)，利用平板计数法统计各个培养液中所获得的活菌数量(每个处理重复3次)，并利用SPASS对所得数据进行单因素方差处理分析后，所得的不同浓度培养基中单位质量营养物质获得的活菌数量(图3)显示：在0.5％、1％两个浓度的花生粕培养基中单位质量的花生粕所获得的活菌数量与LB培养基和1/2LB培养基相比在P＝0.05水平上无显著性差异，而高浓度(即2％)的花生粕加不利于Bt增殖。
2.4在可增殖颗粒剂中Bt的增殖情况
2.4.1在无菌条件下可增殖颗粒剂中Bt的增殖情况
以加入花生粕的颗粒剂(按照上述方法压制)作为实验组，以未加入花生粕(仅加入微晶纤维素)的颗粒剂(按照上述方法压制)作为对照组，将压制的颗粒剂安放于无菌的固体琼脂平板表面，将所有样品放置于30℃培养箱中培养7天。每天取3个颗粒样品，连续取样一周。利用平板计数法统计并计算在无菌条件下颗粒剂内Bt活菌数量变化情况(图4)显示：
对照组即未加入花生粕的颗粒剂内的Bt活菌数量随处理时间改变未出现明显变化，而实验组即加入花生粕的颗粒剂内的Bt活菌数量在处理的前两天明显增加，尤其是在处理的第二天内活菌数量急剧增加，在第三天(即处理2天后)颗粒剂内Bt活菌数量达到最大值，为1035.56×105cfu/粒(花生粕)，与第一天的活菌数量相比，增殖了30倍左右；之后，颗粒剂内Bt活菌数量逐渐下降，直到第七天(即处理6天后)颗粒剂内活菌数量下降到224.58×105cfu/粒(花生粕)，与第一天活菌数量相比，仍增殖了7倍左右。空白对照颗粒中的Bt数量无显著变化。
2.4.2在土壤内可增殖颗粒剂中Bt的增殖情况
以加入花生粕的颗粒剂作为实验组，以未加入花生粕(仅加入微晶纤维素)的颗粒剂作为对照组，将压制的颗粒剂埋入土盆所盛放的土壤中，将所有样品放置于28℃培养箱中，每天取3个样品，连续取样一周。利用平板计数法统计颗粒剂中Bt活菌数量变化情况显示：在颗粒剂埋入土壤之后的三天内颗粒剂的活菌数量不断增加，特别是在第二天到第三天之间，其活菌数量骤增，到第四天时(即处理3天后)颗粒剂的活菌数量达到最大值，为390.00×105cfu/粒(花生粕)，与第一天相比，颗粒剂内活菌数量增殖了40倍左右；之后在处理的第四天到第五天之间颗粒剂内活菌数量迅速下降，直接下降到34.33×105cfu/粒(花生粕)，但仍比第一天增殖4倍左右，这之后颗粒剂内的活菌数量基本保持不变，而空白对照颗粒中Bt数量无显著变化(图5)。
2.5可增殖颗粒剂对暗黑鳃金龟杀虫活性的测定
根据可增殖颗粒剂对暗黑鳃金龟的杀虫活性测定的结果显示，实验组(即用加入花生粕的颗粒剂进行处理的)中暗黑鳃金龟幼虫的死亡率为61.1％，比含有相同量的Bt185菌粉的微晶纤维素颗粒剂处理的对照组的死亡率要高41.7％；这说明花生粕的加入使得Bt185在颗粒剂内增殖后大大提高了颗粒剂的杀虫活性。
2.6几种生防菌在花生粕培养基上的生长情况
将绿僵菌2575，萎缩芽胞杆菌(Bacillusatrophaeus)Ba59、Ba75，枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)Bs54、Bs70和B916，木霉(Trichodermaspp.)610和437接种到膨化的花生粕上，在30℃下细菌培养48h，真菌培养5天后观察生长情况(图6)。结果显示上述菌株在膨化后的花生粕上增殖良好，三种真菌均可以观察到分生菌丝，而其他五种细菌均可观察到生物被膜。
对金龟子幼虫有活性的这几种Bt和绿僵菌在花生粕培养基上生长情况良好，因此利用Bt和绿僵菌防治蛴螬时均可利用花生粕进行田间增殖。上述用于防治地下病害的生防菌也能在花生粕上生长良好，因此可以在研制新型防治植物地下病害的生物制剂时加入花生粕，使这几种生防菌在植物根际增殖，从而增强其在根部的定殖能力，提高防治地下病害的效果。
蛴螬已成为为害花生、大豆、马铃薯、草坪等最严重的地下害虫，根据闫乾等在安徽宿州地区调查结果显示，蛴螬发生量可达30.7头/m2。因此，使用安全、特异性高、杀虫效果好的苏云金芽胞杆菌进行田间防治已成为必然趋势，而提高Bt制剂在田间对蛴螬的杀虫活性是必须解决的一大问题。本发明统计了对暗黑鳃金龟幼虫有较好杀虫活性的Bt185菌株在颗粒剂中的增殖情况，明确了其在颗粒剂中能够利用花生粕进行增殖；同时，根据其生物活性测定结果显示，在相同含菌量情况下，颗粒剂内菌体再次增殖后的杀虫活性比未增殖的提高41.667％，大大提高了杀虫活性，为其田间应用奠定了基础。
针对花生粕中的杂菌，本发明引入了膨化处理这一加工工艺，去除杂菌率达到86.32％，且过程简便、快捷。膨化是利用相变和气体的热压效应原理，使被加工物料内部的液体迅速升温汽化、增压膨胀，并依靠气体的膨胀，带动组分中高分子物质的结构变性，从而使之成为具有网状组织结构特征，定型的多孔状物质的过程。本发明中应用的是挤压膨化技术，在膨化过程当中植物性蛋白结构发生变化，三级四级结构的结合能力减弱，表面电荷重新分布，促使分子间氢键、二硫键等次级键部分断裂，蛋白质变性，而剪切力也对蛋白造成不可逆变性，使蛋白酶更易进入蛋白质内部，提高其利用率。
花生粕是本发明中筛选出来为微生物增殖提供营养的物质，为花生榨油后所产生的副产物，一般用于作为植物有机肥。其营养丰富，蛋白质含量可达48.68％，氨基酸种类齐全，总氨基酸含量高达37.504g/100g。此外花生粕还含有丰富的维生素，内部所含的可溶性总糖的含量也相当高，为32.5％。花生粕内充足的碳源和氮源为Bt芽胞的再次萌发提供充足的营养成分，有利于菌株的增殖，从而可以保证颗粒剂内较高的含菌量。另一方面，我国花生生产和消费均居世界首位，花生粕为花生提取油脂后的副产品，价格低廉，2015年7月花生粕的成交价格为2650元/吨，这大大降低了制剂在加工过程中的原料成本，有利于促进微生物制剂在农业生产上的应用和推广。

Claims (10)

1.一种药剂，其包括微生物和能够使所述微生物增殖的营养组分。
2.根据权利要求1所述的药剂，其特征在于，所述微生物为细菌和/或真菌；
优选所述细菌为芽胞杆菌(Bacillus)；更优选所述微生物为苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)、萎缩芽胞杆菌(Bacillusatrophaeus)和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)中的至少一种；
优选所述真菌为白僵菌(Beauveria)、绿僵菌(Metarhizium)和木霉(Trichoderma)中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的药剂，其特征在于，所述营养组分包括花生粕。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的药剂，其特征在于，所述营养组分的重量占所述药剂总重量的10-99.5％；优选为20-80％；更优选为40-60％。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的药剂，其特征在于，所述营养组分为膨化处理后的营养组分。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的药剂，其特征在于，所述药剂中还包括微晶纤维素。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的药剂，其特征在于，所述药剂为颗粒剂。
8.根据权利要求7任意一项所述的药剂，其特征在于，所述颗粒剂的体积为5-500立方毫米，优选所述颗粒剂的体积为25-150立方毫米。
9.根据权利要求6所述的药剂，其特征在于，所述营养组分的重量占与所述营养组分与所述微晶纤维素总重量的40-99％；优选为40-70％。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的药剂在防治植物病虫害中的应用优选所述的药剂在防治植物的地下病虫害中的应用，更优选所述的药剂在防治金龟子(Scarabaeoidea)幼虫中的应用。
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