CN102757917A - 防治植物青枯病和根肿病的生防制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治植物青枯病和根肿病的生防制剂及其制备方法和应用。该生防制剂的制备方法包括：将经活化的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008接种到培养液中，于25-45℃发酵培养6-120h；其中，以体积1L计，所述的培养液含有以下组分：蛋白胨3-15g，牛肉浸膏0-3g，葡萄糖0-5g，酵母粉0-5g，NaCl 0-8g，余量为水；培养液的pH为5.5-9.0。本发明利用解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008在适宜发酵培养基和培养条件下通过微生物发酵制备生防制剂，所制得的生防制剂对不同生化型的青枯菌和根肿菌均有较好防效，能显著降低青枯病和根肿病的病害发生率和病情严重度，适合规模化生产。

Description

防治植物青枯病和根肿病的生防制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物病害防治领域，尤其涉及一种防治植物青枯病和根肿病的生防制剂及其制备方法和应用。

背景技术

作物细菌性青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种系统侵染的毁灭性土传病害，俗称“植物瘟病”。青枯劳尔氏菌寄主广泛，可侵染44个科的数百种植物。目前，细菌性青枯病的防治是世界公认的一大难题，它广泛分布于世界各地，在我国南方省市发生严重，尤其在浙江，近年来不但茄科、瓜类受害，大面积发生的桑青枯病更对蚕业生产造成严重损失。

我国从20世纪90年代开始进行青枯病的生物防治制剂研究，何礼远和康耀卫等利用青枯菌无毒菌株和荧光假单胞菌诱导花生产生抗病性(何礼远，康耀卫.利用青枯菌无毒菌株和荧光假单胞菌诱导花生产生抗病性.植物保护学报，1990，17(2)：113-116)，杨合同等利用芽孢杆菌防治生姜青枯病取得了较好的效果(杨合同，庞定远，任欣正.姜瘟病生物防治试验初报.山东科学，1990，3(4)：42-46)。但国内外现有生防制剂均为单一的活菌体，只针对某一生化型。而Hayward根据青枯菌对乳糖、麦芽糖、纤维二糖和甘露醇、甜醇、山梨醇氧化能力的差异，把青枯菌区分为4个生化型，华静月和何礼远认为还存在生化型V(华静月，何礼远.我国植物青枯菌的生化型和其它生理差异.植物保护学报，1984，11(1)：43-50)。青枯菌的生化型多样性给病害防治增加了很大的难度。

十字花科作物是我国最重要的油料和蔬菜作物，种植面积3.75亿亩，其中油菜面积1.02亿亩，十字花科蔬菜2.73亿亩。根肿病是十字花科作物上重要的土传病害，由芸苔根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染所致，危害面积约6000万亩，平均产量损失达20％～30％，严重田块产量损失达60％以上，甚至绝收，每年导致油菜经济损失约10亿元、蔬菜经济损失约200亿，极大地制约了油料和蔬菜产业的持续稳定发展及农民增收。但对于根肿病的防治，尚缺乏高效、低毒、低残留、低成本的化学药剂；在农业防治方面，研究不够全面系统，存在不少弊端。

苏婷等从不同生态环境的植物根际土壤中筛选获得一株能防治多个青枯病生化型、防效稳定、具有商品竞争力的生防菌(苏婷，路梅，周青，等.抗不同生化型青枯菌的生防菌筛选鉴定及其活性分析.植物保护学报，2010，37(5)：431-435)，探讨进一步提高该菌株对植物青枯病的生防效果，对其规模化生产应用具有重要意义。同时，探讨该生防菌对其它植物病害的防治有利于该菌株的推广应用。

发明内容

本发明提供了一种生防制剂的制备方法，利用解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008在适宜的发酵培养基和发酵培养条件下通过微生物发酵制备生防制剂，工艺简单，菌体生长代谢旺盛，产拮抗物质较多。

一种生防制剂的制备方法，包括：将经活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJUB2008接种到培养液中，于25-45℃发酵培养6-120h。

所述的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008已保藏，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2009年7月13日，保藏编号为CCTCC NO：M209145。苏婷等公开了该菌株的筛选和鉴定，该菌株为从浙江省杭州市、海南省儋州市、云南省思茅地区镇源县、河南省南阳市卧龙区等不同生态环境的植物根际土壤中分离并筛选得到的，经鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，对不同生化型的青枯菌均具有一定的防治效果(苏婷，路梅，周青，等.抗不同生化型青枯菌的生防菌筛选鉴定及其活性分析.植物保护学报，2010，37(5)：431-435)。

以体积1L计，所述的培养液含有以下组分：蛋白胨3-15g，牛肉浸膏0-3g，葡萄糖0-5g，酵母粉0-5g，NaCl 0-8g，余量为水；培养液的pH为5.5-9.0。

优选地，以体积1L计，所述的培养液含有以下组分：蛋白胨10-15g，牛肉浸膏1-3g，葡萄糖0-1g，酵母粉0-3g，NaCl 6-8g，余量为水；培养液的pH为7.5-8.0。

更优选地，以体积1L计，所述的培养液含有以下组分：蛋白胨10g，牛肉浸膏1g，酵母粉1g，NaCl 8g，余量为水；培养液的pH为7.5。不同配方的培养液对微生物的生长、代谢有较大影响，使用常规LB培养基，该菌株能生长，但采用本发明提供的培养液用于解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008的发酵培养，更有利于抑菌物质的产出。蛋白胨作为主要碳源已能满足菌株生长所需，葡萄糖作为培养基中的另一种碳源，浓度过高反而会使微生物过度生长，影响代谢和次级代谢产物的生成；芽孢杆菌生长时需要含氮物质，特别是需要蛋白质原料和游离氨基酸的参与代谢才能进行(林同香，林益，林尾妹.苏云金杆菌和培养基氨基酸的比较分析.福建农业大学学报，1995，24(1)：45-48)；牛肉浸膏不仅是重要的氮源，而且含有多肽、氨基酸、有机酸、糖类、矿物质营养和维生素等，其含量变化能大大影响发酵液的抑菌活性；酵母粉作为另一种氮源，少量的酵母粉可以丰富氮源来源，但过量的酵母粉会影响菌株对蛋白胨和牛肉浸膏中氮元素的吸收利用；NaCl作为无机盐，高于常规LB培养基的浓度能促进菌株产生更多的抑菌物质。

所述的接种可以为：将解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008接种到种子培养液中，培养获得浓度为10⁸-10⁹CFU/ml的种子液，将种子液接种到所述的培养液中，接种量以体积百分比浓度计优选为0.1-15％，更优选为1-3％，最优选为3％。

摇瓶中装液量不同会影响发酵时的通气量。为了提供充足的通气量，同时保证一定的菌体培养量，以体积百分比浓度计，所述的培养液在摇瓶中的装液量优选为10-80％；更优选为60-70％；最优选为70％。

所述的发酵培养温度优选为35-40℃；更优选为35℃，该温度下最利于菌体的生长和代谢。

所述的发酵培养时间优选为24-48h；更优选为24h。该培养时间下，菌体生物量较大，且抑菌物质分泌较多；发酵时间过长，不但抑菌物质无显著增加，而且还会影响生产效益。

所述的培养液接种后，可以置于摇床中发酵培养，摇床转速为150-180r/min；优选为160r/min，这样更有利于菌体的分散和生长。

本发明提供了一种采用上述制备方法制得的生防制剂，该生防制剂含有较高浓度的抑菌物质，可以直接用于浇灌植物，对不同生化型的青枯菌和根肿菌均有较好的防效。

本发明还提供了所述的生防制剂在防治植物青枯病中的应用。试验证明，该生防制剂用于植物青枯病的防治，取得了比已公开文献更好的效果，防治效果达88％，根茎鲜重比也从0.11上升至0.14，且优于目前常用的青枯病防治药剂。

优选地，所述的植物为番茄、茄子、马铃薯或生姜，青枯劳尔氏菌常常侵染这些植物，引发青枯病；更优选地，所述的植物为番茄。

本发明还提供了所述的生防制剂在防治植物根肿病中的应用。试验证明，该生防制剂对十字花科植物的根肿病也有良好的防治效果，用于根肿病的防治，能显著降低根肿病的病情严重度(病情指数为40％)，促进植物的增产效果(达到92％)，优于目前常用的根肿病防治药剂。

优选地，所述的植物为十字花科植物；更优选地，所述的植物为大白菜、小白菜、甘蓝、萝卜、荠菜、花椰菜或油菜，芸苔根肿菌常常侵染这些植物，引发根肿病；最优选地，所述的植物为大白菜。

本发明利用解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008在适宜的发酵培养基和发酵培养条件下制备获得防治植物青枯病、根肿病的生防制剂，具有如下有益效果：(1)培养基原料来源广泛，发酵培养工艺简单，操作方便；(2)所制得的生防制剂对青枯菌的抑菌圈直径达到21.75mm，抑菌效果优于使用常规LB培养基和常规细菌发酵培养条件所制得的生防制剂；用于浇灌被青枯菌侵染的植株，能显著降低植株青枯病的病害发生率和病情严重度；对不同生化型青枯病均有较好防效，防效稳定，适合规模化生产；(3)用于浇灌被根肿菌侵染的植株，能显著降低植株根肿病的病情严重度，延缓根肿病的发生，显著促进植株的增产效果；防效稳定，适合规模化生产。

附图说明

图1为实施例3中不同初始pH对解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008抑菌活性和菌体生长量的影响；

图2为实施例4中不同装液量对解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008抑菌活性和菌体生长量的影响；

图3为实施例5中不同接种量对解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008抑菌活性和菌体生长量的影响；

图4为实施例6中不同温度对解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008抑菌活性和菌体生长量的影响；

图5为实施例7中不同发酵时间对解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008抑菌活性和菌体生长量的影响；

图6为实施例8中不同处理下番茄青枯病的病害发生情况；

图7为实施例8中不同处理下番茄青枯病的病情严重度。

具体实施方式

实施例1制备种子液

用三区划线法将保藏的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJUB2008(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209145)在NA琼脂平板上划线，置于30℃下培养24h；将解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008单菌落接到LB液体培养基中，于30℃，160r/min的摇床中振荡培养12h，制成种子液，种子液中菌体浓度为10⁸CFU/ml。

实施例2发酵培养基的优化

选择蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、酵母粉、NaCl 5个培养基组分因素，每个因素设定4个水平。采用L₁₆(4⁵)正交表，随机安排因素和配比水平(见表1)。

按正交试验设计表(见表3)分别配置培养基，pH 7.0左右；灭菌后，向培养基中接入实施例1制得的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008种子液，接种量为0.5％(v/v)；于30℃，160r/min摇床振荡培养24h。每个处理设3个重复。

采用琼脂扩散法测定抑菌活性：将发酵液加入含有青枯菌的琼脂平板中，于30℃温箱培养48h后，测量各处理的抑菌圈直径。

结果显示，培养基各组成成分蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、酵母粉、NaCl对解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008发酵液的抑菌活性都有影响，影响大小主次排列为：葡萄糖＞牛肉浸膏＞蛋白胨＞NaCl＞酵母粉。当葡萄糖浓度较低，牛肉浸膏、蛋白胨或NaCl浓度较高时，解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008发酵液的抑菌活性较强；酵母粉浓度对解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008发酵液的抑菌活性无显著影响(见表2)。

解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008利用10号、9号、14号培养基发酵时，其发酵液的抑菌活性最强，抑菌圈平均直径分别达到20.67mm、20.23mm、20.13mm。10号培养基为最佳配方，其组成编号为A₃B₂C₄D₃E₁，即每升培养液中蛋白胨10g、牛肉浸膏1g、葡萄糖0g、酵母粉1g、NaCl8g(见表3)。

表1L₁₆(4⁵)正交试验因素水平表

表2L₁₆(4⁵)正交试验方差分析结果

表3培养基营养成分优化的L₁₆(4⁵)正交实验结果

注：abcdefgh代表各处理之间的显著性差异。

实施例3培养基初始pH的优化

培养基的初始pH设5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0八个梯度，在实施例2优化后的培养基中接种实施例1的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008种子液，接种量为0.5％(v/v)；于30℃，160r/min摇床振荡培养24h；测量抑菌圈大小和菌体数量。

结果见图1，当初始pH为7.5时，解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008的抑菌活性最大；当初始pH为8.0时，解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008的菌体数量最多。从菌体的生长量和抑菌物质的产生量两项指标来综合考虑，并以抑菌活性为重点，确定最适合解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008发酵的培养基初始pH为7.5。

实施例4装液量的优化

将装液量设定为50ml摇瓶装液量5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml八个梯度，在实施例2优化后的培养基中接种实施例1的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008种子液，接种量为0.5％(v/v)；于30℃，160r/min摇床振荡培养24h；测量抑菌圈大小和菌体数量。

结果见图2，当装液量为35ml/50ml摇瓶时，解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008发酵液的抑菌活性和菌体数量都达到最大值。

实施例5接种量的优化

接种量设0.1％、0.5％、1％、3％、5％、7％、9％、15％(v/v)八个梯度，在实施例2优化后的培养基中按上述比例接种实施例1的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008种子液；于30℃，160r/min摇床振荡培养24h；测量抑菌圈大小和菌体数量。

结果见图3，当接种量为3％(v/v)时，解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008发酵液的抑菌活性和菌体数量都达到最大值。

实施例6发酵温度的优化

发酵温度设25、30、35、40、45℃五个梯度，在实施例2优化后的培养基中接种实施例1的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008种子液，接种量为0.5％(v/v)；分别在160r/min摇床中振荡培养24h；测量各温度梯度条件下发酵液的抑菌圈大小和菌体数量。

结果见图4，当培养温度为35℃时，解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008发酵液的抑菌活性和菌体数量都达到最大值。

实施例7最佳发酵时间的确定

在优化后的培养条件下(初始pH 7.5；装液量35ml/50ml；接种量3％(v/v)；培养温度35℃)摇瓶培养，分别在6、12、24、48、36、72、96、120h取样测定其对青枯病原菌抑菌圈的大小，并测定菌体数。

结果见图5，用最终得到的优化条件来培养解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008，24h后抑菌圈平均直径达到21.75mm(培养条件未优化时抑菌圈平均直径20.67mm)；24h之后抑菌活性无显著性差异。菌体数在24h达到最大值。综合菌量和抑菌物质分泌的结果，且考虑到时间越长对生产利益越不利，培养时间以24h为宜。

实施例8青枯病温室防效试验

未经优化发酵培养的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008菌悬液的制备：将经活化的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008接种到未经优化的培养液中进行发酵培养；其中，以体积1L计，未经优化的培养液含有以下组分：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，余量为水；培养液的pH为7.0；未经优化的常规培养条件为：摇瓶中装液量50％，接种量0.5％(v/v)，发酵培养温度30℃，发酵培养时间12h。

将已萌发的番茄种子播种在装有营养土和沙子(1∶2)的盆子中，每盆1粒。设4个处理，每个处理设8个重复：

(1)在种子表面浇灌1ml未经优化发酵培养的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008菌悬液；

(2)在种子表面浇灌1ml经优化发酵培养的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008菌悬液；

(3)在种子表面浇灌1ml无菌水，作为发病对照；

(4)在种子表面浇灌1ml无菌水，作为空白对照。

浇灌处理后，随机放在16h光照8h黑暗、相对湿度80％、28℃的温室中；6周以后，再次将相应的菌悬液或无菌水浇灌在番茄苗根系周围；第2天用青枯菌T91菌悬液(10⁸CFU/ml)在处理1至处理3的番茄苗上伤根接种，各处理接种5ml，处理4用5ml无菌水伤根接种作为空白对照；再经1周左右统计番茄的病害发生率和病情严重度，测定番茄的植株生物量。

图6和图7结果显示，与发病对照(处理3)相比，经解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008菌悬液处理后的番茄植株(处理1和处理2)病害发生率和病情严重度都显著下降。与未优化条件培养的处理1相比，经优化后发酵培养的菌悬液处理番茄(处理2)能进一步地降低番茄植株的病害发生率和病情严重度，且效果显著。

生物量的评价以番茄植株根茎的鲜重和干重作为指标。根系越健壮，说明该作物的生长能力越旺盛；其地下部分/地上部分，即根茎比越大，说明该作物抗土传病害能力越强。表4结果显示，与发病对照(处理3)和未优化发酵培养处理(处理1)相比，经优化培养的菌悬液处理(处理2)之后，番茄植株的鲜重和干重根茎比值有明显提高，分别达0.14和0.12。

表4解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008对接种青枯菌后番茄植株生物量的影响

注：abcd代表各处理之间的显著性差异。

以本实施例经优化培养菌悬液处理组(处理2)与克菌康药剂处理的防效比较，结果显示，用克菌康处理青枯病植物，防治效果达85％左右(黄瑛.克菌康防治番茄青枯病药效试验.农业科技通报，2006，8：24-25)；而本实施例提供的生防制剂用于青枯病的防治，能显著降低青枯病的病情严重度(病情指数为12％)，增加植物的根茎比，优于克菌康药剂的防治效果。

实施例9根肿病温室防效试验

未经优化发酵培养的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008菌悬液的制备：将经活化的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008接种到未经优化的培养液中进行发酵培养；其中，以体积1L计，未经优化的培养液含有以下组分：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，余量为水；培养液的pH为7.0；未经优化的常规培养条件为：摇瓶中装液量50％，接种量0.5％(v/v)，发酵培养温度30℃，发酵培养时间12h。

将风干的甘蓝根肿病病根磨碎，并与营养土混合(病根∶营养土＝1∶20)，得到菌土混合物；在纸杯中以珍珠岩为基质，在珍珠岩中挖一个小穴，并在穴中放大约20g菌土，空白对照只加营养土；将已萌发的大白菜种子播种在菌土中，每个杯子播种4棵，每个处理8杯。

(1)在播种时浇灌5ml未经优化发酵培养的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008菌悬液，间隔10d后，再浇一次；再间隔15d浇第三次；

(2)在播种时浇灌5ml经优化发酵培养的解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008菌悬液，间隔10d后，再浇一次；再间隔15d浇第三次；

(3)在播种时浇灌5ml蒸馏水，间隔10d后，再浇一次；再间隔15d浇第三次，作为病原对照；

(4)在播种时浇灌5ml蒸馏水，间隔10d后，再浇一次；再间隔15d浇第三次，作为空白对照。

浇灌处理后，随机放在16h光照8h黑暗、相对湿度80％、30℃的温室中；45-50天以后，统计白菜根部根肿病的发病率和病情严重度以及植株生物量。病情严重度分级标准如下：

0级：无任何肿瘤；

1级：主根肿大，其直径小于二倍茎基部；

3级：主根肿大，其直径为茎基的2-3倍；

5级：主根肿大，其直径为茎基的3-4倍；

7级：主根肿大，其直径为茎基的4倍以上。

死亡植株按7级计算。

病情指数＝[∑(病级株数×代表级数)/植株总数×最高代表级值]×100。

同时为了更好地评估解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008对土壤中根肿菌种群数量的影响，即其对根肿菌的抑制效果，对不同处理土壤中根肿菌的含量进行了测定，方法如下：从每组处理的不同重复中各称取1g土壤混合成8g，从中称取1g加入到9ml无菌蒸馏水中；在摇床上震荡30min，稀释到10-2，血尔球计数根肿菌数量。

表5解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008对大白菜根肿病的防治和增产效果影响

注：abc代表各处理之间的显著性差异。

以本实施例经优化培养菌悬液处理组(处理2)与荣宝和棉隆药剂处理的防效比较，结果显示，用荣宝和棉隆药剂处理根肿病植物，药后50天平均病情指数分别达65.00％和64.58％，增产效果分别达70.10％和50.62％(赵毓潮，向祖焕，张植敏.土壤处理药剂对十字花科根肿病的防治效果试验.湖北植保，2008，1：24-25)；而本实施例提供的生防制剂用于根肿病的防治，能显著降低根肿病的病情严重度(病情指数为40％)，促进植物的增产效果(达92％)，优于荣宝、棉隆药剂的防治效果。

Claims (10)

1.一种生防制剂的制备方法，包括：将经活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJUB2008接种到培养液中，于25-45℃发酵培养6-120h；

其中，所述解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008的保藏号为CCTCCNO：M209145；

以体积1L计，所述的培养液含有以下组分：蛋白胨3-15g，牛肉浸膏0-3g，葡萄糖0-5g，酵母粉0-5g，NaCl 0-8g，余量为水；培养液的pH为5.5-9.0。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以体积1L计，所述的培养液含有以下组分：蛋白胨10-15g，牛肉浸膏1-3g，葡萄糖0-1g，酵母粉0-3g，NaCl 6-8g，余量为水；培养液的pH为7.5-8.0。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的接种为：将解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008接种到种子培养液中，培养获得浓度为10⁸-10⁹CFU/ml的种子液，将种子液接种到所述的培养液中，接种量以体积百分比浓度计为1-3％。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养温度为35-40℃。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养时间为24-48h。

6.一种采用如权利要求1-5任一所述的制备方法制得的生防制剂。

7.如权利要求6所述的生防制剂在防治植物青枯病中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的植物为番茄、茄子、马铃薯或生姜。

9.如权利要求6所述的生防制剂在防治植物根肿病中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的植物为十字花科植物。

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