CN105296392B - 防治十字花科根肿病解淀粉芽孢杆菌Bam22的发酵方法 - Google Patents
防治十字花科根肿病解淀粉芽孢杆菌Bam22的发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种防治十字花科根肿病解淀粉芽孢杆菌Bam22的发酵方法，该方法包括：1）挑取经过在固体培养基上培养后的解淀粉芽孢杆菌Bam22菌落，置于液体培养基中，于30‑32℃震荡培养10‑12小时，转速为200‑220 rpm，作为种子液；2）将步骤1）所得种子液接入发酵罐中进行发酵40‑50小时，种子液接入量为8%‑10%，罐温为27‑30℃，发酵罐搅拌速度为220‑250rpm，空气流量0.8﹕1‑1﹕1（V/V•m）；所述高效十字花科根肿病芽孢杆菌Bam22于2015年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11329。本发明的发酵方法对芽孢杆菌Bam22的培养十分有利，获得的细菌数多，且细菌具有良好的活性。
Description
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种防治十字花科根肿病解淀粉芽孢杆菌Bam22的发酵方法。
背景技术
仅几十年来，十字花科根肿病在全球范围内迅速蔓延，严重影响了十字花科作物的生长，造成了巨大的经济损失。
鉴于使用化学农药对环境有害且存在食品安全隐患，生防技术日益受到研究者和农业从业者的青睐。然而，由于十字花科根肿病菌不能离体培养的特性在一定程度上限制了该病生防菌株的筛选，因此现有的对十字花科根肿病有较好防治功效的菌株只有寥寥几种，严重的限制了生防方法在十字花科根肿病防治工作的进一步开展。
本发明的发明人经过大量的实验摸索研究，获得了一株对十字花科（特别是油菜）根肿病具有高效防治功效、且施用剂量少的生防菌株，于2015年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11329。将其更好的应于于实际防治工作中，需要对其发酵培养方法进行摸索。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治十字花科根肿病解淀粉芽孢杆菌Bam22的发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）挑取经过在固体培养基上培养后的解淀粉芽孢杆菌Bam22单菌落，置于液体培养基中，于30-32℃震荡培养10-12小时，转速为200-220 rpm，作为种子液；所述液体培养基的成分按质量百分数计包括：酵母提取物0.2-0.3%、牛肉浸膏0.1-0.2%、蛋白胨0.7-0.8%、NaCl 0.3-0.6%、余量为水，pH=7.0-7.2；
2）将步骤1）所得物置入发酵罐中进行发酵40-50小时，罐温为27-30℃，发酵罐搅拌速度为220-250rpm，空气流量0.8﹕1-1﹕1（V/Vm）；发酵罐中的培养基的成分按质量百分数计包括：豆粉4-5%、蛋白胨0.1-0.15%、葡萄糖0.5-0.7%、淀粉2-3%、硫酸锰0.1%、硫酸亚铁0.06%、磷酸氢二钾0.2%、碳酸钙0.1%、消泡剂0.01%、余量为水，pH=7.0-7.4；
所述高抗十字花科根肿病解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Bam22于2015年9月6日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11329。
本发明提供的发酵方法能够很好的对解淀粉芽孢杆菌Bam22进行发酵培养，使得该生防菌具有十分优良的活性，易于开展十字花科根肿病的防治工作。
优选的，所述方法在步骤1）之前还包括步骤：试管种的培养，所述试管种的培养方法为：将解淀粉芽孢杆菌Bam22置于斜面培养基中于30℃下培养36小时；所述斜面培养基的成分按质量百分数计包括：酵母提取物0.2-0.3%、牛肉浸膏0.1-0.2%、蛋白胨0.7-0.8%、NaCl 0.3-0.6%、琼脂2%，余量为水，pH=7.0-7.2。
优选的，所述步骤1）中，所述液体培养基的成分按质量百分数计为：酵母提取物0.25%、牛肉浸膏0.12%、蛋白胨0.75%、NaCl 0.5%、余量为水，pH=7.2。
优选的，所述步骤1）中，培养温度为30℃，培养时间为12小时。
优选的，所述步骤2）中，发酵罐中的培养基的成分按质量百分数计为：豆粉4.5%、蛋白胨0.12%、葡萄糖0.6%、淀粉2.5%、硫酸铵0.1%、碳酸钙0.1%、消泡剂0.01%、余量为水，pH=7.8。
优选的，所述步骤2）中，罐温为28℃，发酵时间为48小时。
本发明的有益效果：本发明的发酵方法对解淀粉芽孢杆菌Bam22的培养十分有利，获得的芽孢多，且具有良好的生物活性。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
下述实施例中所用的细菌于2015年9月6日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11329。
实施例1
1）挑取经过在固体培养基上培养后的解淀粉芽孢杆菌Bam22单菌落，置于液体培养基中，于31℃震荡培养11小时，转速为200 rpm，，作为种子液；所述液体培养基的成分按质量百分数计为：酵母提取物0.2%、牛肉浸膏0.1%、蛋白胨0.7%、NaCl 0.3 %、余量为水，pH=7.0；
2）将步骤1）所得物置入发酵罐中进行发酵40小时，罐温为30℃，发酵罐搅拌速度为250rpm，空气流量0.8﹕1（V/Vm）；发酵罐中的培养基的成分按质量百分数计为：豆粉4%、蛋白胨0.1%、葡萄糖0.5%、淀粉2%、硫酸锰0.1%、硫酸亚铁0.06%、磷酸氢二钾0.2%、碳酸钙0.1%、消泡剂0.01%、余量为水，pH=7.0。
实施例2
1）挑取经过在固体培养基上培养后的解淀粉芽孢杆菌Bam22单菌落，置于液体培养基中，于32℃震荡培养10小时，转速为220 rpm，作为种子液；所述液体培养基的成分按质量百分数计为：酵母提取物0.3%、牛肉浸膏0.2%、蛋白胨0.8%、NaCl 0.6%、余量为水，pH=7.0；
2）将步骤1）所得物置入发酵罐中进行发酵50小时，罐温为27℃，发酵罐搅拌速度为220rpm，空气流量0.9﹕1（V/Vm）；发酵罐中的培养基的成分按质量百分数计为：豆粉5%、蛋白胨0.15%、葡萄糖0.7%、淀粉3%、硫酸锰0.1%、硫酸亚铁0.06%、磷酸氢二钾0.2%、碳酸钙0.1%、消泡剂0.01%、余量为水，pH=7.4。
实施例3
1）挑取经过在固体培养基上培养后的解淀粉芽孢杆菌Bam22单菌落，置于液体培养基中，于30℃震荡培养12小时，转速为210 rpm，作为种子液；所述液体培养基的成分按质量百分数计为：酵母提取物0.25 %、牛肉浸膏0.12 %、蛋白胨0.75 %、NaCl 0.5 %、余量为水，pH=7.0；
2）将步骤1）所得物置入发酵罐中进行发酵48小时，罐温为28℃，发酵罐搅拌速度为220rpm，空气流量1﹕1（V/Vm）；发酵罐中的培养基的成分按质量百分数计为：豆粉4.5 %、蛋白胨0.12 %、葡萄糖0.6 %、淀粉2.5 %、硫酸锰0.1%、硫酸亚铁0.06%、磷酸氢二钾0.2%、碳酸钙0.1%、消泡剂0.01%、余量为水，pH=7.3。
对比实施例
除了液体培养基中成分为牛肉浸膏0.3%，酵母提取物 0.1%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，余料为水，pH7.5，培养温度为28℃；以及发酵罐罐温为25℃之外，其余与实施例1一致。
经检测，实施例1、实施例2、实施例3所得菌液含芽孢量分别为6.5×109 cfu/ml、7.3×109 cfu/ml、8.2×109 cfu/ml，而对比实施例所得菌液的菌浓仅为1.2×108 cfu/ml。
实验例
实施例3所得菌液用于十字花科根肿病的防治实验
实验对象：油菜、白菜、青花菜。
将所得菌液稀释200倍、500倍、800倍、1000倍，利用灌根法，移栽时每植株浇100ml菌液稀释液，移栽后7天第二次灌根，移栽后15天第三次灌根。
病情分级：
0级：根部无肿瘤，根系发育正常；
1级：1-30%的根着少许肿瘤，有小的结节状肿块，相互不连接；
2级：31-60%的根着生肿瘤，有大的结节状或球状肿块，相互连接；
3级：61-100%的根着生肿瘤，膨大到形成纺锤形瘤，大的瘤块一直延伸到下胚轴，植株矮小，停止生长或死亡。
病情指数=[（各级病株数×相对级数值）/最高级别×调查总株数]×100。
相对防效=（对照病情指数-处理病情指数）×100/对照病情指数。
实验结果见表1、表2和表3：
表1 油菜根肿病防治结果
表2 白菜根肿病防治结果
表3 青花菜根肿病防治结果
Claims (5)
1.一种防治十字花科根肿病解淀粉芽孢杆菌Bam22的发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）挑取经过在固体培养基上培养后的解淀粉芽孢杆菌Bam22单菌落，置于液体培养基中，于30-32℃震荡培养10-12小时，转速为200-220rpm，作为种子液；所述液体培养基的成分按质量百分数计包括：酵母提取物0.2-0.3%、牛肉浸膏0.1-0.2%、蛋白胨0.7-0.8%、NaCl0.3-0.6%、余量为水，pH=7.0-7.2；
2）将步骤1）所得物置入发酵罐中进行发酵40-50小时，罐温为27-30℃，发酵罐搅拌速度为220-250rpm，空气流量0.8﹕1-1﹕1V/V·m；发酵罐中的培养基的成分按质量百分数计包括：豆粉4-5%、蛋白胨0.1-0.15%、葡萄糖0.5-0.7%、淀粉2-3%、硫酸锰0.1%、硫酸亚铁0.06%、磷酸氢二钾0.2%、碳酸钙0.1%、消泡剂0.01%、余量为水，pH=7.0-7.4；
所述解淀粉芽孢杆菌Bam22于2015年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11329。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述方法在步骤1）之前还包括步骤：试管种的培养，所述试管种的培养方法为：将解淀粉芽孢杆菌Bam22置于斜面培养基中于30℃下培养36小时；所述斜面培养基的成分按质量百分数计包括：酵母提取物0.2-0.3%、牛肉浸膏0.1-0.2%、蛋白胨0.7-0.8%、NaCl0.3-0.6%、琼脂2%，余量为水，pH=7.0-7.2。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述液体培养基的成分按质量百分数计为：酵母提取物0.25%、牛肉浸膏0.12%、蛋白胨0.75%、NaCl0.5%、余量为水，pH=7.2。
4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤1）中，培养温度为30℃，培养时间为12小时。
5.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤2）中，罐温为28℃，发酵时间为48小时。
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