CN104250624B - 一种HyM土壤修复活性菌群的制备方法 - Google Patents
一种HyM土壤修复活性菌群的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明具体涉及一种HyM土壤修复活性菌群的制备方法。其能有效的提高土壤修复微生物的生产效率，且最大限度的保证其活性，提升了土壤修复微生物生产的规模化、工业化发展。一种HyM土壤修复活性菌群的制备方法为：(1)将菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养，得种子培养液；(2)然后配制发酵培养基，并经灭菌后接种芽孢杆菌菌种和上述种子培养液，再用高速剪切机进行剪切，得到菌落；(3) 然后对菌落进行太阳能、外加热源发酵，得到菌泥；(4)对菌泥进行收集和干燥。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种HyM土壤修复活性菌群的制备方法。
背景技术
背景技术中，中国土壤污染已对土地资源可持续利用与农产品生态安全构成威胁。全国受有机污染物污染的农田已达3600万公顷，污染物类型包括石油类、多环芳烃、农药、有机氯等；因油田开采造成的严重石油污染土地面积达1万公顷，石油炼化业也使大面积土地受到污染；在沈抚石油污水灌区，表层和底层土壤多环芳烃含量均超过600mg/kg，造成农作物和地下水的严重污染。全国受重金属污染土地达2000万公顷，其中严重污染土地超过70万公顷，其中13万公顷土地因镉含量超标而被迫弃耕。针对这种状况，国内已经有很多解决方案，但是都存在着许多弊端，因此我们需要创新一种新型的土壤修复活性菌群制备方法。在核心技术上突出表现为可以人为调控活性菌群制备的温度和驯化适性能力，从而最大限度的保证其生物活性及抗逆性，使土壤修复活性菌群的制备实现规范性、高活性、安全性，并且操作简便，大大降低技术成本和提高适性能力。
发明内容
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种HyM土壤修复活性菌群的制备方法，其能有效的提高土壤修复微生物的生产效率，且最大限度的保证其活性，提升了土壤修复微生物生产的规模化、工业化发展。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：一种HyM土壤修复活性菌群的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为：
(1)将菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养，得种子培养液；
(2)然后配制发酵培养基，并经灭菌后接种芽孢杆菌菌种和上述种子培养液，再用高速剪切机进行剪切，得到菌落；
(3) 然后对菌落进行太阳能、外加热源发酵，得到菌泥；
(4)对菌泥进行收集和干燥。
所述的步骤（2）中的发酵培养基的配方为：酵母提取物5.0-15.0 g/L、蛋白胨10.0-30.0 g/L、氯化钠8.5-9.0 g/L、葡萄糖20.0-30.0 g/L、亚油酸8-30 g/L、微量元素1-1.5g/L、吐温80 1～5 g /L、腐殖酸5-10 g /L、低聚糖5-15 g /L、艾蒿2-8 g /L、葛根2-6g /L、甘草2-10 g /L、红豆杉叶2-6 g /L、杜鹃2-5 g /L、紫苏2-4 g /L、腐殖酸3-10 g /L、中蜂蜜3-5 g /L、黄腐酸2-5 g /L、食盐2-10 g /L、胰蛋白胨2-6 g /L、牛肉膏2-6 g /L、酵素粉2-5 g /L、氨基酸2-12 g /L、意蜂蜜2-6 g /L、红豆根块2-6 g /L、其余为水。
所述的步骤(3)的工艺流程中：
a.接菌落微生物发酵液的种子液，接种量为发酵培养基溶液的体积比的5％～15％，种子液的光密度为1～3；
b.发酵过程中，长菌温度为28℃～30℃，时间为60h～66h；
c.采取慢速加糖方式，发酵液总体积10升，加糖量为100g-350g，且在接种后6h开始，在48h内加完；
d.上述发酵培养基中亚油酸不能直接加入，而经与分散剂混合后才能加入，且控制发酵液中亚油酸的浓度，采用缓慢加入的方式；
e.发酵过程中采用添加氢氧化钠和盐酸自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.0～6.6之间。
所述的步骤（4）菌泥收集和干燥：发酵结束，发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次，洗涤时转速为7000转/分，时间为20min，温度为4℃，离心收集细胞，加保护剂，真空冷冻干燥，即得HyM土壤修复活性菌群。
所述的微量元素为无水醋酸钠或柠檬酸二铵。
所述的保护剂为甘油、脱脂奶粉、海藻糖或甘露醇。
所述的亚油酸的浓度为0.2 g/L。
所述的分散剂为环糊精。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发明设计了酶诱导物的提供方式，一定浓度的亚油酸对于细菌的生长具有抑制作用，而且亚油酸在发酵培养基的溶解性较小，，因此用微纳粒子技术处理将亚油酸包覆在环糊精、淀粉、牛血清蛋白-卵磷脂、牛血清蛋白、卵磷脂、甘油、单甘脂物质之一中，再行添加。其添加方式为：用控速技术控制添加速度，发酵液中亚油酸初始浓度诱导浓度控制在0.4g/L以内，在接种培养12h后再间歇补加，48h内加完。控温发酵结束，经分离、收集、干燥，制得的冻干制品中活菌数可达1010个/g。菌体转化亚油酸生成共轭亚油酸的转化率可达42.7％。乳酸菌活菌计数按GB/T4789.35-2003规定测定，共轭亚油酸采用气相色谱法(GC)和紫外分光光度法测定。本发明具有如下特点：采用本发明的植物菌株选择具有相容性和互补性，通过添加物消除拮抗性，菌体抗逆性高，菌体OD值在3～6.35，所得活菌数可达1050个/g；所得菌体具有转化亚油酸生成共轭亚油酸的能力；亚油酸采用微纳技术进行保护溶解，降低其对细胞生长的抑制作用，另一方面增强了其驯化作用，提高了扩繁率，其对亚油酸的转化率可达20％～50％；且发酵可广泛采用太阳能、外加热源增温系统，降低了能耗，节省成本。采用本发明所得乳酸菌广泛用于土壤改良和修复，也可作为益生菌在食品、生物饲料等方面使用，以提高突宿主体内共轭亚油酸的含量。
具体实施方式
本发明能有效转化亚油酸为共轭亚油酸的新的微生物菌株，是乳杆菌属(Lactobacillus)的植物乳杆菌一个种：HSC235(Lactobacillusplantarum HSC 235)，此菌株是从天然发酵的植物中采用MRS乳酸菌培养分离筛选得到。此菌株己于2004年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保存号CCTCC No.M204051。此菌株的细菌学特征如下：(1)形态：①细条状，直径0.48微米～0.83微米，长0.8微米～5.2微米；②在培养初始阶段，细胞呈长杆状；③具有耐酸性；④游动性：静止；⑤孢子形成：不形成孢子；⑥革兰氏染色实验呈阳性。(2)在各种培养基上生长状态(30℃)：①MRS琼脂平板培养基：生长不良，菌落呈圆形，不规则，表面光滑，乳白色；②MRS琼脂斜面培养基：生长不良，无光泽，乳白色；③MRS液体培养基：生长良好，液体混浊，有沉淀。(3)生理特征：1)木糖：+2)海藻糖：+3)单糖：+4)山梨醇：+5)水杨苷：+6)核糖：+7)鼠李糖：-8)棉子糖：+9)密二糖：+10)甘露糖：+11)甘露醇：+12)麦芽糖：+13)乳糖：+14)葡萄糖酸盐：+15)半乳糖：+16)果糖：+17)七叶灵：+18)纤维二糖：+19)阿拉伯糖：+20)苦杏仁苷：+21)乳酸旋光性：DL22)接触酶：-23)产吲哚能力：-24)分解酪素：-根据以上细菌学特征，以及此菌株HSC235培养物基于其对底物的利用情况可确定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。该菌种在MRS培养基上保藏，通常所用的培养基含有：碳源(例如葡萄糖、乳糖、乳清)，氮源(如)，有机营养物质(如酵母抽提物，蛋白胨，胰白胨，植物蛋白胨，牛肉膏，玉米浆)，无机营养成分(如磷酸盐、镁、钾、锌、铁、钴和锰)，及作为诱导物质的亚油酸，或者含亚油酸的其它物质，或者亚油酸结构类似物等。在20℃～40℃培养温度下均能生长，最适的生长温度为27.5℃～38℃。培养条件：pH值4.0～7.0，最适的生长pH值为6.0～6.6。该菌种在含明亚油酸的MRS培养基上厌氧条件下培养1天～4天，所得细胞具有转化亚油酸及亚油酸类物质为共扼亚油酸的能力。
本发明制备方法，包括：(1)将菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养；(2)配制发酵培养基，并经灭菌后接菌种，发酵培养基配方，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L：酵母提取物：5.0-15.0蛋白胨：10.0-30.0氯化钠：8.5葡萄糖：20.0-30.0亚油酸：8-30微量元素：适量吐温80：1ml/L～5ml/L其余为水；(3)发酵工艺a.接种子液，接种量为发酵培养基溶液的5％～15％(v/v，等单位体积之比)，种子液的光密度(OD值)为1～3；b.发酵过程中，长菌温度为28℃～30℃，时间为60h～66h；c.采取慢速加糖方式，加糖量为100g-350g(发总发酵液体积10升计)，且在接种后6h开始，在48h内加完；d.上述发酵培养基中亚油酸一般不能直接加入，而经与其它分散剂混合后才能加入，且控制发酵液中亚油酸的浓度，采用缓慢加入的方式；e.发酵过程中采用添加氢氧化钠和盐酸自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.0～6.6之间；(4)菌泥收集和干燥：发酵结束，发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次(7000转/分，20min，4℃)，离心收集细胞，加保护剂，真空冷冻干燥，即得活菌粉。
本发明发酵培养基中微量元素为无水醋酸钠5g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，柠檬酸二铵2g，CoCl20.002g。
下面实施例旨在举例说明而不是限制本发明的范围。
实施例1：一种HyM土壤修复活性菌群的制备方法为：
(1)将菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养，得种子培养液；
(2)然后配制发酵培养基，并经灭菌后接种芽孢杆菌菌种和上述种子培养液，再用高速剪切机进行剪切，得到菌落；
所述的步骤（2）中的发酵培养基的配方为：酵母提取物5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化钠8.5g/L、葡萄糖20.0g/L、亚油酸8 g/L、微量元素1g/L、吐温80 1g /L、腐殖酸5 g /L、低聚糖5g /L、艾蒿2 g /L、葛根2 g /L、甘草2 g /L、红豆杉叶2 g /L、杜鹃2g /L、紫苏2g /L、腐殖酸3 g /L、中蜂蜜3g /L、黄腐酸2 g /L、食盐2 g /L、胰蛋白胨2 g /L、牛肉膏2g /L、酵素粉2g /L、氨基酸2 g /L、意蜂蜜2 g /L、红豆根块2 g /L、其余为水。
(3) 然后对菌落进行太阳能、外加热源发酵，得到菌泥；
发酵工艺：按上述配方配制10L发酵液于发酵罐中，经灭菌后接种子培养液，菌种的接种量为培养基溶液的5％，即500mL，光密度(OD值)为1；将10L发酵培养基所需的亚油酸溶解或包埋在环糊精中，添加入发酵液中，控制发酵液中亚油酸初始浓度诱导浓度为0.2g/L；剩余的亚油酸在发酵过程中再添加入发酵液中；用氢氧化钠来调节pH6.0，开始培养发酵；在开始培养发酵6h后把葡萄糖100g(首先配制成30％的溶液消毒)慢速加入发酵罐，在48h内加完；在接种子液培养发酵12h后，将剩余的溶解或包埋在环糊精中的亚油酸量，分三次间歇补加入发酵液中，48h内加完，发酵液中亚油酸的总加入量为8g/L；继续发酵，总时间为60h，整个发酵过程中长菌培养及诱导温度控制在30℃左右；发酵过程中采用氢氧化钠和盐酸调节pH，使发酵过程中的pH值维持在6.0～6.6之间。
(4)对菌泥进行收集和干燥。
菌泥收集和干燥：发酵结束，发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次(7000转/分，20min，4℃)，离心收集细胞，加保护剂(选择甘油，脱脂奶粉，海藻糖，甘露醇中的任意一种物质作为保护剂)，真空冷冻干燥，即得冻干制品—HyM土壤修复活性菌群。
冻干制品中活菌数所得菌粉活菌数可达2.1*1010个/g，菌体转化亚油酸生成共轭亚油酸的转化率可达19％。
实施例2：一种HyM土壤修复活性菌群的制备方法为：
(1)将菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养，得种子培养液；
(2)然后配制发酵培养基，并经灭菌后接种芽孢杆菌菌种和上述种子培养液，再用高速剪切机进行剪切，得到菌落；
所述的步骤（2）中的发酵培养基的配方为：酵母提取物15.0 g/L、蛋白胨30.0 g/L、氯化钠9.0 g/L、葡萄糖30.0 g/L、亚油酸30 g/L、微量元素1.5g/L、吐温80 5 g /L、腐殖酸10 g /L、低聚糖15 g /L、艾蒿8 g /L、葛根6 g /L、甘草10 g /L、红豆杉叶6 g /L、杜鹃5 g /L、紫苏4 g /L、腐殖酸10 g /L、中蜂蜜5 g /L、黄腐酸5 g /L、食盐10 g /L、胰蛋白胨6 g /L、牛肉膏6 g /L、酵素粉5 g /L、氨基酸12 g /L、意蜂蜜6 g /L、红豆根块6 g /L、其余为水。
(3) 然后对菌落进行太阳能、外加热源发酵，得到菌泥；
发酵工艺：按上述配方配制10L发酵液于发酵罐中，经灭菌后接种子培养液，菌种的接种量为培养基溶液的5％，即500mL，光密度(OD值)为1；将10L发酵培养基所需的亚油酸溶解或包埋在环糊精中，添加入发酵液中，控制发酵液中亚油酸初始浓度诱导浓度为0.2g/L；剩余的亚油酸在发酵过程中再添加入发酵液中；用氢氧化钠来调节pH6.0，开始培养发酵；在开始培养发酵6h后把葡萄糖100g(首先配制成30％的溶液消毒)慢速加入发酵罐，在48h内加完；在接种子液培养发酵12h后，将剩余的溶解或包埋在环糊精中的亚油酸量，分三次间歇补加入发酵液中，48h内加完，发酵液中亚油酸的总加入量为8g/L；继续发酵，总时间为60h，整个发酵过程中长菌培养及诱导温度控制在30℃左右；发酵过程中采用氢氧化钠和盐酸调节pH，使发酵过程中的pH值维持在6.0～6.6之间。
(4)对菌泥进行收集和干燥。
菌泥收集和干燥：发酵结束，发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次(7000转/分，20min，4℃)，离心收集细胞，加保护剂(选择甘油，脱脂奶粉，海藻糖，甘露醇中的任意一种物质作为保护剂)，真空冷冻干燥，即得冻干制品—HyM土壤修复活性菌群。
冻干制品中活菌数所得菌粉活菌数可达9.7*1010个/g。菌体转化亚油酸生成共轭亚油酸的转化率可达42.7％。
实施例3：一种HyM土壤修复活性菌群的制备方法为：
(1)将菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养，得种子培养液；
(2)然后配制发酵培养基，并经灭菌后接种芽孢杆菌菌种和上述种子培养液，再用高速剪切机进行剪切，得到菌落；
所述的步骤（2）中的发酵培养基的配方为：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、氯化钠8.7 g/L、葡萄糖25 g/L、亚油酸13 g/L、微量元素1g/L、吐温80 3 g /L、腐殖酸8 g /L、低聚糖7 g /L、艾蒿6 g /L、葛根4 g /L、甘草9 g /L、红豆杉叶5 g /L、杜鹃3 g /L、紫苏3g /L、腐殖酸7g /L、中蜂蜜4g /L、黄腐酸3 g /L、食盐8 g /L、胰蛋白胨4 g /L、牛肉膏5 g/L、酵素粉3 g /L、氨基酸10g /L、意蜂蜜5 g /L、红豆根块4 g /L、其余为水。
(3) 然后对菌落进行太阳能、外加热源发酵，得到菌泥；
发酵工艺：按上述配方配制10L发酵液于发酵罐中，经灭菌后接种子培养液，菌种的接种量为培养基溶液的5％，即500mL，光密度(OD值)为1；将10L发酵培养基所需的亚油酸溶解或包埋在环糊精中，添加入发酵液中，控制发酵液中亚油酸初始浓度诱导浓度为0.2g/L；剩余的亚油酸在发酵过程中再添加入发酵液中；用氢氧化钠来调节pH6.0，开始培养发酵；在开始培养发酵6h后把葡萄糖100g(首先配制成30％的溶液消毒)慢速加入发酵罐，在48h内加完；在接种子液培养发酵12h后，将剩余的溶解或包埋在环糊精中的亚油酸量，分三次间歇补加入发酵液中，48h内加完，发酵液中亚油酸的总加入量为8g/L；继续发酵，总时间为60h，整个发酵过程中长菌培养及诱导温度控制在30℃左右；发酵过程中采用氢氧化钠和盐酸调节pH，使发酵过程中的pH值维持在6.0～6.6之间。
(4)对菌泥进行收集和干燥。
菌泥收集和干燥：发酵结束，发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次(7000转/分，20min，4℃)，离心收集细胞，加保护剂(选择甘油，脱脂奶粉，海藻糖，甘露醇中的任意一种物质作为保护剂)，真空冷冻干燥，即得冻干制品—HyM土壤修复活性菌群。
冻干制品中活菌数所得菌粉活菌数可达5.7*1010个/g。菌体转化亚油酸生成共轭亚油酸的转化率可达24.1％。
试验例（根据实施例1制得的产品）：
1、试验目的
验证本发明对苹果所种植土壤的改善情况及生长发育的作用、增产效果进行比较，为此土壤修复活性菌群在市场上大力推广提供科学依据。
2、试验时间与地点
试验2012年2—8月份安排在杜康镇后洼村进行实施。
3、试验地概况
试验果园海拔858m，地势平坦，土壤类型为黄绵土，质地：壤土类，地力等级2级。面积8亩，品种：红富士，树龄15年，树势整齐一致，管理水平较高。试验处理前采集0 40cm土样，如表1：化验测得土壤基本养分状况如下：
4、试验设计与处理
4.1实验设计
试验设三个处理，采用随机排列，三次重复，每个处理5棵树。
4.2试验处理：
①施用含有此土壤修复活性菌群的肥料120公斤∕亩
②施用同类型普通肥料120公斤∕亩
③（CK）不施肥
5、试验实施及田间管理
5.1试验实施：
试验含有此土壤修复活性菌群的肥料，在苹果生长发育的幼果期、果实膨大期、着色期各喷施一次。
5.2田间管理：
试验果园2-8月份喷药防治病虫害6次，中耕除草4次，前期灌水2次。
6、2012年度气候特点与苹果生长发育
6.1降水：2012年在苹果生育期共降水570.5mm，较历年同期370.6mm多199.9mm，1-6月份降雨量较少，7、8、9三个月降水偏多。
6.2光照：2012年2-8月份光照时数1135小时，比历年同期1270.3小时，减少135小时。总之，苹果生育期降雨量偏多，温度适中，光照适宜，气候有利于苹果的生长发育和试验的植物靶向乳酸菌肥料效果的发挥。
7实验结果分析
7.1对产量的影响
从表3看：对照亩产量2447公斤，施用含有土壤修复活性菌群肥料的亩产量为2840.3公斤，较对照增产16.1％；施用同类型普通肥料产量为2625.3公斤，较对照增产7.2％.从表4、表5、表6看，不同处理均有增产效果，尤以含有土壤修复活性菌群肥料增产效果最佳。
7.2对果树生物学性状的影响
从表9看：苹果施用含有土壤修复活性菌群肥料后，百叶鲜重较对照增产12.3g，叶面积比对照增加4.27cm2 ，花芽形成数较对照增加13个。
7.3对苹果品质的影响
从表7看：苹果施用含有土壤修复活性菌群肥料后，苹果纵横较对照增加10×15，色度较对照增加20.4%，硬度较对照增加1.77%，糖度较对照增加1.3%，酸度较对照减少0.02%。从表8看，苹果单果重量较对照增加38.6g。
7.4对供试果园土壤基本养分状况的影响
从表1和表10看：供试果园施用含有土壤修复活性菌群肥料后腐殖酸增加0.2%，碱解氮增加0.2%，速效磷减少0.2%，速效钾减少0.1%。
8、结论和建议
8.1结论：苹果施用含有土壤修复活性菌群肥料后，从表2和表11可以看出土壤中的重金属含量在短期内降低，达到了快速修复土壤之目的，持续使用，效果更佳，并且养分释放与植物吸收同步，树势生长健壮，叶片深绿，抗逆性强，增产效果显著，专家审定为平衡营养具有体质增效的作用，为环境友好型产品。
8.2建议：本发明在苹果上试验效果证明，平衡营养效果明显，下年可扩大示范并且在不同领域推广应用。
Claims (1)
1.一种HyM土壤修复活性菌群的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为：
(1)将菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养，得种子培养液；
(2)然后配制发酵培养基，并经灭菌后接种芽孢杆菌菌种和上述种子培养液，再用高速剪切机进行剪切，得到菌落；
(3) 然后对菌落进行太阳能、外加热源发酵，得到菌泥；
(4)对菌泥进行收集和干燥；
所述的步骤（2）中的发酵培养基的配方为：酵母提取物5.0-15.0 g/L、蛋白胨10.0-30.0 g/L、氯化钠8.5-9.0 g/L、葡萄糖20.0-30.0 g/L、亚油酸8-30 g/L、微量元素1-1.5g/L、吐温80 1～5 g /L、腐殖酸5-10 g /L、低聚糖5-15 g /L、艾蒿2-8 g /L、葛根2-6 g /L、甘草2-10 g /L、红豆杉叶2-6 g /L、杜鹃2-5 g /L、紫苏2-4 g /L、腐殖酸3-10 g /L、中蜂蜜3-5 g /L、黄腐酸2-5 g /L、食盐2-10 g /L、胰蛋白胨2-6 g /L、牛肉膏2-6 g /L、酵素粉2-5 g /L、氨基酸2-12 g /L、意蜂蜜2-6 g /L、红豆根块2-6 g /L、其余为水；
所述的步骤(3)的工艺流程中：
a.接菌落微生物发酵液的种子液，接种量为发酵培养基溶液的体积比的5％～15％，种子液的光密度为1～3；
b.发酵过程中，长菌温度为28℃～30℃，时间为60h～66h；
c.采取慢速加糖方式，发酵液总体积10升，加糖量为100g-350g，且在接种后6h开始，在48h内加完；
d.上述发酵培养基中亚油酸不能直接加入，而经与分散剂混合后才能加入，且控制发酵液中亚油酸的浓度，采用缓慢加入的方式；
e.发酵过程中采用添加氢氧化钠和盐酸自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.0～6.6之间；
所述的步骤（4）菌泥收集和干燥：发酵结束，发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次，洗涤时的转速为7000转/分，时间为20min，温度为4℃，离心收集细胞，加保护剂，真空冷冻干燥，即得HyM土壤修复活性菌群；
所述的微量元素为无水醋酸钠或柠檬酸二铵；
所述的保护剂为甘油、脱脂奶粉、海藻糖或甘露醇；
所述的亚油酸的浓度为0.2 g/L；
所述的分散剂为环糊精。
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