CN106399150B - 防治十字花科作物根肿病的萎缩芽孢杆菌ba-7的发酵方法 - Google Patents

防治十字花科作物根肿病的萎缩芽孢杆菌ba-7的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了防治十字花科作物根肿病的萎缩芽孢杆菌BA‑7的发酵方法，其包括步骤：（1）将萎缩芽孢杆菌BA‑7在固体培养基培养之后，挑取单菌落，置于液体培养基中，于30‑32℃震荡培养10‑12小时，转速为200‑220 rpm，作为种子液；（2）接种后，发酵24‑48小时，罐温为28‑32℃，发酵罐搅拌速度为220‑250rpm；发酵罐中的培养基的成分按质量百分数计包括：豆粉4‑5%、蛋白胨0.1‑0.15%、葡萄糖0.5‑0.7%、淀粉2‑3%、硫酸锰0.1%、硫酸亚铁0.06%、磷酸氢二钾0.2%、碳酸钙0.1%、消泡剂0.01%、余量为水，pH=7.0‑7.4；所述萎缩芽孢杆菌的分类命名为Bacillus atrophaeus BA‑7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2015765。

Description

防治十字花科作物根肿病的萎缩芽孢杆菌BA-7的发酵方法
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及防治十字花科作物根肿病的萎缩芽孢杆菌BA-7的发酵方法。
背景技术
现有技术中，用于防治十字花科作物根肿病的生防菌株很少，主要集中在枯草芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌XF-1和枯草芽孢杆菌M3)和解淀粉芽孢杆菌(如解淀粉芽孢杆菌Bam22)，极大的限制了生防菌株在防治十字花科作物根肿病方面实际应用。重要的是，对于是否存在其它相应的生防菌种，研究者们还在努力的探索中。
本发明的发明人经过长时间的实验摸索工作，成功分离出了一株对十字花科作物(特别是油菜)具有十分优秀防治效果的萎缩芽孢杆菌BA-7。对其进行发酵方法的摸索，便于更好的对其进行实际应用。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种防治十字花科作物根肿病的萎缩芽孢杆菌BA-7的发酵方法，该发酵方法包括如下步骤：
(1)将萎缩芽孢杆菌BA-7在固体培养基培养之后，挑取单菌落，置于液体培养基中，于30-32℃震荡培养10-12小时，转速为200-220rpm，作为种子液；所述液体培养基的成分按质量百分数计包括：酵母提取物0.1-0.4％、牛肉浸膏0.1-0.3％、蛋白胨0.6-1.0％、NaCl 0.3-0.6％、余量为水，pH＝7.0-7.2；
(2)将步骤1)所得物置入发酵罐中进行发酵24-48小时，罐温为28-32℃，发酵罐搅拌速度为220-250rpm；发酵罐中的培养基的成分按质量百分数计包括：豆粉4-5％、蛋白胨0.1-0.15％、葡萄糖0.5-0.7％、淀粉2-3％、硫酸锰0.1％、硫酸亚铁0.06％、磷酸氢二钾0.2％、碳酸钙0.1％、消泡剂0.01％、余量为水，pH＝7.0-7.4；
所述萎缩芽孢杆菌的分类命名为Bacillus atrophaeus BA-7，于2015年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏号为CCTCC NO：M 2015765。
如本发明实施例所示，将本发明菌株培养24小时之后，1000倍的稀释液具有高达87.2％(5组平行实验平均值)的油菜根肿病防治效果。
实现上述效果的机制在于，本发明菌株本身对于病原菌具有很好的抑制和灭杀作用，使得油菜根肿病的发生率大为降低。另外，如实验例1所示，本发明菌株对于农地中的秸秆或其它作物废弃物具有很好的腐熟作用，施用本发明菌株培养稀释液后，可在常温下有效分解秸秆或其它作物废弃物，并将藏身其中的病原菌释放出来，通过病原菌和萎缩芽孢杆菌的直接接触进一步实现本发明菌株对土壤中病原菌的全面作用。同时，分解后的秸秆或其他作物废弃物还能为下一季作物的生长提供更多的有机质，促进农作物的健康生长。
一般而言，农作物秸秆的腐熟发酵多采用厌氧方式进行堆沤发酵，不仅费时费力，而且容易对周边环境造成污染。本发明菌株可在有氧 条件下，对秸秆进行腐熟，无需将收割后的秸秆进行集中收集和进行堆沤，仅需将本发明发酵菌液撒施入农田中，让菌液接触农作物秸秆便可实现对秸秆的腐熟及其后续利用。同时，当施用外源秸秆时，即使外源秸秆中带有病原菌，根据上述说明，可以理解，本发明同样能实现很好的防治效果。
因此，本领域人员不难理解，本发明菌株不仅具有很好的对病原菌的抑制杀灭作用，同时还可以在有氧条件下实现对秸秆的快速腐熟，使得下一季油菜大幅度免于病原菌的再次侵染并促进油菜的生长。
在上述基础下，本发明研究了利用本发明菌株对农地进行处理的方法，可以实现对十字花科作物农地进行处理以显著提高作物的防病效果。
值得指出的是，对于其它十字花科根肿病的防治效果也十分优秀。
现有技术中被公众熟知的生防菌株枯草芽孢杆菌XF-1的施用浓度十分高，且一旦施用浓度过低，其防治效果将大为降低，极大的限制了其实际应用。
其它常见的生防菌株也多为枯草芽孢杆菌。虽然本发明的发明人此前发现了一株对十字花科作物根肿病具有很好防治效果的解淀粉芽孢杆菌Bam22，拓宽了该领域十字花科生防菌株的菌种范围，然而在本饭前，现有技术还未出现可从萎缩芽孢杆菌中寻求高效防治十字花科作物根肿病的菌株的报道和相应的指示。
另外，本发明的发明人发现利用本发明的发酵方法利于菌的生长，可以很好的发挥出菌株的生防效果。
优选的，步骤(1)中，所述液体培养基的成分按质量百分数计为：酵母提取物0.13％、牛肉浸膏0.2％、蛋白胨0.8％、NaCl 0.5％、余量为水，pH＝7.0-7.2。
优选的，步骤(2)中，所述培养基的的成分按质量百分数计为：豆粉4.5％、蛋白胨0.12％、葡萄糖0.6％、淀粉2.5％、硫酸锰0.1％、硫酸亚铁0.06％、磷酸氢二钾0.2％、碳酸钙0.1％、消泡剂0.01％、余量为水，pH＝7.0-7.4。
优选的，步骤(2)中，所述罐温为30℃。
优选的，步骤(2)中，所述发酵时间为24小时。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
1、菌株的培养
(1)将萎缩芽孢杆菌BA-7在固体培养基培养之后，挑取单菌落，置于液体培养基中，于30-32℃震荡培12小时，转速为220rpm，作为种子液；所述液体培养基的成分按质量百分数计包括：酵母提取物0.3％、牛肉浸膏0.2％、蛋白胨0.8％、NaCl 0.3-0.6％、余量为水，pH＝7.0-7.2；
(2)将步骤(1)所得物置入发酵罐中进行发酵24小时，罐 温为30℃，发酵罐搅拌速度为250rpm；发酵罐中的培养基的成分按质量百分数计包括：豆粉4.5％、蛋白胨0.12％、葡萄糖0.6％、淀粉2.5％、硫酸锰0.1％、硫酸亚铁0.06％、磷酸氢二钾0.2％、碳酸钙0.1％、消泡剂0.01％、余量为水，pH＝7.0-7.4。
2、生防效果实验
将上述1部分所得培养物稀释1000倍，利用浇根法，移栽时对每株作物浇100ml，隔7天浇一次，隔14天再浇一次。注：未稀释菌液的菌浓约为6-8×109cfu/ml。受试作物为油菜、白菜和青花菜。各实验组设5个平行组，取平均值。
病情分级：
0级：根部无肿瘤，根系发育正常；
1级：1-30％的根着少许肿瘤，有小的结节状肿块，相互不连接；
2级：31-60％的根着生肿瘤，有大的结节状或球状肿块，相互连接；
3级：61-100％的根着生肿瘤，膨大到形成纺锤形瘤，大的瘤块一直延伸到下胚轴，植株矮小，停止生长。
病情指数＝[Σ(各级病株数×相对级数值)/最高级别×调查总株数]×100。
相对防效＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数。
实验结果如表1所示。
表1
注：清水对照的病情指数为62％。
实施例2
在菌株培养方面，除步骤(1)液体培养基的成分为酵母提取物0.1％、牛肉浸膏0.1％、蛋白胨0.6％、NaCl 0.6％、余量为水，pH＝7.0-7.2；发酵培养基的成分为豆粉4％、蛋白胨0.1％、葡萄糖0.5％、淀粉2％、硫酸锰0.1％、硫酸亚铁0.06％、磷酸氢二钾0.2％、碳酸钙0.1％、消泡剂0.01％、余量为水，pH＝7.0-7.4；发酵温度为28℃，时间为48小时；其余与实施例1一致。所得菌液浓度为4-5×109cfu/ml。
实施例3
在菌株培养方面，除步骤(1)液体培养基的成分为酵母提取物0.1-0.4％、牛肉浸膏0.3％、蛋白胨1.0％、NaCl 0.3％、余量为水，pH＝7.0-7.2；发酵培养基成分为豆粉5％、蛋白胨0.15％、葡萄糖0.7％、淀粉3％、硫酸锰0.1％、硫酸亚铁0.06％、磷酸氢二钾0.2％、碳酸钙0.1％、消泡剂0.01％、余量为水，pH＝7.0-7.4；发酵温度为32℃，发酵时间为36小时；其余与实施例1一致。所得菌液浓度为7-8×108cfu/ml。
实验例1
农田：油菜田；
在秸秆收割机上安装一排菌剂喷洒装置，用于在收割秸秆的同时将菌剂喷洒至农田。
收割粉碎农田中的秸秆，并向农田施用萎缩芽孢杆菌BA-7菌剂，施用量为20000亿个细菌/亩。所述菌剂为萎缩芽孢杆菌BA-7发酵液，菌浓为1×109cfu/ml。
处理45天之后，进行秸秆失重率(全称为秸秆生物量失重率)的检测，失重率为61.3％。

Claims (5)

1.防治十字花科作物根肿病的萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)BA-7的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括如下步骤：
(1)将萎缩芽孢杆菌BA-7在固体培养基培养之后，挑取单菌落，置于液体培养基中，于30-32℃震荡培养10-12小时，转速为200-220rpm，作为种子液；所述液体培养基的成分按质量百分数计包括：酵母提取物0.1-0.4％、牛肉浸膏0.1-0.3％、蛋白胨0.6-1.0％、NaCl0.3-0.6％、余量为水，pH＝7.0-7.2；
(2)将步骤1)所得物置入发酵罐中进行发酵24-48小时，罐温为28-32℃，发酵罐搅拌速度为220-250rpm；发酵罐中的培养基的成分按质量百分数计包括：豆粉4-5％、蛋白胨0.1-0.15％、葡萄糖0.5-0.7％、淀粉2-3％、硫酸锰0.1％、硫酸亚铁0.06％、磷酸氢二钾0.2％、碳酸钙0.1％、消泡剂0.01％、余量为水，pH＝7.0-7.4；
所述萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)BA-7，于2015年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2015765。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤(1)中，所述液体培养基的成分按质量百分数计为：酵母提取物0.3％、牛肉浸膏0.2％、蛋白胨0.8％、NaCl0.5％、余量为水，pH＝7.0-7.2。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养基的的成分按质量百分数计为：豆粉4.5％、蛋白胨0.12％、葡萄糖0.6％、淀粉2.5％、硫酸锰0.1％、硫酸亚铁0.06％、磷酸氢二钾0.2％、碳酸钙0.1％、消泡剂0.01％、余量为水，pH＝7.0-7.4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述罐温为30℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵时间为24小时。
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