CN111718870B - 具有降低蔬菜重金属含量、提高蔬菜质量的功能菌株及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有降低蔬菜重金属含量、提高蔬菜质量的功能菌种及应用，具体为菌株W7和W25，具有降低植物中重金属的含量，尤其是镉(Cd)的含量，促进植物生长，增加植物的Vc含量，增加植物可溶性蛋白的含量，增加土壤微生物丰度，增加土脲酶活性等多种功能，可广泛应用于土壤改良、农作物生物量提升、土壤重金属修复等领域。

Description

具有降低蔬菜重金属含量、提高蔬菜质量的功能菌株及应用
技术领域
本发明属于农业微生物应用技术领域，具体涉及具有降低蔬菜重金属含量、提高蔬菜质量的功能菌株及应用。
背景技术
镉(Cd)是最具毒性的重金属之一，对人体健康危害极大。化肥、农药的过度使用、污水灌溉和采矿活动引起的农田土壤镉污染已成为世界各国关注的问题。Cd污染是我国最严重的重金属污染，约占农田污染的7％。在轻度和中度镉污染土壤中生长的蔬菜、农作物、果树、牧草等植物通过食物链积累镉，对人畜健康造成危害。
原位固定Cd是减少Cd从土壤中转移，保证食品安全的有效措施。土壤重金属固定剂通过吸附、络合和沉淀作用，降低Cd的生物有效性，减少Cd从土壤向植物的转移。然而，持续添加这些有机、无机固定剂可能会对土壤性质、结构和生态系统产生有害影响。
中国专利文献CN110846250A(申请号：201911142617.6)公开了一株高产γ-PGA的枯草芽孢杆菌及其应用，公开了该枯草芽孢杆菌与生物炭结合，有效提高植物的生长性能，降低植物对土壤重金属Pb的吸收。
现有技术中关于应用微生物菌种用于重金属降解、促进植物生长的相关报道很多，但是大部分是多种微生物相结合，或者微生物与其它物质相结合，才可以起到多种功能的作用，但是就一株菌而言，对于农作物的种植以及土壤改良同时起到多种功能作用的相关报道极少，对于多功能微生物菌种的开发，也是目前农业微生物技术领域急需解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供两株具有降低蔬菜重金属含量、提高蔬菜质量的功能菌株及应用。
本发明涉及的菌种同时具有降低植物中重金属的含量，尤其是镉(Cd)的含量，促进植物生长，增加植物的Vc含量，增加植物可溶性蛋白的含量，增加土壤微生物丰度，增加土脲酶活性等多种功能；利用植物促生细菌来降低植物中重金属含量，改善土壤活性，降低重金属向植物中的转运，保障农产品安全，是一种安全、生态、经济、环保的有效方法。
一株芽孢杆菌W7，分类学命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年6月8日，菌种保藏号为CGMCC No.20043。
所述菌株W7的培养方法，包括如下步骤：
将菌株W7接种于固体培养基上，28-32℃培养2-3天，然后挑取菌落接种于液体培养基中， 35-37℃，150-200rpm培养16-20h，获得菌株W7发酵液；所述固体培养基为：蔗糖10.0g/L、 (NH4)2SO4 0.5g/L、Na2HPO4 2.0g/L、NaCl 0.1g/L、KCl 0.191g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、琼脂20g/L、余量水；所述液体培养基为：蔗糖10.0g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、Na2HPO42.0g/L、 NaCl 0.1g/L、KCl 0.191g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、余量水。
所述菌株W7用于生产生物制剂。
根据本发明优选的，所述生物制剂为液体制剂，含有所述菌株W7的有效活菌数为108个/毫升以上。
所述菌株W7用于农作物种植。
根据本发明优选的，所述菌株W7用于降低蔬菜中重金属镉的含量。
根据本发明优选的，所述菌株W7用于增加蔬菜中维生素C和可溶性蛋白的含量。
进一步优选的，所述蔬菜为生菜。
所述菌株用于土壤改良。
根据本发明优选的，所述菌株W7用于固定土壤中的重金属镉。
根据本发明优选的，所述菌株W7用于促进土壤让中微生物的增殖。
进一步优选的，所述菌株W7用于促进重金属镉污染的土壤中蛋白菌(Proteobacteria)、拟杆菌门(Firmicutes)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus) 之一或二者以上的增殖。
一种芽孢杆菌W25，分类学命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年6月8日，菌种保藏号为CGMCC No.20042。
所述菌株W25的培养方法，包括如下步骤：
将菌株W25接种于固体培养基上，28-32℃培养2-3天，然后挑取菌落接种于液体培养基中， 35-37℃，150-200rpm培养16-20h，获得菌株W7发酵液；所述固体培养基为：蔗糖10.0g/L、 (NH4)2SO4 0.5g/L、Na2HPO4 2.0g/L、NaCl 0.1g/L、KCl 0.191g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、琼脂20g/L、余量水；所述液体培养基为：蔗糖10.0g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、Na2HPO42.0g/L、 NaCl 0.1g/L、KCl 0.191g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、余量水。
所述菌株W25用于生产生物制剂。
根据本发明优选的，所述生物制剂为液体制剂，含有所述菌株W25的有效活菌数为108个/毫升以上。
所述菌株W25用于农作物种植。
根据本发明优选的，所述菌株W25用于降低蔬菜中重金属镉的含量。
根据本发明优选的，所述菌株W25用于增加蔬菜中维生素C和可溶性蛋白的含量。
进一步优选的，所述蔬菜为生菜。
所述菌株W25用于土壤改良。
根据本发明优选的，所述菌株W25用于固定土壤中的重金属镉。
根据本发明优选的，所述菌株W25用于促进土壤让中微生物的增殖。
进一步优选的，所述菌株W25用于促进重金属镉污染的土壤中蛋白菌(Proteobacteria)、拟杆菌门(Firmicutes)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus) 之一或二者以上的增殖。
本发明的有益效果
1、本发明提供了两株同时具有多种功能的菌株W7和W25。
2、本发明提供的菌种同时具有降低植物中重金属的含量，尤其是镉(Cd)的含量，促进植物生长，增加植物的Vc含量，增加植物可溶性蛋白的含量，增加土壤微生物丰度，增加土脲酶活性等多种功能。
3、本发明涉及的菌株能够产生γ-PGA。
附图说明
图1为实施例3盆栽实验中生菜食用组织和根部的Cd含量检测结果图；
图2为实施例4中的培养液不同培养时间对应的γ-PGA含量检测结果图；
图3为实施例4中初始Cd含量为3mg·L-1的培养液不同培养时间对应的Cd含量检测结果图；
图4为实施例4中初始Cd含量为6mg·L-1的培养液不同培养时间对应的Cd含量检测结果图；
图5为实施例4中的培养液不同培养时间对应的OD600检测结果图；
图6为实施例4中的培养液不同培养时间对应的pH检测结果图；
图7为实施例5中采集土壤的脲酶活性检测结果图；
图8为实施例5中采集土壤中蛋白菌(Proteobacteria)检测结果图；
图9为实施例5中采集土壤中拟杆菌门(Firmicutes)检测结果图；
图10为实施例5中采集土壤中鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)检测结果图；
图11为实施例5中采集土壤中芽孢杆菌属(Bacillus)检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述，但保护范围不限于此。
以下实施例中除特例说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。
生物样品保藏信息
一株芽孢杆菌W7，分类学命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年6月8日，菌种保藏号为CGMCC No.20043。
一种芽孢杆菌W25，分类学命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年6月8日，菌种保藏号为CGMCC No.20042。
实施例1
菌株W7和W25的筛选
从济南郊区Cd污染农田(土壤中Cd含量为1.35mg·kg-1)中生长的莴苣根际土壤中采集土壤样品。将10g样品悬浮于90ml无菌蒸馏水中，煮沸5min，稀释后的悬浮液涂在分离板上。分离培养基为：葡萄糖10g/L；酵母提取物5g/L、L-谷氨酸钠5g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、中性红0.06g/L、琼脂15g/L、余量水。将培养基的初始pH值调整为7.2±0.1。在37℃黑暗中孵育48h后，与染料(颜色由红色变为黄色)相互作用形成一个特定同心区的菌落被认为是γ-PGA产生菌，筛得产γ-PGA的菌株编号为W7和W25。
实施例2
菌株W7、W25分别活化和菌悬液制备
将菌株W7斜面菌种接种于固体培养基上，30℃培养3d。然后选取饱满、粘稠的W7菌落接种于液体培养基，37℃150rpm振荡培养20h。将发酵液转移至无菌离心瓶中，5000rpm离心5min收集菌体，用无菌去离子水洗涤，重新悬浮，使细胞数量达到5亿CFU/mL以上；所述固体培养基为：蔗糖10.0g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、Na2HPO4 2.0g/L、NaCl 0.1g/L、KCl0.191g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、琼脂20g/L、余量水；所述液体培养基为：蔗糖10.0g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、Na2HPO4 2.0g/L、NaCl 0.1g/L、KCl 0.191g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、余量水。
菌株W25的活化和菌悬液制备方法与菌株W7相同。
实施例3
菌株W7、W25分别应用于生菜种植
W7应用于生菜盆栽实验，按下述方法进行：每盆28厘米直径×35厘米高，含4.8公斤土壤，外加镉(CdCl2·2.5H2O)，至土壤中Cd含量的终浓度为0、0.5和1毫克/公斤，与土壤充分混合后平衡45天；每组处理3个重复。将采集的表面灭菌的生菜种子，每盆播种，发芽后疏苗成15株/盆；每个处理3盆平行；土壤定期灌溉以保持湿润，接种前，将实施例2制备的菌选用，用无菌去离子水稀释至1×108个/mL。以无菌去离子水为对照，在生菜第三叶期，在根部周围挖沟(1-2cm深)，在沟中加入菌悬液，加液量为90ml/盆；盆栽于温室(温度10-22℃，相对湿度30-45％，光照正常)中进行栽培，整个栽培周期为45天。
栽培结束后，采集每盆生菜的食用组织和根进行后续分析；用0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)和蒸馏水清洗生菜根和食用组织，并平均分成两份。其中一份在105℃失活30min，在65℃干燥至恒重，记录干燥后的重量；分别将干燥的食用组织和根磨碎并消化以测定Cd 含量。新鲜食用组织用标准方法测定维生素C(Vc)、可溶性蛋白质含量。
菌株W25的盆栽实验方法与菌株W7盆栽实验方法相同。
测定Cd含量的方法：参照高媛媛,彭兆丰,邱海鸥,顾延生和程伟.IPC-OES测定金矿尾矿区优势植物中的重金属元素[J].分析试验室,2016,35(5):521-525.公开的方法，准确称取0.1g植物样品进行微波消解，用5％HNO3定容，采用ICP-OES测定消解液中Cd含量。
测定维生素C的方法：参照赵晓梅,江英,吴玉鹏,刘宽和张志强.果疏中VC含量测定方法的研究[J].食品科学,2006,27(3):197-199.公开的方法测定蔬菜可食用组织维生素C的含量。
测定可溶性蛋白质含量的方法：参照赵英永,戴云,崔秀明,张文斌和马妮.考马斯亮蓝 G-250染色法测定草乌中可溶性蛋白质含量[J].云南民族大学学报:自然科学版,2006,15(3):235-237.公开的方法测定蔬菜可食用组织的可溶性蛋白含量。
实验结果见图1和表1：
表1
Figure RE-GDA0002642418940000051
由上述结果可以得出，菌株W7降低生菜可食用组织中Cd含量达17-33％、提高生菜可食用组织的生物量达41-47％、提高生菜可食用组织的Vc含量达29-40％、提高生菜可食用组织的可溶性蛋白含量达9-43％。
菌株W25降低生菜可食用组织中Cd含量达30-41％、提高生菜可食用组织的生物量达 61-85％、提高生菜可食用组织的Vc含量达38-73％、提高生菜可食用组织的可溶性蛋白含量达37-43％。
实施例4
菌株W7、W25分别接种土壤滤液中对水溶性Cd的作用以及γ-PGA的含量
将2.5kg土壤加入10L去离子水，150rpm振荡48h，5000rpm离心15min，收集上清液，通过微孔滤膜(0.45μm孔径)过滤，灭菌；然后与无菌基本发酵培养基按体积比4：1的比例混合均匀，制得无菌混合液，所述无菌基本发酵培养基各种组分的质量浓度为：3％葡萄糖、0.25％酵母抽提物、2％谷氨酸盐、0.05％磷酸二氢钾、0.05％K2HPO4、0.01％MgSO4·7H2O、余量水，pH7.2±0.1。向上述制备的无菌混合液中添加不同浓度的Cd2+(CdCl2·2.5H2O)，使无菌混合液中Cd2+的终浓度分别为0、3和6mg·L-1；取100mL所述混合液加入到三角瓶中，接种实施例2制备的菌悬液，接种量为1％(v:v)，每个浓度6个平行，以Cd2+终浓度为0的混合液作为对照。
在37℃下，以150转/分的速度培养；分别在0、24、48、72和96小时，测量培养液中的γ-PGA 含量、Cd含量、OD600值和pH值。
通过测量OD600监测细菌生长，并用pH计测定pH值，
γ-PGA含量的检测方法：参照Wei Zeng等(2013)的方法。(An integrated high-throughput strategy for rapid screening of poly(γ-glutamic acid)-producingbacteria.Appl Microbiol Biotechnol(2013)97:2163–2172)
Cd含量的检测方法：通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)(Optima2100DV， Perkin-Elmer)测定镉浓度；参照高媛媛,彭兆丰,邱海鸥,顾延生和程伟.IPC-OES测定金矿尾矿区优势植物中的重金属元素[J].分析试验室,2016,35(5):521-525.公开的方法。
菌株W25的检测方法与菌株W7的方法相同。
实验结果见图2、图3、图4、图5、图6所示。
由图2所示，不同培养时间，培养液中γ-PGA含量变化较大，菌株W7在相同培养时间，培养液中Cd含量越高，产生γ-PGA的量越多；菌株W25出现同样的现象；在相同培养时间，相同Cd含量培养液，菌株W25产生γ-PGA的量高于菌株W7。
由图3、图4可以看出，随着培养时间的延长，培养液中Cd含量下降显著，就图4中培养96小时的柱状图显示，菌株W7对应的培养液中Cd含量降低了50％；菌株W25对应的培养液中Cd含量降低了60％以上。
由图5可以看出，随着培养时间的延长，培养液中OD600值在不断增加，在培养24h时，各培养液的OD600值还有所不同，在培养48h时，各培养液的OD600值几乎相同，即菌体浓度基本相同，通过72h和96h时的OD600值可以看出，培养后期各培养液中的菌体浓度相差不大，基本相同。
由图6可以看出，随着培养时间的延长，培养液中pH在不断增加，在培养后期几乎不变。
实施例5
菌株W7、W25分别增加根际土壤酶活性的检测，以及增加根际土壤中蛋白菌(Proteobacteria)、拟杆菌门(Firmicutes)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)的相对丰度的检测
采集实施例3盆栽实验根系紧密结合的土壤(作为根际土壤)进行后续分析；测定采集土壤的脲酶活性(Soil Sci Ch.Acad，1980；S.Guan等，1986)。
用快速DNA提取试剂盒(MP Biomedicals，Santa Ana，CA)提取采集土壤样品的细菌基因组DNA，并在-20℃下保存，然后进行进一步分析；分别用分光光度计(NanoDrop1000，Thermo Scientific，USA)和凝胶电泳法测定提取DNA的数量和质量。提取的DNA经338F(5'-actcctagggggcagca-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')引物扩增，其靶向为细菌16s rRNA的V4区。高通量测序在Illumina Hiseq 2000(Illumina Inc.，美国，圣地亚哥)完成。
实验结果见图7、图8、图9、图10、图11所示。
由图7可以看出，菌株W7和W25对土壤的脲酶活性有一定的提高作用，在土壤含有Cd时，菌株W7和W25对土壤的脲酶活性提高作用增强。
由图8-11可以看出，菌株W7和W25对土壤中蛋白菌(Proteobacteria)、拟杆菌门(Firmicutes)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)的有一定的增殖作用，由图10可以看出，在土壤中Cd含量较高，菌株W7和W25对鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)的增殖效果更显著，菌株W25相对于W7，对鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)的增殖效果更优。
综上所示，本发明涉及的菌株W7和W25同时具有降低植物中重金属的含量，尤其是镉 (Cd)的含量，促进植物生长，增加植物的Vc含量，增加植物可溶性蛋白的含量，增加土壤微生物丰度，增加土脲酶活性等多种功能，可广泛应用于土壤改良、农作物生物量提升、土壤重金属修复等领域。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年6月8日，菌种保藏号为CGMCC No.20043。
2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W7的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W7接种于固体培养基上，28-32℃培养2-3天，然后挑取菌落接种于液体培养基中，35-37℃，150-200rpm培养16-20h，获得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W7发酵液；所述固体培养基为：蔗糖10.0g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、Na2HPO4 2.0g/L、NaCl 0.1g/L、KCl 0.191g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、琼脂20g/L、余量水；所述液体培养基为：蔗糖10.0g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、Na2HPO4 2.0g/L、NaCl 0.1g/L、KCl0.191g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、余量水。
3.权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W7在生产生物制剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物制剂为液体制剂，含有所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W7的有效活菌数为108个/毫升以上。
5.权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W7在降低农作物中重金属镉的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W7用于降低蔬菜中重金属镉的含量。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W7用于增加蔬菜中维生素C和可溶性蛋白的含量。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述蔬菜为生菜。
9.权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W7在固定土壤中重金属镉的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)W7用于促进重金属镉污染的土壤中蛋白菌(Proteobacteria)、拟杆菌门(Firmicutes)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)之一或二者以上的增殖。
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