CN112625967B - 一种可去除镉离子的菌株及其应用 - Google Patents

一种可去除镉离子的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可去除镉离子的菌株及其应用，属于生物工程技术领域。本发明从自然界中取样获得重金属耐受菌株，并采用24深孔板筛选的方法对其进行重金属吸附实验从而获得可以高效去除重金属离子镉离子的菌株，经鉴定，该菌株为乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61321；采用本发明提供的菌株在废水中吸附镉离子，吸附48h时，其去除率最高，可高达73.44％。

Description

一种可去除镉离子的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种可去除镉离子的菌株及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
随着我国工业化的快速发展，自然水体、土壤环境中的重金属污染日趋严重，重金属污染主要有铜、镉、铅、汞、六价铬等代表性重金属离子，通常来自电镀、塑料制造、采矿和冶金过程等。我国重金属污染存在量大、面广、难处理的现象，时刻危害着生态可持续发展，更对人们的健康构成重大威胁，因此，高效治理环境中重金属污染刻不容缓。
目前常用的去除重金属的方法，主要为化学法、物理法及微生物吸附技术。同传统的化学法、物理化学法相比，微生物吸附技术是近期研究的一类新型、高效的去除重金属的方法，具有费用低、能耗小、无二次污染的特点；但是目前，采用微生物吸附技术往往存在吸附效率低，吸附周期长的缺点，因而限制其应用。例如，Li D等(Adsorption of heavymetal tolerance strains to Pb2+and Cd2+in wastewater[J].Environmental Scienceand Pollution Research,2018,25(32):32156-32162)从重金属废料堆积区获得的土壤中筛选出对重金属Cd2+具有高耐受性的短杆菌，将该菌株制备成固定化微生物吸附剂，当其浓度为10g/L，溶液中的Cd2+初始浓度为33.42mg/L时，吸附在40min后达到平衡，但是，该菌株使用时需要的菌浓很高，并且其对Cd2+的最大吸附率仅为57.50％。
又如，Deng Y等(Screening and Identifying a Cadmium-resistant Fungusand Characterizing its Cadmium Adsorption[J].Polish Journal of EnvironmentalStudies,2017,26(3):1011-1021)从镉污染的水稻土中分离出的抗镉真菌菌株(CN35)当其添加0.5g的湿菌丝(新鲜菌丝的水分为83％)，培养基溶液当中镉离子的浓度为100mg/L时，该菌株CN 35对Cd的吸附率为35％左右，但其吸附周期为7天，周期太长。
综上，现有技术当中公开的菌株对于溶液当中镉离子的吸附能力不高，或者吸附周期太长，均不利于在工业当中大规模的应用，因此，如何得到一株对镉离子吸附能力强且吸附周期短的菌株，成为亟待解决的问题。
发明内容
技术问题：
为了解决现有技术当中的菌株对废液中镉离子吸附能力差，吸附周期长的技术问题。
技术方案：
本发明提供了一株重金属高效去除的菌株，一株乙酰微小杆菌(Exiguobacteriumacetylicum)，所述乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61321，保藏日期为2020年11月27日。
本发明的乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)来源于江苏省无锡市芦村污水处理厂三期生化处理厌氧池获取污泥样品，使用细菌通用引物27F和1492R对筛选出的耐镉菌株进行菌落PCR，将得到的PCR产物送上海Songon公司测序之后，使用BLAST在NCBI上进行16S rRNA序列比对，同源度为97％，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将该菌种经鉴定为乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum，已保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61321，命名为Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1。
所述乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1在LB培养基中生长，其菌落特征为：菌落直径为2.0-3.5mm，光滑，圆形，黄白(如图3所示)。
本发明还提供了一种微生物菌剂，所述菌剂中含有上述乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中乙酰微小杆菌Exiguobacteriumacetylicum LBBE-U1的OD600值至少为0.5。
本发明还提供了上述乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1，或上述菌剂在去除废液中重金属离子中的应用。
在本发明的一种实施方式中，将上述乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicumLBBE-U1，或上述菌剂添加至含有重金属离子的废液中进行反应。
在本发明的一种实施方式中，所述重金属离子为镉离子。
本发明还提供了一种去除废液中镉离子的方法，所述方法为，将上述乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1，或上述菌剂添加至含有镉离子的废液中，进行反应。
在本发明的一种实施方式中，向废液中所添加的乙酰微小杆菌Exiguobacteriumacetylicum LBBE-U1的OD600值至少为0.5。
在本发明的一种实施方式中，所述反应为，在25～30℃，180～220rpm条件下反应0.5h～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述反应为，在30℃、220rpm条件下反应48h。
在本发明的一种实施方式中，所述废液中镉离子浓度至少为5mg/L。
在本发明的一种实施方式中，所述废液为矿冶、机械制造、化工、电子、仪表工业的生产过程中的产生重金属废水。
本发明还提供了上述乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1在制备去除废液中镉离子的产品中的应用。
有益效果
本发明通过建立一种新型的利用显色法检测重金属离子含量以及利用24深孔板筛选的方法，筛选得到了一株可高效去除镉离子的菌株，经鉴定，该菌株为乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum，并在模拟废水样中得到应用，具有显著镉离子去除效果；采用本发明提供的菌株在废水中吸附镉离子，吸附48h时，其去除率最高，可高达73.44％；同时，本发明提供的乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1可在废水环境中稳定的生长，因此，该菌株在工业上具有广泛的应用前景。
生物材料保藏
一株乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1，分类学命名为Exiguobacterium acetylicum，已于2020年11月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61321，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
附图说明
图1：显色法检测镉离子浓度标准曲线。
图2：不同菌株对不同浓度镉离子的去除效率。
图3：菌株形态图。
图4：菌株在含不同浓度镉离子模拟废水中去除效率。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中所涉及的溶液配制方法如下：
掩蔽剂溶液：分别配制质量分数为1％的氟化钠溶液、硫脲溶液以及柠檬酸三钠溶液，等体积混合均匀。
下述实施例中所涉及的标准曲线的绘制方法如下：
(1)取50μL镉离子标准液(浓度为1，2，4，6，10，12mg/L)；
(2)依次加入1.0mol/L硫酸溶液20μL，掩蔽剂溶液20μL，20％碘化钾-抗坏血酸溶液30μL和0.5％聚乙烯醇溶液20μL，显色剂0.5％罗丹明B溶液18μL，用去离子水稀释至250μL，摇匀；
(3)将步骤(2)得到的溶液显色40min后，利用酶标仪在600nm波长处测定吸光度。
(4)测定结果如图1所示，以镉离子浓度为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制标准曲线，获得计算公式为y＝0.0525x+0.0938，R2为0.9948，镉离子检测浓度范围为0～20mg/L。该方式能够作为高通量筛选方式使用。
下述实施例中所涉及的镉离子含量的检测方法如下：
具体步骤如下：
(1)取50μL镉离子样品待测液；
(2)依次加入1.0mol/L硫酸溶液20μL，掩蔽剂溶液20μL，20％碘化钾-抗坏血酸溶液30μL和0.5％聚乙烯醇溶液20μL，显色剂0.5％罗丹明B溶液18μL，用去离子水稀释至250μL，摇匀；
(3)将步骤(2)得到的溶液显色40min后，利用酶标仪在600nm波长处测定吸光度。
下述实施例中所涉及的菌株对于镉离子的去除率的计算方法如下：
(1)根据样品待测液得到的吸光度值代入标准曲线公式y＝0.0525x+0.0938计算得到镉离子浓度；
(2)利用如下公式计算菌株对于镉离子的去除率。
Figure BDA0002877952500000041
其中，A为镉离子去除率；X1为实验组对应的隔离子浓度；X2为空白对应的隔离子浓度。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
添加有镉离子的LB平板：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g/L、酵母粉(Oxoid)5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉20g/L、2mmol/L硝酸镉。
LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g/L、酵母粉(Oxoid)5g/L、氯化钠10g/L。
LB平板：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g/L、酵母粉(Oxoid)5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉20g/L。
实施例1：乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1菌株分离、筛选、鉴定
1、菌株的分离
具体步骤如下：
(1)从江苏省无锡市芦村污水处理厂三期生化处理好的厌氧池获取污泥样品，装在50mL离心管中置于4℃冰箱保存；
(2)将样品去除杂质后，吸取10mL加入已装有90mL无菌水的250mL摇瓶中，于30℃，220r/min条件下摇床振荡1h得到样品悬浊液；
(3)将样品悬浊液静置5min，取上清进行梯度稀释，稀释倍数为10-1、10-2、10-3；
(4)取100μL各梯度稀释液分别涂布于添加有镉离子的LB平板，每个梯度两个平行，置于30℃恒温培养箱中培养48h；
(5)挑取菌落划线分离两次之后得到单菌落，用于后期的筛选。
2、菌株的筛选
具体步骤如下：
(1)将步骤1中得到的不同单菌落菌株在30℃，220r/min条件下摇床培养得到培养液，将得到的培养液在4000rpm条件下离心10min后，向去除上清的样品中，分别加入生理盐水稀释至菌株的OD600为4，制备得到菌悬液；
(2)向24孔深孔板中分别加入1.4mL步骤(1)得到的菌悬液，空白对照加入1.4mL生理盐水，在A、B、C行分别加入终浓度为100mg/L，80mg/L，60mg/L的镉离子溶液，在30℃，700r/min条件下于深孔摇床中震荡反应24h后，在4000rpm条件下离心10min后取上清液，并采用如前所述检测镉离子含量的方法对上清液进行显色反应；显色40min，利用酶标仪测定其中剩余镉离子含量。
结果如图2所示，根据菌株对于重金属离子的吸附率即得到镉离子高效去除菌株。
由图2可知，筛选得到的四株菌株，分别命名为菌株A、菌株B、菌株C、菌株D，其在镉离子浓度为60mg/L时对于镉离子的去除率分别为56.92％、73.88％、65.31％、54.42％，可见菌株B可显著吸附水溶液中的镉离子，因此采用菌株B做下一步的菌株的鉴定。
3、菌株的鉴定
具体步骤如下：
(1)对步骤2中得到的菌株B使用通用细菌引物27F和1492R扩增菌株16SrRNA基因。其中通用细菌引物27F序列为5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，通用细菌引物1492R序列为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
(2)使用30μL反应混合物进行PCR，选择Taq DNA Polymerase(Takara公司)酶进行，PCR条件为预变性95℃，3min；扩增阶段34个循环，按照95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min，40s进行，得到PCR产物。
(3)将步骤(2)得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析并送上海Songon公司进行测序。
(4)使用BLAST在NCBI数据库中将序列与先前发布的细菌16S rRNA序列比对，同源度为97％，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述菌株B在LB固体培养基中，其菌落特征为：菌落直径为2.0-3.5mm，光滑，圆形，黄白，如图3所示。
(5)经鉴定，菌株B为Exiguobacterium acetylicum，属于微小杆菌属，并被保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61321，将其命名为乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1。
实施例2：乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1菌株在去除废液中的镉离子中的应用
具体步骤如下：
1、乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1菌悬液的制备
(1)挑取乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1单菌落接种至添加有10mL LB液体培养基的50mL离心管中，培养10～12h，得到种子液；
(2)测定步骤(1)得到的种子液的OD600值，并通过生理盐水将种子液的浓度调整为OD600值为4，得到菌悬液。
2、将步骤1得到的乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1菌悬液按照终浓度OD600值为0.5的添加量，分别添加至含有10mg/L、5mg/L镉离子的20mL模拟废水液当中，其中，含镉离子的模拟废水液成分如下：230mg/L葡萄糖，60mg/L蛋白胨，20mg/L牛肉膏，40mg/L无水乙酸钠，198mg/L碳酸氢钠，12mg/L磷酸二氢钾，170mg/L碳酸氢铵，2.4mg/L六水合氯化镁，1.2mg/L无水氯化钙，1mg/L六水合氯化铁，并添加镉离子至相应浓度。
分别将上述含有10mg/L、5mg/L镉离子的反应体系于30℃、220rpm条件下反应，并测定反应24h、48h之后上清中镉离子含量；结果如图4所示，经检测，采用本发明提供的菌株在反应48h时，乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1平均每OD去除率可以高达73.44％。
实施例3：乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1菌株的性质
本发明的乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1菌株能够适应工业废水的环境，以模拟废水样为例，测定菌株在废水环境中的致死率。
具体步骤如下：
(1)在实施例2的步骤1得到的乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1菌悬液的基础上，通过生理盐水将菌悬液调整为OD600值为0.5。
(2)将步骤(1)得到的菌悬液稀释到10-6、10-7、10-8三个梯度，每个梯度两个平行，分别吸取100μL涂布LB平板，菌落数为7.52×109cfu/mL。
(3)将实施例2中在模拟废水样中反应24h、48h之后的反应液分别按梯度稀释到10-6、10-7、10-8三个梯度，每个梯度两个平行，分别吸取100μL涂布LB平板。
(4)分别计算乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1菌株在含有不同浓度镉离子的废水样中，分别反应24h、48h后各自对应的菌落数，并计算致死率，结果如表1所示。
表1不同浓度镉离子的废水样中菌株的致死率
Figure BDA0002877952500000071
由表1可以看出，该乙酰微小杆菌Exiguobacterium acetylicum LBBE-U1菌株可以在模拟废水样中较稳定存在，证明其可以广泛的应用于在废水环境中吸附去除重金属镉离子。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种可去除镉离子的菌株及其应用
<130> BAA201606A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 677
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acccccttaa agtaatggct ggctccttgc ggttacctca ccggcttcgg gtgttgcaaa 60
ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa gacccgggaa cgtattcacc gcagtatgct 120
gacctgcgat tactagcgat tccgacttca tgcaggcgag ttgcagcctg caatccgaac 180
tgggaacggc tttatgggat tggctccacc tcgcggtctc gctgcccttt gtaccgtcca 240
ttgtagcacg tgtgtagccc aactcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct 300
tcctccggtt tgtcaccggc agtctcccta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaagg 360
ataggggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa 420
ccatgcacca cctgtcacca ttgtccccga agggaaaact tgatctctca agcggtcaat 480
gggatgtcaa gagttggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc 540
gcttgtgcgg gtccccgtca attcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctcccccagg 600
cggagtgctt aatgcgttag cttcagcact gaggggcgga aaaccccccc aacacctagc 660
actcatagtt ttacggc 677

Claims (10)

1.一株乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)，其特征在于，所述乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：61321，保藏日期为2020年11月27日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的乙酰微小杆菌。
3.权利要求1所述的乙酰微小杆菌或权利要求2所述的菌剂在去除废液中重金属镉离子中的应用。
4.一种去除废液中镉离子的方法，其特征在于，将权利要求1所述的乙酰微小杆菌或权利要求2所述的菌剂添加至含有镉离子的废液中，进行反应。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，向废液中添加的乙酰微小杆菌的OD600值至少为0.5。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述反应为，在25～30℃，180～220rpm条件下反应0.5h～48h。
7.如权利要求4～6任一所述的方法，其特征在于，所述反应为，在30℃，220rpm条件下反应48h。
8.如权利要求4～7任一所述的方法，其特征在于，所述废液中镉离子浓度至少为5mg/L。
9.如权利要求4～8任一所述的方法，其特征在于，所述废液为矿冶、机械制造、化工、电子、仪表工业的生产过程中的产生重金属废水。
10.权利要求1所述的乙酰微小杆菌在制备去除废液中镉离子的产品中的应用。
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